響應(yīng)曲面法優(yōu)化芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝

宋浩銘，容 庭，2，劉志昌，2，李書宏，2，何偉靈，彭廣輝，2，王 剛，2

（1.廣州五豐動物保健品有限公司，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)科院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點實驗室/廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝

宋浩銘1，容 庭1，2，劉志昌1，2，李書宏1，2，何偉靈1，彭廣輝1，2，王 剛1，2

（1.廣州五豐動物保健品有限公司，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)科院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點實驗室/廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

摘 要：以廣東茂名產(chǎn)芒果葉為研究對象，優(yōu)化芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、超聲功率和提取時間為自變量，以芒果葉中總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法分析優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果表明，芒果葉中總黃酮提取的最佳工藝條件為：提取溫度為65℃，超聲波功率為90 W，提取時間為48 min。在此條件下，驗證試驗得到芒果葉中總黃酮的提取率為5.26（±0.04）%，優(yōu)化選擇提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞：芒果葉；總黃酮；超聲提??；響應(yīng)曲面法

我國芒果樹主要分布在海南、廣西、廣東、云南、臺灣和福建，是熱帶、亞熱帶名果樹之一。芒果葉中含繁多復(fù)雜的化學(xué)成份［1］，具有重要的生理活性及保健功能［2-5］，開發(fā)和研究價值極大。其中黃酮類化合物頗為豐富，研究證實，黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤形成、抑制腫瘤生長及治療心血管疾病等特殊功效，已成為新藥研發(fā)的熱點。黃酮類化合物傳統(tǒng)的提取方法有煎煮法、回流提取法、索氏提取法等方法，但存在耗時、耗料、提取率低、有效成分易破壞等諸多缺點。目前黃酮類化合物提取較為理想的方法有微波輔助提取法［6-9］和超聲波提取法［10-11］，但微波輔助提取法，提取處理過程處于密封系統(tǒng)，短時間內(nèi)無法確定較適宜的提取溫度及物料受高溫加熱處理，勢必影響提取效果［9］。目前，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝的研究報道較少，采用超聲波提取法不僅彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法中存在的缺點，且超聲波產(chǎn)生的各種效應(yīng)能夠在不改變有效成分結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，縮短提取時間、節(jié)約溶劑、提高提取率［12-13］。本試驗采用超聲波提取法提取廣東粵西芒果葉中總黃酮類化合物，運用響應(yīng)曲面法分析各種提取因素，優(yōu)化各提取條件，得出最佳工藝參數(shù)，為芒果葉中總黃酮類化合物的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芒果葉采自廣東茂名，經(jīng)挑選、清洗，65℃烘干備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙醇（純度≥99.7%），購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A型）、高速中藥粉碎機(jī)（DF-20型）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ3200DE型）、循環(huán)水式真空泵（SHZ-0（Ⅲ）型）、可見分光光度計（UV-1750型）、電子天平（AB-135S型）、電子天平（AL207型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A型）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用NaNO2-Al （NO3）3-NaOH顯色法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)物，在420～700 nm波長范圍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物全波長掃描，得出在510 nm波長處有最大吸收值，故選用此波長測定芒果葉總黃酮的含量［14-15］；以蘆丁樣品濃度—吸光值作圖，做線性回歸，得蘆丁濃度C和吸光值A(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：A=11.515C+0.0366（R2=0.99652），式中，A為吸光度，C為蘆丁濃度（mg/mL）。

1.2.2 芒果葉中總黃酮的提取與測定 將干燥的芒果葉粉碎，過孔徑0.150～0.125篩，備用。稱取3 g粉末，置于250 mL圓底燒瓶，加入不同體積和濃度的乙醇，在不同超聲功率、溫度下超聲提取一定時間。提取1次后，先常壓蒸餾，大約蒸出1/3溶劑；再減壓蒸餾至近干，即得提取物［14］。產(chǎn)品移置25 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15 min，參照NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，在510 nm處測定其吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算總黃酮量，計算提取率。計算公式為：

1.2.3 芒果葉中總黃酮提取單因素試驗 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（3︰30、3︰35、3︰40、3︰45、3︰50、3︰55）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲功率（30、60、90、120、150W）和提取時間（15、30、45、60、75 min）5個單因素進(jìn)行試驗。

1.2.4 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計［16-17］以芒果葉總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，選取提取溫度（A）、超聲功率（B）及提取時間（C）3個因素。在單因素試驗基礎(chǔ)上，用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗因素水平

試驗數(shù)據(jù)利用Design Expert8.0.6軟件中Boxbehnken進(jìn)行處理與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對芒果葉中總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份芒果葉粉末各3 g，在固定超聲功率150 W、提取溫度60℃、提取時間30 min條件下，測定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對芒果葉中總黃酮提取率的影響。由圖1可知，芒果葉中總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加先升高后逐漸下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，總黃酮提取率最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%時，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐漸下降，原因在于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，葉綠素等脂溶性物質(zhì)溶出增多，干擾因素隨之增大，提取率有所降低。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%為宜，60%最適。

2.1.2 料液比對芒果葉中總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取6份芒果葉粉末各3 g，加入不同劑量（30、35、40、45、50、55 mL）體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，在相同條件下（超聲功率150 W、提取溫度60℃、提取時間30 min），測定不同料液比對芒果葉中總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在料液比為3︰30～3︰40時，提取率隨著料液比增大而快速增大；但料液比大于3︰40，提取率明顯下降。因此，選擇料液比為3︰40最適。

圖2 料液比對芒果葉中總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對芒果葉中總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份芒果葉粉末各3 g，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，在超聲功率150 W、提取時間30 min條件下，測定不同提取溫度比對芒果葉總黃酮提取率的影響。由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率隨之增加，提取溫度為60℃，提取率最高。但當(dāng)提取溫度大于60℃，總黃酮提取率隨之快速下降。因此，總黃酮提取率最適的提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對芒果葉中總黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲功率對芒果葉中總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份芒果葉粉末各3 g，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，在提取溫度60℃、提取時間30 min條件下，測定不同超聲功率比對芒果葉中總黃酮提取率的影響。由圖4可知，隨著超聲功率的增加，總黃酮提取率快速增加，當(dāng)超聲功率達(dá)到90 W時，提取率最大；而當(dāng)超聲功率＞90W，總黃酮提取率隨之下降。從理論上講，超聲功率越大越利于黃酮的提取，原因是超聲功率增大會增加細(xì)胞的破碎率，黃酮溶出率增加，但同時超聲功率過大不利于黃酮類化合物的產(chǎn)生，使更多脂溶性物質(zhì)溶入提取液，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。因此，總黃酮提取率最適的超聲功率為90 W。

圖4 超聲功率對芒果葉中總黃酮提取率的影響

圖5 提取時間對芒果葉中總黃酮提取率的影響

2.1.5 提取時間對芒果葉中總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份芒果葉粉末各3 g，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，在超聲功率90 W、提取溫度60℃條件下，測定不同提取時間比對芒果葉總黃酮提取率的影響。由圖5可知，提取時間為15～45min時，總黃酮提取率隨時間的增加快速增加；當(dāng)提取時間大于45 min，隨提取時間增加提取率先緩慢下降后趨于平穩(wěn)。因此，選擇提取時間為45 ～ 60 min為宜。

2.2 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果與方差分析

響應(yīng)曲面試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。利用Design- Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到芒果葉總黃酮提取率（Y）對溫度（A）、超聲功率（B）及提取時間（C）的二次多元回歸方程：Y=5.29-0.0025A-0.030B+0.020C+0.037AB+0.013 AC+0.012BC-0.22A2-0.20B2—0.063C2。模型方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析

由表3可知，模型P值=0.0006，表明該模型高度顯著，芒果葉總黃酮的提取率差異高度顯著。模型失擬項的差異不顯著?；貧w模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9553，其調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.8979，表明該模型擬合度良好，試驗誤差小，可用該模型來解釋95.53%響應(yīng)值的變化。因此，用該模型來分析和預(yù)測芒果葉中總黃酮的超聲提取效果是可行的。由表3可知，二次項A2、B2及C2對芒果葉總黃酮提取率的影響是顯著的，一次項A、B、C及交互項AB、AC、BC對芒果葉中總黃酮提取率的影響不顯著。因此，各因素對芒果葉中總黃酮提取率的影響主次順序為：B（超聲功率）＞C （提取時間）＞A（提取溫度）。

2.3 響應(yīng)曲面的分析與優(yōu)化

利用Design Expert8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面和等高線圖（圖1～圖3）。圖1～圖3直觀反映了各單因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)曲面圖可反映各單因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，等高線的形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱。

由圖1A可知，當(dāng)超聲功率一定時，芒果葉中總黃酮提取率隨著溫度的升高先增大后減??；當(dāng)溫度一定時，總黃酮提取率隨著超聲功率的增大而增大，隨后逐漸下降。從圖1B可以看出，等高線沿超聲功率方向峰值移動，其密度大于沿溫度方向，表明超聲功率對效應(yīng)值的貢獻(xiàn)較大，所得結(jié)論均與方差分析結(jié)果相一致。

由圖2A可知，在一定的提取時間，芒果葉中總黃酮提取率隨著提取溫度增大而增大，隨后逐漸下降；隨著提取時間的由小變大，總黃酮提取率變化不明顯。由圖2B等高線可知，等高線沿提取時間方向或溫度方向峰值移動，其密度均相似，較稀疏，表明兩者交互作用對芒果葉總黃酮提取率的影響不明顯。

圖1 溫度與超聲功率對芒果葉中總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖2 溫度與提取時間對芒果葉中總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面圖（A）和等高線圖（B）

從圖3A可以看出，在一定提取的時間，芒果葉中總黃酮提取率隨著提取溫度增大而增大，隨后逐漸下降；隨著提取時間的由小變大，總黃酮提取率變化不明顯。從圖3B可以看出，沿超聲功率方向峰值移動，其等高線密度略大于沿提取時間方向，但兩都等高線密度較稀疏，表明兩者交互作用對總黃酮提取率的影響不明顯。

圖3 超聲功率與提取時間對芒果葉中總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面圖（A）和等高線圖（B）

2.4 條件優(yōu)化、預(yù)測與驗證

通過軟件求解回歸方程，得出最佳提取工藝條件為：提取溫度為65.49℃、超聲波功率為89.56 W、提取時間為48.19 min，預(yù)測提取率為5.22%?？紤]到實際的可操作性，將優(yōu)化工藝條件修正為：溫度為65℃、超聲功率為90 W、時間為48 min，在此條件下進(jìn)行5次平行實驗，驗證試驗結(jié)果顯示芒果葉中總黃酮的提取率為5.26±0.04%，提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論與討論

總黃酮類化合物的傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、回流提取法、索氏提取法、浸漬法、滲漉法、水蒸汽蒸餾法等，多存在耗時、耗料、提取率低、有效成分易破壞等諸多缺點。超聲提取法作為一種新型的提取方法，可大大縮短提取時間、節(jié)約溶劑，提高提取率［12-13］。超聲提取法多用于植物有效成分提取，如張青等［18-20］均采用超聲提取法分別提取芒果葉中的芒果苷、芒果葉中的多糖和小花棘豆總黃酮。目前國內(nèi)有關(guān)超聲提取芒果葉中總黃酮類化合物的報道較少，僅見3篇文獻(xiàn)報道［16，17，21］；而關(guān)于運用響應(yīng)曲面法分析優(yōu)選芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝未見有報道。本實驗采用超聲提取法和響應(yīng)曲面法分析優(yōu)化芒果葉中總黃酮化合物的提取工藝，實驗方法均與張青等采用的提取與分析方法相同［18］，其結(jié)果均高于采用傳統(tǒng)提取方法得到的總黃酮化合物提取率，這在謝三都等的試驗中得到驗證［9］。本實驗采用單因素和響應(yīng)曲面設(shè)計試驗對芒果葉中總黃酮化合物超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲功率對芒果葉中總黃酮化合物提取的影響最大，因此，今后采用超聲提取總黃酮化合物實驗設(shè)計優(yōu)選因素時可最先考慮超聲功率。

響應(yīng)曲面分析法應(yīng)用范圍較廣，見于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。優(yōu)化實驗設(shè)計中大多數(shù)采用正交試驗，但正交試驗中仍存在不足，如考慮到各因素間交互作用，正交試驗次數(shù)會大大增加、工作量大、模型誤差大、優(yōu)選得到最佳工藝較難等；而響應(yīng)曲面法可填補(bǔ)正交試驗的不足，具有卓越的先進(jìn)性［22］。響應(yīng)曲面實驗設(shè)計中選用的因素與水平越多，得到試驗數(shù)據(jù)越可靠，最佳工藝組合越易篩選得到。張青等試驗中采用四因素四水平的響應(yīng)曲面分析法［18］，得出部分組合的交互作用影響差異顯著，而本試驗采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法，雖得到組合的交互作用影響差異均不顯著，所選出來的最佳單因素組合，經(jīng)驗證實驗表明，提取得到的總黃酮提取率與預(yù)測值較為相近。因此，響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計中所選擇因素越多，得到的工藝條件參數(shù)越可靠、實驗數(shù)據(jù)越真實。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Optimization of ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Mangifera indica L. leaves by response surface method

SONG Hao-ming1，RONG Ting1，2，LIU Zhi-chang1，2，LI Shu-hong1，2，HE Wei-ling1，PENG Guang-hui1，2，WANG Gang1，2
（1. Guangzhou Wufeng Animal Health Products Co. Ltd.，Guangzhou 510640，China；2.Institute of Animal Science，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding/ Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition/ Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition，Guangzhou 510640，China）

Abstract：The experiment was conducted to optimize the ultrasound-assisted extraction conditions of total flavonoids in Mangifera indica L. leaves collected from Maoming City，Guangdong Province. The extraction temperature，ultrasound power and extraction time were chosen as causal factors to optimize the yield of total flavonoids by response surface method（RSM）. The optimal extraction conditions were as follows： extraction time 48 min，extraction temperature 65℃ and ultrasound power 90 W. Under the optimized conditions，the extraction rate of flavonoids was 5.26%. These results indicated that the optimized conditions obtained from RSM were stable and practicable.

Key words：Mangifera indica L. leaves； total flavonoids； ultrasound-assisted extraction； response surface method.

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）02-

收稿日期：2015-09-07

基金項目：廣東省省屬科研機(jī)構(gòu)改革創(chuàng)新領(lǐng)域項目（2014B070706014）

作者簡介：宋浩銘（1985-），男，研究實習(xí)員，E-mail：mingbohaokira@163.com

通訊作者：王剛（1968-），男，碩士，高級獸醫(yī)師，E-mail：wgwg2004@yahoo.com.cn