輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，陳紅英，李鮮麗，陳 曉，蘭 青，張茹薏

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·論著·

輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，陳紅英，李鮮麗，陳 曉，蘭 青，張茹薏

650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科(劉懷鄂，游晶，陳紅英，李鮮麗，蘭青，張茹薏)，腫瘤治療中心(陳曉)

【摘要】目的探討輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)平衡在乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的作用。方法選取2011年1月—2015年6月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的HBV感染者111例，并依據(jù)《實(shí)用傳染病學(xué)》中乙型肝炎輕、中、重度的診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為A組23例(無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者)、B組42例(輕中度慢性乙型肝炎患者)、C組18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D組28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期選取本院體檢中心體檢健康者11例作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)測(cè)定HBV-DNA載量，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中Th17、Treg表達(dá)率，計(jì)算Th17/Treg比值。結(jié)果A、B、C、D組HBV-DNA載量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組受試者Treg表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值及B組Th17/Treg比值均低于對(duì)照組(P<0.05)；B、C、D組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值均高于A組(P<0.05)；C組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值均高于B組(P<0.05)。HBV感染者Th17表達(dá)率為2.7%(3.2%)，Treg表達(dá)率為1.0%(1.2%)，HBV-DNA載量為66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表達(dá)率與Treg表達(dá)率呈正相關(guān)(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA載量與Th17表達(dá)率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表達(dá)率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。結(jié)論慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，且Th17/Treg比值較單一的Th17、Treg表達(dá)率可能更能準(zhǔn)確地反映HBV感染相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展程度。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；乙型肝炎，慢性；T淋巴細(xì)胞，輔助；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性

劉懷鄂，游晶，陳紅英，等.輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的作用研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(18)：2121-2125.[www.chinagp.net]

Liu HE，You J，Chen HY，et al.Influence of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus related liver disease[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2121-2125.

乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性化和肝炎進(jìn)展所導(dǎo)致的包括肝炎活動(dòng)期、肝臟衰竭、肝硬化甚至肝癌的發(fā)生是困擾眾多HBV感染者及臨床醫(yī)生的主要問(wèn)題[1]。有臨床研究顯示，HBV感染者的臨床結(jié)局與其機(jī)體免疫機(jī)制密切相關(guān)，尤其是T淋巴細(xì)胞，例如早期Th1/Th2細(xì)胞失衡學(xué)說(shuō)[2]。但隨著具有促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)的輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)和具有抑制肝臟炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)被人們所認(rèn)識(shí)，Th17與Treg在HBV感染的慢性化和肝炎進(jìn)展過(guò)程中的作用逐漸受到臨床醫(yī)生的關(guān)注。而Th17與Treg在HBV感染過(guò)程中的作用如何，尤其是Th17/Treg細(xì)胞平衡在HBV感染中的意義逐漸成為HBV感染慢性化和肝炎進(jìn)展機(jī)制研究中的重點(diǎn)內(nèi)容。本研究通過(guò)比較HBV感染導(dǎo)致的不同程度肝臟疾病患者及健康對(duì)照者外周血中Th17、Treg表達(dá)率及Th17/Treg比值的變化情況，以了解Th17/Treg平衡在HBV感染相關(guān)肝臟疾病中的作用。

1對(duì)象與方法

1.1納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)未經(jīng)抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并甲、丙、丁、戊型肝炎及免疫缺陷性疾?。?2)伴有肝癌、自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精肝；(3)有吸毒史及毒物接觸史。

1.2研究對(duì)象選取2011年1月—2015年6月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的HBV感染者111例，并依據(jù)《實(shí)用傳染病學(xué)》[4]中乙型肝炎輕、中、重度的診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為A組23例(無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者)、B組42例(輕中度慢性乙型肝炎患者)、C組18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D組28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期選取本院體檢中心體檢健康者11例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

本研究背景及創(chuàng)新點(diǎn)：

輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)在乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)肝臟疾病中的作用越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注,但究竟Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的作用如何，目前尚不清楚。本研究通過(guò)比較健康人群、不同疾病進(jìn)展程度的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17、Treg表達(dá)率及Th17/Treg比值的差異和一系列相關(guān)性分析，證實(shí)了慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，Th17/Treg比值較單純的Th17、Treg表達(dá)率能夠更為準(zhǔn)確地反映HBV感染相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展程度。

1.3方法

1.3.1一般資料記錄受試者的性別、年齡、乙型肝炎家族史、HBV-DNA載量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)；采用全自動(dòng)生化分析儀奧林巴斯AU-5400及配套試劑檢測(cè)ALT水平，參考范圍0～40 U/L；按照上?？迫A生物工程股份有限公司HBV-DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取所有受試者DNA，裂解擴(kuò)增后在實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)中測(cè)定HBV-DNA載量。

1.3.2Th17、Treg表達(dá)率檢測(cè)采集受試者清晨空腹靜脈血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)備用。每1×106個(gè)細(xì)胞加入佛波酯(PMA，SIGMA公司)50 ng/ml、離子霉素(Ion，SIGMA公司)1 μg/ml，并在含高爾基蛋白轉(zhuǎn)換抑制劑的1640培養(yǎng)基中刺激5 h。以250×g離心5 min后，將重懸的細(xì)胞按流式細(xì)胞儀檢測(cè)試劑盒(BD公司)要求進(jìn)行固定、染色、透化處理〔Th17采用白介素17(IL-17)細(xì)胞內(nèi)染色，Treg細(xì)胞采用叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)細(xì)胞內(nèi)染色〕，標(biāo)記后的細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并采用Diva軟件分析Th17、Treg表達(dá)率，計(jì)算Th17/Treg比值。

2結(jié)果

2.15組受試者一般資料比較5組受試者性別、乙型肝炎家族史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A、B、C、D組HBV-DNA載量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5組受試者年齡、ALT水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組年齡高于對(duì)照組及A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C、D組ALT水平均高于對(duì)照組和A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組ALT水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組ALT水平低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1　5組受試者一般資料比較

注：-表示無(wú)此項(xiàng)；HBV=乙型肝炎病毒，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05；與C組比較，dP<0.05；e為χ2值，f為F值，余為H值

2.25組受試者Th17、Treg表達(dá)率及Th17/Treg比值比較5組受試者Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5組受試者Treg表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值及B組Th17/Treg比值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C、D組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組Th17表達(dá)率、Th17/Treg比值均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表25組受試者Th17、Treg表達(dá)率及Th17/Treg比值比較〔M(QR)〕

Table 2Comparison of the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg among the five groups

組別例數(shù)Th17表達(dá)率(%)Treg表達(dá)率(%)Th17/Treg比值對(duì)照組113.6(3.9)0.6(1.6)5.5(4.8)A組231.0(1.5)a1.0(1.2)0.8(1.4)aB組422.9(3.8)b1.0(1.0)2.9(3.7)abC組183.9(4.3)bc1.1(1.0)4.0(4.2)bcD組283.3(3.4)b0.9(1.1)2.9(4.3)bH值31.1003.06128.250P值<0.0010.548<0.001

注：Th17=輔助性T淋巴細(xì)胞17，Treg=調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05

2.3相關(guān)性分析HBV感染者Th17表達(dá)率為2.7%(3.2%)，Treg表達(dá)率為1.0%(1.2%)，HBV-DNA載量為66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表達(dá)率與Treg表達(dá)率呈正相關(guān)(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA載量與Th17表達(dá)率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表達(dá)率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。

3討論

近年來(lái)，肝臟炎性反應(yīng)在HBV清除、HBV感染相關(guān)性肝臟疾病進(jìn)展中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，一定程度上反映了肝臟炎性反應(yīng)在肝炎-肝硬化-肝癌進(jìn)程中的重要意義[5-6]。Franzese等[7]分析了慢性乙型肝炎患者和感染了HBV恢復(fù)后的患者外周血中的CD4+CD25+Treg在體外對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)去除CD4+CD25+Treg后PBMC中的CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加且功能增強(qiáng)，證實(shí)了CD4+CD25+Treg通過(guò)抑制CD8+T淋巴細(xì)胞而起到免疫調(diào)節(jié)作用。隨后的相關(guān)研究指出，Th17在HBV感染過(guò)程中會(huì)促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)[8-9]。國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究認(rèn)為，Treg表達(dá)率的升高可以減輕肝臟炎性反應(yīng)，同時(shí)與HBV感染的慢性化存在一定關(guān)系[10-12]。而Th17具有明顯的促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)的作用，Treg能夠抑制Th17發(fā)育[13]。但也有研究認(rèn)為，單純的Treg表達(dá)率升高，肝臟Foxp3表達(dá)升高并不能完全抑制白介素(IL)-23/IL-17炎性通路[8]。Pyzik等[14]在研究中還發(fā)現(xiàn)Treg在IL-1、IL-23及IL-21的作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)h17。Th17/Treg細(xì)胞失衡在HBV感染的相關(guān)肝臟疾病纖維化進(jìn)展中可能發(fā)揮了促進(jìn)作用，較高的Th17/Treg比值與肝臟纖維化呈正相關(guān)[15]。因此，Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展中的意義可能遠(yuǎn)大于單獨(dú)的Treg表達(dá)率或Th17表達(dá)率的變化。

本研究結(jié)果顯示，D組年齡大于對(duì)照組及A、B組，提示年齡可能是HBV感染的肝臟疾病進(jìn)展階段中的重要相關(guān)因素，尤其是肝硬化患者，隨其HBV感染時(shí)間越長(zhǎng)，肝硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增大。A組Th17表達(dá)率低于對(duì)照組，B、C、D組Th17表達(dá)率均高于A組，C組Th17表達(dá)率高于B組，提示HBV感染的相關(guān)肝臟疾病中，Th17是調(diào)控肝臟炎性反應(yīng)程度的主要細(xì)胞,肝臟疾病的嚴(yán)重程度與Th17表達(dá)率可能存在一定關(guān)系。但觀察健康者和無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者的Th17表達(dá)率和ALT水平發(fā)現(xiàn)，其ALT水平與Th17表達(dá)率的高低并不完全一致，健康者Th17表達(dá)率明顯高于無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者，但ALT水平卻并未見(jiàn)明顯升高，說(shuō)明單純依靠Th17表達(dá)率無(wú)法推斷HBV感染肝臟疾病的進(jìn)展程度，而較低水平的Th17可能是HBV感染慢性化的原因之一。本研究中雖然各組間Treg表達(dá)率并無(wú)差異，但Th17/Treg比值卻存在差異，且A、B組Th17/Treg比值均低于對(duì)照組，B、C、D組Th17/Treg比值均高于A組，C組Th17/Treg比值均高于B組，提示Th17/Treg比值并不是HBV感染后是否慢性化和相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展程度的唯一決定因素。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Th17表達(dá)率與Treg表達(dá)率呈正相關(guān)，HBV-DNA載量與Th17表達(dá)率、Treg表達(dá)率、Th17/Treg比值無(wú)直線相關(guān)關(guān)系，表明Treg細(xì)胞在肝臟炎性反應(yīng)的調(diào)控中起隱匿調(diào)控作用，而Th17/Treg比值更能夠準(zhǔn)確地反映HBV感染相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展程度。相關(guān)臨床研究顯示，慢性乙型肝炎患者Treg表達(dá)率較健康者明顯升高，且與HBV-DNA載量呈正相關(guān)[7，10-11]。但亦有研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎患者Treg表達(dá)率與HBV-DNA載量無(wú)直線相關(guān)關(guān)系[16-17]，本研究結(jié)果與之一致。分析研究結(jié)果不一致的原因除了界定Treg的標(biāo)志不一致外(部分研究采用CD4+CD25+界定Treg，部分研究采用CD4+CD25+Foxp3+來(lái)界定)，也可能與慢性乙型肝炎患者不同監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的即時(shí)免疫狀態(tài)有關(guān)[18]。

綜上所述，Th17、Treg是調(diào)控HBV感染相關(guān)肝臟疾病的重要細(xì)胞，但單獨(dú)的Th17或Treg均不能完全反應(yīng)HBV感染者的臨床結(jié)局或者與之相關(guān)的肝臟疾病進(jìn)展程度；Th17/Treg比值較Th17或Treg能夠更準(zhǔn)確地反映HBV感染相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展程度；慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，但Th17/Treg失衡可能并不是導(dǎo)致HBV感染慢性化和相關(guān)肝臟疾病進(jìn)展的唯一因素。

作者貢獻(xiàn)：劉懷鄂、游晶進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；陳紅英、李鮮麗、陳曉、蘭青、張茹薏進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；游晶進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Influence of the Balance of Th17/Treg in the Progress of Hepatitis B Virus Related Liver Disease

LIUHuai-e，YOUJing，CHENHong-ying，etal.

DepartmentofInfectiousDisease，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus(HBV) related liver disease.MethodsFrom January 2011 to June 2015,we enrolled 111 patients with HBV infection who accorded with inclusion and exclusion criteria from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Base on the diagnostic standards of HBV in Practical Infectious Diseases,all the patients were divided into four groups:group A(23 patients with asymptomatic chronic HBV carriers),group B(42 patients with mild-moderate chronic hepatitis B patients),group C(18 patients with severe chronic hepatitis B) and group D(28 patients with hepatitis and hepatic cirrhosis),and we also enrolled 11 healthy people who received treatment in the physical examination center in the hospital in the same period as control group.Realtime fluorescent quantitative system was used to determine HBV-DNA load,and flow cytometry was employed to detect the expression rates of peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg.ResultsGroup A，group B，group C，group D were not significantly different in the HBV-DNA load (P>0.05).The 5 groups were not significantly different in the expression rate of Treg (P>0.05);group A was lower than control group in the expression rate of Th17 and Th17/Treg,and group B was lower than control group in Th17/Treg (P<0.05);group B,group C and group D were higher than group A in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05);group C was higher than group B in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05).For the all patients with HBV infection,the expression rate of Th17 was 2.7%(3.2%),the expression rate of Treg was 1.0%(1.2%),and HBV-DNA load was 66.0 × 104(1 206.7 × 104) copies / ml.The expression rate of Th17 was positively correlated with the expression rate of Treg(rs=0.201，P=0.026);HBV-DNA load had no linear correlation with the expression rate of Th17(rs=0.137,P=0.257),the expression rate of Treg(rs=-0.019，P=0.878),and Th17/Treg(rs=0.120，P=0.324).ConclusionThe imbalance of Th17/Treg maybe a common phenomenon in patients with chronic HBV infection，and the ratio of Th17/Treg can more accurately reflect the progress of HBV infection-related liver disease than the expression rate of Th17 or Treg alone.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B,chronic;T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory

基金項(xiàng)目:云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2011FZ121)

通信作者：游晶，650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中圖分類號(hào)】R 373.21

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.002

(收稿日期：2016-03-09；修回日期：2016-05-06)

·專題研究·