缺血后處理減輕大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

李開濟(jì)，賀寶玲，盧秋玲，門秀麗，趙利軍

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缺血后處理減輕大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

李開濟(jì)，賀寶玲，盧秋玲，門秀麗，趙利軍

摘要：目的觀察缺血后處理（I-postC）對(duì)大鼠肢體缺血再灌注（LIR）后肺損傷的影響，探討缺血后處理的器官保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法Wistar大鼠24只隨機(jī)分為3組（n=8），對(duì)照組（Control組）、缺血再灌注組（IR組）和缺血后處理組（I-postC組）。結(jié)扎大鼠雙后肢根部以阻斷血流4 h，后再恢復(fù)血流灌注4 h，制作大鼠LIR動(dòng)物模型。Control組橡皮帶松弛環(huán)繞雙后肢不阻斷血流，I-postC組在血流再灌注前，行重復(fù)3次的缺血5 min-再灌注5 min，再恢復(fù)4 h的血流再灌注。留取血液及肺組織標(biāo)本，測定各組動(dòng)物動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)氧分壓［p（O2）］和二氧化碳分壓［p（CO2）］，檢測血漿及肺組織的丙二醛（MDA）含量及黃嘌呤氧化酶（XOD）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，光鏡及電鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果LIR后p（O2）和p（CO2）明顯降低，血漿和肺組織中SOD活性明顯降低，而XOD、MDA明顯增加（P＜0.05）；鏡下可見肺間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張充血，中性粒細(xì)胞浸潤，血管周圍間隙增大，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有滲出液等損傷表現(xiàn)。與IR組比較，I-postC組p（O2）和p（CO2）明顯增加，血漿及肺組織SOD活性升高；而XOD、MDA水平降低（P＜0.05）；鏡下觀察肺組織只可見輕度病理改變。結(jié)論I-postC可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕大鼠LIR后肺損傷的程度。

關(guān)鍵詞：再灌注損傷；肺；氧化性應(yīng)激；丙二醛；黃嘌呤氧化酶；超氧化物歧化酶；缺血后處理

肢體缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）損傷是臨床外科十分常見的病理現(xiàn)象。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，在LIR發(fā)生過程中，機(jī)體其他遠(yuǎn)隔器官也會(huì)受到累及［1］。肺臟是LIR中最易受累器官之一，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是常見的危重表現(xiàn)形式［2］。積極探討減輕缺血再灌注對(duì)遠(yuǎn)隔器官損傷的措施是目前研究的熱點(diǎn)之一，缺血后處理（ischemic postconditioning，I-postC）是本領(lǐng)域較新的研究成果，即在缺血組織得到長時(shí)間血流再灌注之前，先進(jìn)行一次或數(shù)次短暫的缺血再灌注，通過激活機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制而減輕隨后持續(xù)再灌注引起的組織損傷。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)此保護(hù)作用同樣適用于遠(yuǎn)隔器官及遠(yuǎn)隔后處理［3］。本研究進(jìn)一步從氧化應(yīng)激（oxidative stress）的角度觀察I-postC對(duì)肢體缺血再灌注后肺組織的保護(hù)作用，并探討其病理生理學(xué)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組24只健康清潔級(jí)Wistar大鼠購自河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（質(zhì)量合格證號(hào)：0001190），體質(zhì)量200～250 g，普食喂養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2010-0038。采用計(jì)算機(jī)輔助實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組（CAR）程序［4］將動(dòng)物隨機(jī)分為3組（n=8）：對(duì)照組（Control組），缺血再灌注組（IR組），缺血后處理組（I-postC組）。術(shù)前24 h禁食，自由飲水。

1.2模型制備及標(biāo)本采集止血帶法制作大鼠LIR動(dòng)物模型［1］，即：將動(dòng)物乙醚淺麻醉，用標(biāo)準(zhǔn)化彈性的橡皮筋環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部阻斷血流4 h（硬質(zhì)套管輔助），然后剪斷橡皮筋恢復(fù)血流灌注4 h。以結(jié)扎后雙后肢皮膚蒼白、溫度降低為缺血標(biāo)準(zhǔn)；以松解后局部皮膚逐漸變紅，溫度回升且腫脹等作為血流再灌注的標(biāo)準(zhǔn)，并輔以激光多普勒血流儀監(jiān)測血流情況，綜合判斷篩選成功模型。Control組雙后肢僅松弛環(huán)繞橡皮筋，不阻斷血流，I-postC組則在血流再灌注前先行缺血5 min，再灌注5 min處理，并重復(fù)3次，再恢復(fù)血流持續(xù)灌注4 h。各組動(dòng)物在再灌注4 h時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈取血約0.5 mL（隔絕空氣，即將穿刺針頭插入橡皮塞內(nèi)），立即送血?dú)夥治?，再取肝素抗凝? mL，經(jīng)3 500 r/min離心15 min，所得血漿標(biāo)本分裝在干凈的Eppendorf管中，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)立即開胸取出肺臟，液氮速凍，-70℃儲(chǔ)藏備用。此外，每組取3份右肺中葉，切取2/3迅速投入4%甲醛溶液中固定，光鏡標(biāo)本待用。將剩余1/3的組織塊立即投入冷4%戊二醛-磷酸緩沖液，后續(xù)處理后電鏡標(biāo)本待用。

1.3指標(biāo)及檢測 （1）血?dú)夥治鲋笜?biāo)動(dòng)脈血氧分壓［p（O2）］和二氧化碳分壓［p（CO2）］。穿刺腹主動(dòng)脈取血約0.5 mL，立即隔絕空氣經(jīng)雅培血?dú)夥治鰞x（型號(hào)：i-STAT 300）檢測p（O2）和p（CO2）。（2）血漿超氧化物歧化酶（SOD）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）水平。以凍存的血清標(biāo)本為樣品，嚴(yán)格按照試劑盒（南京建成生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作，利用比色法測定吸光度，通過各指標(biāo)的公式計(jì)算出各樣本的結(jié)果。（3）肺組織MDA、XOD、SOD水平。將凍存的肺組織標(biāo)本解凍并勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清液為測試樣品，余步驟同（2）。（4）肺組織光鏡觀察。切取的肺組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，脫蠟，HE染色，透明，封片，觀察。（5）肺組織電鏡觀察。切取的肺組織立即投入冷的4%戊二醛-磷酸緩沖液，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預(yù)固定，后轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛中固定，經(jīng)丙酮脫水、環(huán)氧樹脂618包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡（日立H-7650型）下觀察肺組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組動(dòng)物p（O2）和p（CO2）結(jié)果與Control組比較，IR組和I-postC組的p（O2）和p（CO2）均明顯降低（P＜0.05），肺換氣功能障礙明顯。I-postC組較IR組p（O2）和p（CO2）有所提升（P＜0.05），低氧血癥和過度通氣有所緩解，見表1。

Tab.1　The values of p（O2）and p（CO2）of arterial blood gas in three groups表1　各組動(dòng)物p（O2）和p（CO2）結(jié)果?。╪=8，mmHg，x±s）

2.2各組動(dòng)物血漿中MDA、XOD、SOD水平與Control組比較，IR組和I-postC組血漿MDA、XOD均明顯升高，SOD則降低（P＜0.05），全身脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)而抗氧化酶活性降低；I-postC組較IR 組MDA、XOD降低（P＜0.05），全身氧化應(yīng)激損傷程度減輕，見表2。

Tab.2　The plasma values of MDA，XOD and SOD in three groups表2　各組動(dòng)物血漿中MDA、XOD和SOD水平?。╪=8，x±s）

2.3各組動(dòng)物肺組織MDA、XOD和SOD水平與Control組比較，IR組和I-postC組肺組織MDA、XOD均明顯升高，而SOD降低（P＜0.05），肺組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；I-postC組較IR組，MDA和XOD降低，而SOD則升高（P＜0.05），I-postC有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和保護(hù)自由基清除酶的作用，見表3。

Tab.3　The values of MDA，XOD and SOD of lung tissue in three groups表3　各組動(dòng)物肺組織中MDA、XOD和SOD水平　（n=8，x±s）

2.4光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)改變Control組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無損傷表現(xiàn)。與Control組比較，IR組肺組織水腫，可見肺泡隔增寬，肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞聚集、附壁，血管周圍間隙增大。部分肺泡腔中可見出血和蛋白滲出物，并伴有局限性肺不張。而在I-postC組，肺組織結(jié)構(gòu)損傷不及IR組嚴(yán)重，肺泡基本形態(tài)尚可，肺泡腔的滲出和充血不明顯，僅有輕度血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.5電鏡下肺組織形態(tài)學(xué)改變電鏡下可見Control組肺組織細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)規(guī)整，無水腫、變形和變性等損傷表現(xiàn)。IR組可見肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞水腫變性，肺泡壁增厚，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞膜微絨毛減少，線粒體腫脹、嵴減少，且胞質(zhì)中板層小體明顯減少，肺間質(zhì)水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。I-postC組細(xì)胞形態(tài)尚可，水腫不明顯，細(xì)胞損傷程度較IR組有所減輕，見圖2。

3　討論

近年來，在再灌注損傷的研究領(lǐng)域，缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IP）和I-postC是備受矚目的兩大熱點(diǎn)［1，5］。雖然IP的器官保護(hù)作用是肯定的，但其需要在缺血發(fā)生之前就反復(fù)多次阻斷血流，在諸如血管栓塞等不可預(yù)見性疾病的防治中，IP的應(yīng)用受到很大限制。和缺血不同，臨床上再灌注更多是可預(yù)見甚至可控制的過程［5］，因此I-postC有更強(qiáng)的實(shí)用性和可行性。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過“溫和再灌注”可以減少缺血器官的梗死面積和水腫程度，避免無復(fù)流現(xiàn)象，這也是對(duì)I-postC器官保護(hù)作用的有力支持［6］。在此基礎(chǔ)之上發(fā)展而來的遠(yuǎn)隔后適應(yīng)為保護(hù)遠(yuǎn)隔器官開辟了新的研究領(lǐng)域，目前關(guān)于缺血后適應(yīng)對(duì)LIR后肺臟的保護(hù)作用和機(jī)制值得關(guān)注。

Fig.1　The lungtissue structure of three groups under light microscope（HE，×200）圖1　各組肺組織結(jié)構(gòu)光鏡觀察（HE，×200）

Fig.2　The lungtissue structure of three groups under electron microscope圖2　各組肺組織結(jié)構(gòu)電鏡觀察

LIR可因嚴(yán)重的全身氧化應(yīng)激反應(yīng)引起肺組織的損傷［7］。肺氣體交換功能障礙是評(píng)價(jià)肺損傷程度的敏感指標(biāo)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注后p（O2）和p（CO2）明顯降低，p（O2）降低是LIR致肺損傷，進(jìn)而導(dǎo)致氣體交換功能明顯障礙的直接表現(xiàn)，低氧進(jìn)一步刺激外周化學(xué)感受器，反射性引起呼吸的加深加快，CO2排出過多［9］，從而使p（CO2）也明顯降低。光鏡下和電鏡下肺組織的病理變化是肺氣體交換功能障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。缺血及血液再灌注可經(jīng)多種途徑激活XOD而催化大量自由基生成。性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的MDA可間接反映體內(nèi)自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。自由基清除酶SOD的降低與缺血缺氧使其生成不足、消耗過多以及被激活的中性粒細(xì)胞攜帶至炎癥部位等因素密切相關(guān)［10］。而I-postC組血漿中XOD、MDA水平明顯低于IR組，提示氧化應(yīng)激程度有所減輕；血液SOD水平與IR組無明顯差異，可能與過多消耗而來不及合成補(bǔ)充有關(guān)系。血?dú)庵笜?biāo)的變化也從功能方面驗(yàn)證了I-postC抑制氧化損傷的作用，是肢體I-postC保護(hù)肺功能直接而有力的依據(jù)。

有研究表明，在I-postC的病理生理過程中，多種細(xì)胞外信號(hào)被激活，G蛋白偶聯(lián)受體作為啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)再灌注損傷補(bǔ)救通路（reperfusion injury salvage pathway，RISK）的橋梁，活化多種細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性蛋白，從而使組織細(xì)胞的損傷得以減輕［11］。在多次的肢體缺血及再灌注過程中，血液內(nèi)皮源性的緩激肽、一氧化氮（NO）、前列腺素I2（PGI2）等是I-PostC遠(yuǎn)隔組織保護(hù)作用的觸發(fā)器，可激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及酪氨酸蛋白激酶（TPK）等，促進(jìn)熱休克蛋白（HSP）或ATP敏感性K+通道的磷酸化［11］。另有報(bào)道，I-postC可延遲腺苷的清除，并激活細(xì)胞膜上腺苷A2、A3受體，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］。這些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)的改變均有助于維持細(xì)胞骨架的完整性，在肺組織可減輕肺呼吸膜的損傷，提高肺換氣的效率。本研究著重從氧化應(yīng)激的角度，證實(shí)了缺血后處理可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕大鼠LIR后肺損傷的程度。I-postC是多因素參與、多路徑調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，它們之間相互調(diào)控，共同實(shí)現(xiàn)組織器官的保護(hù)作用。

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（2015-08-24收稿2015-12-03修回）

（本文編輯李國琪）

Experimental studies of ischemia postconditioning alleviated lung injury after limb ischemia reperfusion in rats

LI Kaiji，HE Baoling，LU Qiuling，MEN Xiuli，ZHAO Lijun
Department of Pathophysiology，Basic Medical College，North China University of Science and Technology，Hebei 063000，China Corresponding AuthorE-mail：786411506@qq.com

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of ischemic postconditioning（I-postC）on lung injury after limb ischemia reperfusion（LIR）in rats，and to investigate the protective effect and the mechanisms.MethodsTwenty-four Wistar rats were divided into three groups:control group（group Control），ischemia-reperfusion group（group IR）and ischemic postconditioning group（group I-postC）.Referring to routine method in our department，the model rats underwent 4-hour ischemia and 4-hour reperfusion of hind limbs were made.In group Control，the rubber band around the limb was loose，which did not block the blood flow.Rats in group I-postC were given repeated 3 times of 5 min ischemia-5 min reperfusion，and then did perfusion 4 h before reperfusion.The blood and lung samples were collected for detecting arterial gas of partial pressure of oxygen［p（O2）］and partial pressure of carbon dioxide［p（CO2）］.The plasma and lung tissue levels of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and xanthine oxidase（XOD）were detected.The morphological changes of lung tissue were observed under light microscope and electron microscope.ResultsIt was found that after suffering from ischemia-reperfusion，levels of p（O2）and p（CO2）decreased significantly.The activity of SOD in plasma and lung tissues decreased，but XOD and MDA increased significantly（P＜0.05）.With microscope，lung interstitial vascular dilation，infiltration of neutrophils，the width of the alveolar space，alveolar septal thickening and alveolar exudate were found.Compared with IR group，it was found that p（O2）and p（CO2）increased significantly in group I-postC.The activity of SOD in plasma and lung tissues increased，but XOD and MDA decreased significantly（P＜0.05）.The mild damage of pathological changes were found.ConclusionIschemic postconditioning can reduce the lung injury after limb ischemia reperfusion in rats，which may be related to the inhibition of lipid peroxidation.

Key words：reperfusion injury；lung；oxidative stress；malondialdehyde；xanthine oxidase；superoxide dismutase；ischemic postconditioning

中圖分類號(hào)：R363.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150003

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)課題（20130060）

作者單位：河北省唐山市，華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系（郵編063000）

作者簡介：李開濟(jì)（1994），男，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，主要從事肢體缺血再灌注損傷機(jī)制與防治的研究

通訊作者E-mail:786411506@qq.com