濾泡輔助性T細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的變化

王元元陸楊唐潔查成柴繼俠賀文欣胡小冬謝長好

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·論著·

濾泡輔助性T細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的變化

王元元1陸楊2唐潔3查成3柴繼俠1賀文欣1胡小冬1謝長好2

【摘要】目的 檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh）的表達(dá)變化，探討Tfh細(xì)胞在SLE發(fā)病中的意義。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測32例SLE患者和28例健康對照者外周血Tfh細(xì)胞的表達(dá)水平，以及CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞的表達(dá)水平。結(jié)果 SLE患者組外周血Tfh細(xì)胞百分率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD3+T細(xì)胞百分率、CD3+CD4+T細(xì)胞百分率及CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞百分率與健康對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。結(jié)論 SLE患者外周血Tfh細(xì)胞的表達(dá)水平明顯升高，可能在其發(fā)病過程中起一定作用。

【關(guān)鍵詞】系統(tǒng)性紅斑狼瘡；濾泡輔助性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一個慢性全身性自身免疫性結(jié)締組織病，它以多克隆B細(xì)胞高度活化增殖、免疫球蛋白增多和多種自身抗體的生成為特征，發(fā)病機(jī)制尚不明確。隨著Tfh細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)及對B細(xì)胞分化、成熟和抗體分泌功能的不斷認(rèn)識［1］，Tfh細(xì)胞在SLE發(fā)生發(fā)展中的重要作用日益顯現(xiàn)。Tfh細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6［2］，標(biāo)志性表達(dá)CXCR5，可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激因子（inducible T cell costimulator，ICOS）、程序性死亡分子1（programmed death1，PD-1）等表面分子［3］。PD-1調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞的存活和選擇，是漿細(xì)胞形成的必要因素［4］，因此以CD3+CD4+CXCR5+PD-1+定義Tfh細(xì)胞。筆者運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測SLE患者外周血Tfh細(xì)胞水平，以探討Tfh細(xì)胞對SLE發(fā)病機(jī)制的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

32例SLE患者來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2016 年3月～2016年5月住院患者，其中男1例，女31例，平均年齡（40.50±12.16）歲，臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會（ARA）1997年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)。所有患者無風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性脊柱炎等其他的自身免疫性疾病。健康對照組28例，均為健康志愿者，男4例，女24例，平均年齡（37.86±7.80）歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.470，P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器

FITC標(biāo)記的抗PD-1單克隆抗體及其同型對照抗體，PE標(biāo)記的抗CXCR5單克隆抗體及其同型對照抗體，PerCP標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體均為美國eBioscience公司產(chǎn)品；APC標(biāo)記的抗CD3單克隆抗體，為美國Biolegend公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為FACSVerse，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 直接免疫熒光標(biāo)記 采集受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，血標(biāo)本在6 h內(nèi)上流式機(jī)檢測。取流式試管8支，試管1中未加入抗體，為調(diào)節(jié)各熒光通道的電壓用；試管2、3、4、5為調(diào)熒光通道補(bǔ)償用；試管6為同型對照用，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、MouseIgG2b-PE，試管7為同型對照用，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、MouseIgG1-FITC，試管8為測試管，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、PD-1-FITC。血標(biāo)本50 μl分別加入到上述8支流式管中，與熒光抗體充分混勻，室溫避光放置15 min；加入溶血劑1 ml/管，充分震蕩混勻，室溫避光放置10 min，使紅細(xì)胞充分裂解；離心1 500 r/min×5 min，倒上清液；加入染色緩沖液（SB）1 ml/管，洗滌，再次離心，1 500 r/min×5 min，倒上清液；最后加入1%多聚甲醛（PFA）固定液300 μl/管，流式機(jī)檢測。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測 運(yùn)用FACSVerse流式細(xì)胞儀，設(shè)置相應(yīng)各通道電壓和通道之間熒光補(bǔ)償后，經(jīng)FSC、SSC設(shè)定淋巴細(xì)胞群為P1門，以CD3定義T細(xì)胞；CD3、CD4定義CD4+T細(xì)胞；CD3、CD4、CXCR5、PD-1定義Tfh細(xì)胞。測定CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分率、CD4+T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞百分率、CD4+CXCR5+T細(xì)胞占CD4+T百分率和Tfh細(xì)胞占CD4+T百分率，見圖1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計描述和分析，結(jié)果以（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，CD4+CXCR5+T細(xì)胞，Tfh細(xì)胞的測定

2 結(jié)果

SLE患 者 外 周 血CD3+T細(xì) 胞、CD4+T細(xì) 胞、CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的表達(dá)：SLE患者組和健康對照組外周血CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分率，CD4+T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分率，CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率，Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率見下表。SLE患者組Tfh細(xì)胞表達(dá)高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，見表1）。

表1 SLE患者組及健康對照組外周血CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞及Tfh細(xì)胞的表達(dá)（%）

3 討論

SLE的發(fā)病機(jī)制尚不明確，以多克隆B細(xì)胞高度增殖活化、免疫球蛋白增多和多種自身抗體的生成為特征，而近年來發(fā)現(xiàn)的Tfh細(xì)胞則在B細(xì)胞增殖分化、刺激免疫球蛋白分泌中發(fā)揮重要作用。其表面表達(dá)趨化因子受體CXCR5和轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6以及ICOS、PD-1等表面分子，分泌IL-21、IL-17等細(xì)胞因子。

本研究中，SLE患者組外周血CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分率、CD4+T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞百分率與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率與健康對照組之間雖無明顯差異，但其中表達(dá)PD-1的這群CD3+CD4+CXCR5+T細(xì)胞亞群，即Tfh細(xì)胞，它的表達(dá)卻高于健康對照組，這提示Tfh細(xì)胞的高表達(dá)可能與SLE的發(fā)生有關(guān)。

B細(xì)胞分化、增殖、突變，高親和力B細(xì)胞出現(xiàn)及長效記憶性B細(xì)胞出現(xiàn)和漿細(xì)胞分化都需要在淋巴濾泡生發(fā)中心中完成。淋巴濾泡生發(fā)中心形成、抗原特異性記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞的產(chǎn)生都必須CD4+T細(xì)胞的參與［5］。CD4+T細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子、微環(huán)境的影響下分化為不同的CD4+T細(xì)胞亞類，這些效應(yīng)細(xì)胞亞類有不同的作用，其中Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞介導(dǎo)抗細(xì)胞外寄生蟲免疫，Th17細(xì)胞介導(dǎo)皮膚黏膜免疫和抗微生物感染免疫，而Tfh細(xì)胞則在生發(fā)中心與B細(xì)胞相互作用，輔助B細(xì)胞活化或分化，并幫助產(chǎn)生長效抗體反應(yīng)［6-7］。若Tfh細(xì)胞升高則產(chǎn)生大量Ig［8］。MRL/lpr狼瘡鼠缺乏生發(fā)中心，但是在濾泡外有Tfh樣細(xì)胞，此類細(xì)胞可以輔助B細(xì)胞發(fā)生免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌免疫球蛋白［9］。在獲得性系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中，Tfh細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白-Roquin蛋白突變?nèi)笔?，?dǎo)致Tfh數(shù)量增高，最終導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生［10］。Rui YX等［11］研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞作用后，PD-1在Tfh細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)。Tfh表達(dá)的CXCR5和配體CXCL15結(jié)合，引導(dǎo)Tfh細(xì)胞進(jìn)入B細(xì)胞濾泡，形成生發(fā)中心［12］，生發(fā)中心B細(xì)胞在其協(xié)助下分化為記憶型B細(xì)胞和漿細(xì)胞，在記憶型B細(xì)胞和漿細(xì)胞的表面均可檢測到PD-1的表達(dá)［13］。以上實驗結(jié)果初步證明了SLE患者存在功能異常表達(dá)的Tfh細(xì)胞，與SLE的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，Tfh細(xì)胞可能參與SLE的發(fā)病過程，但其在SLE發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需對其進(jìn)一步研究。

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【中圖分類號】R593

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）15-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.024

基金項目：安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究一般項目（KJ2015B009by） 安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重點項目（KJ2016A475） 安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究一般項目（KJ2013B139）

作者單位：1 安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，安徽 蚌埠233030；2 安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽 蚌埠233004；3 安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心，安徽 蚌埠 233030

通訊作者：謝長好，E-mail：uglboy2002@126.com

The Increace of Tfh Cells From the Peripheral Blood of Patients With Systemic Lupus Erythematosus

WANG Yuanyuan1LU Yang2TANG Jie3ZHA Cheng3CHAI Jixia1HE Wenxin1HU Xiaodong1XIE Changhao2
1 Department of Histology and Embryology， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China， 2 Department of Rheumatology and Immunology， The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233004， China， 3 Research Center， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China

［Abstract］Objective To detect expression of Tfh cells from the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus （SLE） and discuss Tfh significance in SLE pathogenesis. Methods The expression of Tfh cells，CD3+T， CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T was examined in 32 SLE patients and 28 healthy controls （HC） by flow cytometry. Results The Proportions of Tfh cells were significantly increased in SLE patients as compared with HC （P＜0.05）. The number of CD3+T， CD3+CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T were pointless in SLE patients compared with HC （P＞0.05）. Conclusion The aberrations of Tfh cells were observed in patients with SLE. Tfh cells may play a role in the pathogenesisof SLE.

［Key words］Systemic lupus erythematosus， Tfh， Flow cytometry