禽流感病毒廣東株HA基因BLSOM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分型方法的建立

田純見，羅 瓊，高佳卉，林志雄，魚海瓊，劉志玲，陳 茹，吳曉薇

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心/廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督與檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家禽流感檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·廣東，廣東 廣州 510623）

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禽流感病毒廣東株HA基因BLSOM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分型方法的建立

田純見，羅 瓊，高佳卉，林志雄，魚海瓊，劉志玲，陳 茹，吳曉薇

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心/廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督與檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家禽流感檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·廣東，廣東 廣州 510623）

摘 要：利用25個(gè)禽流感病毒及相關(guān)流感病毒廣東株HA基因序列，建立三、四核苷酸特征基因片段BLSOM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分型方法，對(duì)各片段數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和歸一化處理。設(shè)計(jì)程序由MATLAB函數(shù)模擬人腦思維自組織學(xué)習(xí)，當(dāng)訓(xùn)練步數(shù)為100及以上各毒株能成功聚類。H1、H3、H5、H7和H9亞型主要毒株分別歸為一類，其中H3N2和H7N9毒株HA基因聚類圖譜高度相似，表明這些毒株起源相同；不同年代H5N1毒株差異較大；H1N1和H9N2各1個(gè)毒株聚為一類，表明這兩種病毒自然重組變異，為高危毒株篩查和溯源提供參考。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；BLSOM；HA基因；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；分型

禽流感除造成養(yǎng)禽業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失外，據(jù)OIE統(tǒng)計(jì)H5N1禽流感已經(jīng)出現(xiàn)668例人類感染，死亡率達(dá)到58.83%。目前新發(fā)H7N9禽流感繼續(xù)流行，并出現(xiàn)新的人類病例，使得禽流感防制工作雪上加霜。這歸根結(jié)底是動(dòng)物源性流感病毒傳播最終適應(yīng)人類，給公共健康帶來極大威脅［1］。在禽流感病毒監(jiān)測(cè)上，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的顯著進(jìn)步，基因庫(kù)數(shù)據(jù)急劇增長(zhǎng)，使得經(jīng)典的進(jìn)化樹分析出現(xiàn)困難，需要進(jìn)行技術(shù)革新。珠江三角洲位于國(guó)際候鳥遷徙路線，氣候溫和濕潤(rùn)，是世界禽流感爆發(fā)流行的中心區(qū)域。目前，廣東省各種禽類養(yǎng)殖人員較多，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)活禽宰殺交易方式仍然存在。調(diào)查顯示，廣州、江門、肇慶等地活禽農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)禽流感感染逐年加重，成為重要的病毒儲(chǔ)存庫(kù)［2-4］，檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到32.73%，其中用于宰殺的案板甚至高達(dá)75%［5］。監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)以H9亞型為主，H5、H7等亞型也存在，與疫苗毒株比較存在較大變異［6］。同時(shí)，廣大居民接觸活禽普遍存在，人類感染后病情危重［7-8］，甚至死亡。因此，深入開展禽流感病毒分型方法研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

用于本研究的全部毒株來自廣東省境內(nèi)，提供HA基因全部序列。其中，甲型H1N1流感病毒為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)從豬體內(nèi)分離毒株及醫(yī)學(xué)單位分離的人類毒株；H3N2毒株為廣東省疾病預(yù)防控制中心（CDC）分離的患者病毒樣品；H5N1病毒為哈獸研和華南農(nóng)大分離的禽類毒株，含國(guó)家流感中心分離的人類感染病毒；H7N9為最近流行毒株，均由廣東省CDC提供，3株分離自人體，兩株由雞場(chǎng)分離；H9N2均分離自雞體，由哈爾濱獸醫(yī)研究所和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)完成（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 BLSOM算法 建立BLSOM（Batch-learning self-organizing map）人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，接受外界輸入產(chǎn)生不同響應(yīng)區(qū)域，模擬人腦思維的自組織學(xué)習(xí)過程［9］。其歐式距離計(jì)算公式為：

表1 禽流感病毒廣東流行毒株BLSOM特征基因片段統(tǒng)計(jì)

1.2.2 數(shù)據(jù)歸一化處理 統(tǒng)計(jì)各個(gè)毒株HA基因特征片段［10］數(shù)量，歸一化處理公式如下：

1.2.3 MATLAB實(shí)現(xiàn) 參照文獻(xiàn)［11］編寫程序，運(yùn)行軟件MATLAB（2014年版），其部分程序代碼（表1）為：

fx＞＞

%% 清空環(huán)境變量

clc

clear

%% 錄入輸入數(shù)據(jù)

% 載入數(shù)據(jù)

load（'c：data.mat'）；

P=data；

……

利用函數(shù)newsom建立SOM網(wǎng)絡(luò)，競(jìng)爭(zhēng)層為6 ×6=36個(gè)神經(jīng)元。利用函數(shù)train和sim進(jìn)行訓(xùn)練仿真，plotsom函數(shù)繪制變量關(guān)系圖，vec2ind函數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物BLSOM分型研究

圖1 禽流感病毒廣東株HA基因BLSOM算法流程

圖2 禽流感病毒部分廣東流行毒株BLSOM臨近神經(jīng)元間距離

目前，微生物基因組信息大量增加，需要新的技術(shù)手段進(jìn)行全面分析。常用的微生物基因組GC值分析方法簡(jiǎn)單，不適宜處理大量的基因組信息，結(jié)果不能反映微生物基因變異的本質(zhì)特征。非序列比對(duì)的自組織映射（SOM）及其改進(jìn)的BLSOM方法是密碼子研究的革命性進(jìn)步，一次可分析百萬(wàn)以上的序列，可對(duì)長(zhǎng)達(dá)1 kb的基因片段分類和變異方向預(yù)測(cè)。BLSOM利用先進(jìn)的電腦軟件可視化分類工具，可揭示自然選擇帶來的病毒宿主依賴性和密碼子偏好，在幾百萬(wàn)個(gè)微生物基因數(shù)據(jù)中找出高危種類，用于高危毒株監(jiān)測(cè)（圖1、圖2），對(duì)生物醫(yī)學(xué)和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)具有重要意義。新版MATLAB軟件工具箱提供神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)函數(shù)，可模擬人腦完成BLSOM競(jìng)爭(zhēng)學(xué)習(xí)和訓(xùn)練、模式識(shí)別、分類和鑒定等功能，在工程、經(jīng)融、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、教育、公安及各種科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用［11-12］。本研究用于禽流感病毒研究取得初步成功，值得深入探討。

2.2 禽流感分型標(biāo)準(zhǔn)及BLSOM分型

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前基因庫(kù)禽流感病毒核酸序列已多達(dá)73萬(wàn)個(gè)，其中H1N1、H3N2、H5N1和H9N2分別為11.0萬(wàn)、8.3萬(wàn)、2.7萬(wàn)、1.4萬(wàn)個(gè)，常規(guī)的進(jìn)化樹等分析方法難窺全豹［13］。BLSOM方法可同時(shí)處理100萬(wàn)以上基因序列，且分析結(jié)果與進(jìn)化樹一致。在基因水平和寡核苷酸（2～4個(gè)堿基）片段構(gòu)成上，禽流感均顯示出明顯的宿主依賴性，即按宿主進(jìn)行自組織分類特性，這是BLSOM分類的生物學(xué)基礎(chǔ)。由于流感病毒生長(zhǎng)要依賴很多宿主因子如核苷酸、氨基酸、tRNA等成分，同時(shí)要逃避宿主的抗病毒機(jī)制如抗體、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、干擾素、RNA干擾等作用，因此形成基因結(jié)構(gòu)的獨(dú)特宿主依賴性。但是，單核苷酸BLSOM往往不能得出宿主依賴性的結(jié)論，四核苷酸（Tetra）BLSOM按宿主分型效果良好。研究結(jié)果（表2、圖3、表3）表明，除HA基因外，全部8個(gè)基因片段都可以用于分析，在BLSOM分析中形成宿主以來的區(qū)域和顏色，方便進(jìn)行可視化分析。

表2 禽流感病毒部分廣東流行毒株BLSOM訓(xùn)練步數(shù)及聚類結(jié)果

2.3 BLSOM軟件工具、參數(shù)和短核苷酸片段選擇

禽流感病毒基因密碼子自然選擇在全部8個(gè)片段都存在壓力，均可用于BLSOM分析獲得基因特征和宿主偏好信息。Tetra-BLSOM可按區(qū)域和色彩清楚劃分人豬禽流感病毒，由于變異而位于兩個(gè)區(qū)域邊界的毒株作為高危毒株就可以識(shí)別出來。本研究的聚類圖譜（圖3）可清晰看出H3N2和H7N9各毒株一致的結(jié)構(gòu)，H9N2、H5N1和H1N1存在毒株變異。本研究選擇6種寡核苷酸片段（其中4個(gè)為四核苷酸）用于BLSOM效果良好，可識(shí)別主要禽流感流行毒株。當(dāng)訓(xùn)練步數(shù)達(dá)到100級(jí)以上時(shí)產(chǎn)生有效聚類效果（表2），這時(shí)位于右上角的神經(jīng)元距離較遠(yuǎn)（圖2），測(cè)試樣品均勻分布（圖4）。能同時(shí)處理大數(shù)據(jù)序列的方法和軟件有待進(jìn)一步研究。

圖3 禽流感病毒部分廣東流行毒株BLSOM聚類圖譜

圖4 禽流感病毒廣東株HA基因測(cè)試樣本的BLSOM圖譜

3 結(jié)語(yǔ)

BLSOM對(duì)宿主依賴寡核苷酸進(jìn)行分析，在海量基因數(shù)據(jù)內(nèi)找出序列變異方向，監(jiān)測(cè)動(dòng)物和人類高危毒株，是病毒分子進(jìn)化研究的重要議題［9］，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。利用不同年代的序列數(shù)據(jù)分析毒株來源，找出特定時(shí)間的關(guān)鍵變異，掌握病毒進(jìn)化史，即在不同流行時(shí)期的特點(diǎn)，研究其變異方向和防控方法。在本研究中H5N1毒株年代變異較大，BLSOM圖譜顯著不同。將BLSOM作為病毒預(yù)警和溯源工具，做到全自動(dòng)大規(guī)模研究尚待深入進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 宋建德，朱迪國(guó)，袁麗萍，等. 2013年全球禽流感流行狀況［J］. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2014，31（6）：6-9.

［2］ 陸巧芬，曹建偉，馮秀紅，等. 廣東江門地區(qū)2011-2013年活禽交易市場(chǎng)禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析［J］. 廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014，39（4）：18-19.

［3］ 魯恩潔，陳藝韻，劉靜雯，等. 2013年廣州市禽流感職業(yè)暴露人群及市場(chǎng)環(huán)境禽流感病毒H7N9監(jiān)測(cè)分析［J］. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2014，30（9）：980-984.

［4］ 陸劍云，魯恩潔，李魁彪，等. 2011—2012 年廣州市禽類經(jīng)營(yíng)環(huán)境職業(yè)人群禽流感監(jiān)測(cè)分析［J］. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2013，29（6）：591-593.

［5］ 朱碧柳，黃國(guó)華，麥煒，等. 2011—2012年肇慶市禽流感職業(yè)暴露人群及外環(huán)境病毒分布監(jiān)測(cè)分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014，14（1）：115-117.

［6］ 李廣偉，嚴(yán)專強(qiáng)，廖昌韜，等. 兩廣地區(qū)2011—2012 年H9N2亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)化分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（3）：461-464.

［7］ 陳兵，馬智超，饒東平，等. 深圳市例人感染H7N9禽流感的流行病學(xué)調(diào)查［J］. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2014，27（21）：2924-2925.

［8］ 孔東鋒，秦彥珉，梅樹江，等. 深圳市2例人感染高致病性禽流感病例流行病學(xué)分析［J］. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2013，29（12）：1390-1392.

［9］ Iwasaki Y，Abe T，Wada K，et al. Prediction of directional changes of Influenza A virus genome sequences with emphasis on pandemic H1N1/09 as a model case［J］. DNA Research，2011，18：125-136.

［10］ Iwasaki Y，Abe T，Wada Y，et al. Novel bioinformatics strategies for prediction of directional sequence changes in influenza virus genomes and for surveillance of potentially hazardous strains［J］. BMC Infectious Diseases，2013，13：386.

［11］ 王小川，史峰，郁磊，等. MATLAB神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)43個(gè)案例分析［M］. 北京：北京航空航天大學(xué)出版社，2013.

［12］ 張學(xué)儒，張鐿鋰，劉林山，等. 基于SOFM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的土地類型分區(qū)嘗試-以青藏高原東部樣帶為例［J］. 地理研究，2013，32（5）：839-847.

［13］ 宋喬喬，柴志欣，鐘金城，等. 禽流感病毒基因的密碼子偏好性及聚類分析［J］. 生物技術(shù)，2014，24 （2）：48-53.

（責(zé)任編輯 鄒移光）

Development of neural networks for batch-learning selforganizing map（BLSOM）clustering of hemagglutinin genes of avian influenza viruses isolated from Guangdong province

TIAN Chun-jian，LUO Qiong，GAO Jia-hui，LIN Zhi-xiong，YU Hai-qiong，LIU Zhi-ling，CHEN Ru，WU Xiao-wei
（Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center/Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal and Plant and Food Import And Export Technology/AQSIQ State Key Laboratory of Avian Influenza，Guangzhou 510623，China）

Abstract：A neural network classification method，a batch-learning self-organizing map（BLSOM），was established using 25 tri- and tetranucleotide in the hemagglutinin gene sequences of 25 avian influenza viruses isolated from Guangdong province. Statistics and normalization of the fragment numbers were done and MATLAB function was used to simulate the human brain thinking for self-organizing learning. When the training step was 100 and above，the strains could be successfully clustered. H1，H3， H5， H7 and H9 subtype strains were mainly classified as a class， in which the HA gene cluster profiles of H3N2 and H7N9 strains had highly similar，suggesting that these isolates origin ated from the same era；different generations of H5N1，H1N1 and H9N2 strains were quite different； each one strain of two types was clustered into one group，suggesting that the two virus had recombinant variants， to provide reference for screening high-risk strains and traceability.

Key words：avian influenza virus；batch-learning self-organizing map；hemagglutinin gene；neural networks；classification

中圖分類號(hào)：S852.65+9.3；S858.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）02-0156-05

收稿日期：2015-08-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫科研項(xiàng)目（2015IK054）；科技部國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2012YQ09019705）

作者簡(jiǎn)介：田純見（1965-），男，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，E-mail：gzvettian＠163.com