古典H1N1亞型豬流感病毒PB2 K627E突變對(duì)病毒復(fù)制能力的影響

汪秀會(huì)，宮曉倩，阮寶陽(yáng)，2，劉曉敏，汪　琪，張　鵬，2，李澤君，周艷君，童　武，鄭　浩，童光志*，于　海*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000)

?

古典H1N1亞型豬流感病毒PB2 K627E突變對(duì)病毒復(fù)制能力的影響

汪秀會(huì)1，宮曉倩1，阮寶陽(yáng)1，2，劉曉敏1，汪琪1，張鵬1，2，李澤君1，周艷君1，童武1，鄭浩1，童光志1*，于海1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000)

摘要：旨在探索古典H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1) PB2 K627E突變對(duì)病毒復(fù)制能力的影響。利用反向遺傳操作技術(shù)和點(diǎn)突變技術(shù)成功獲得古典H1N1亞型豬流感病毒的拯救株(627K)和突變株(627E)后，分別在MDCK細(xì)胞和小鼠體內(nèi)對(duì)拯救株和突變株的復(fù)制能力進(jìn)行比較。體外MDCK細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株與拯救株相比，細(xì)胞病變(CPE)減小、空斑形態(tài)減小、生長(zhǎng)曲線差異極其顯著，表明突變株在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力減弱。小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株對(duì)小鼠體重變化的影響不明顯，在小鼠肺中的病毒滴度明顯下降，引起病理?yè)p傷較輕。體外MDCK細(xì)胞及小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果均表明，突變株與拯救株相比復(fù)制能力降低。該結(jié)果不僅證實(shí)了豬流感病毒 PB2 627位氨基酸是一種重要的毒力分子標(biāo)記，同時(shí)還為進(jìn)一步闡明其致病機(jī)制提供了條件。

關(guān)鍵詞：古典H1N1亞型豬流感病毒；PB2 K627E突變；體外MDCK細(xì)胞試驗(yàn)；小鼠攻毒試驗(yàn)；復(fù)制能力

豬流感(swine influenza，SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的以咳嗽、流涕、噴嚏、高燒、昏睡、呼吸困難和食欲下降等[1]為主要特征的豬的一種常見病。該病一年四季均可發(fā)生，并可繼發(fā)或同時(shí)感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬偽狂犬、流行性腹瀉等[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于在豬的呼吸道上皮細(xì)胞同時(shí)具有禽流感病毒受體SAα-2，3-Gal和人流感病毒受體SAα-2，6-Gal，豬可以同時(shí)被禽流感病毒、豬流感病毒和人流感病毒感染。因此，豬被認(rèn)為是禽流感病毒和人流感病毒的中間宿主和發(fā)生基因重組的“混合器”[3]。豬對(duì)流感病毒的生態(tài)分布和遺傳演變起著舉足輕重的作用，成為流感病毒在“禽-豬-人”種間傳播鏈中的重要環(huán)節(jié)。目前，在世界范圍內(nèi)已從豬體內(nèi)分離出的流感病毒約有14種不同的亞型，其中主要為H1N1、H3N2和 H1N2三種[4-6]。

導(dǎo)致流感病毒致病性的因素很多，病毒蛋白在其中扮演著不可忽視的角色，其中的PB2 627位氨基酸被公認(rèn)為流感病毒的一種重要的毒力分子標(biāo)記[7-8]，且具有宿主特異性[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的流感病毒PB2第627位所編碼的氨基酸不同。分離得到的禽流感病毒的PB2 627位氨基酸通常為谷氨酸(E)，人源或豬源流感病毒該位點(diǎn)大多數(shù)為賴氨酸(K)，當(dāng)該位點(diǎn)編碼的氨基酸由E突變?yōu)镵后，病毒的聚合酶活性會(huì)明顯升高，病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力也明顯增強(qiáng)。當(dāng)將K突變?yōu)镋后，病毒的復(fù)制能力及致病性明顯減弱，在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中的毒力明顯降低[10]。本研究中所選用的毒株為古典H1N1亞型SIV，其PB2 627位編碼的氨基酸為K，為了探索該位點(diǎn)的氨基酸由K突變?yōu)镋后，其致病性及在體內(nèi)外復(fù)制能力會(huì)發(fā)生怎樣的變化，作者進(jìn)行了一系列試驗(yàn)。

1材料與方法

1.1毒株、菌種及細(xì)胞

古典H1N1亞型SIV A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)(簡(jiǎn)稱G11)的八質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)由作者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京天根生物有限公司。293T 細(xì)胞，MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

4%多聚甲醛，低熔點(diǎn)瓊脂糖，TPCK，5%結(jié)晶紫，0.5%雞紅細(xì)胞，PBS，DMEM培養(yǎng)基、FBS、BSA、2×MEM均購(gòu)自GIBCO 公司(美國(guó))?？股赜勺髡邔?shí)驗(yàn)室保存。

1.3主要儀器

電子天平，組織破碎儀，Nikon TS100 倒置顯微鏡(Nikon公司)，生物安全柜(Forma-scientific 公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma-scientific 公司)，eppendorf 8道和12道排槍，乙醚，50 mL離心管，低溫水平離心機(jī)。

1.4拯救株病毒和突變株病毒的獲得

將G11反向遺傳系統(tǒng)的八個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒分別按照1 μg量共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后換液，48 h后吸取上清接種MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集病毒，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行序列測(cè)定，相應(yīng)病毒命名為拯救株。在突變株病毒的拯救過程中，首先要設(shè)計(jì)一對(duì)反向互補(bǔ)的內(nèi)部引物，這對(duì)引物的作用是使PB2基因的1 879—1 881位由AAG突變?yōu)镚AG；通過融合 RT-PCR方法獲得627位氨基酸由K突變?yōu)镋的突變PB2基因，進(jìn)而構(gòu)建它的陽(yáng)性質(zhì)粒；將G11原始毒株的PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS陽(yáng)性質(zhì)粒和突變PB2基因的陽(yáng)性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒的拯救，最后也進(jìn)行序列測(cè)定，相應(yīng)病毒命名為突變株。

1.5細(xì)胞病變的觀察

將拯救株和突變株病毒以同種劑量分別接種到單層鋪滿的MDCK細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在不同時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、36、48、60、72 h)觀察CPE情況。

1.6空斑試驗(yàn)

拯救株和突變株病毒分別用含TPCK的感染液依次稀釋至10-6，然后分別接種于單層鋪滿MDCK細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，充分吸附1 h后，棄去病毒液，每孔加入4 mL配制好的膠(含LMP、MEM、BSA和TPCK等)，待膠凝固后，倒置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察空斑的有無(wú)及大小形態(tài)變化。待空斑形成大小適中(48～72 h)時(shí)，5%龍膽紫染色。

1.7生長(zhǎng)曲線的繪制

拯救株與突變株分別以0.001MOI接種于單層鋪滿且狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞中，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、36、48、60、72 h)收集細(xì)胞上清，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集到的每個(gè)重復(fù)視作一個(gè)單獨(dú)的樣品，將每個(gè)樣品由10-1依次稀釋至10-12后接種于MDCK細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱，72 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并結(jié)合血凝方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8小鼠體重變化及存活率

將拯救株與突變株分別以1.0×105TCID50的攻毒劑量滴鼻接種小鼠，每天同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)稱重兩周，觀察并記錄小鼠體重變化及存活情況，繪制小鼠的體重變化曲線和存活率曲線。

1.9小鼠肺組織病理學(xué)觀察

分別取攻毒后第3天和第5天的試驗(yàn)組及對(duì)照組的小鼠左肺組織，置于注滿4%多聚甲醛的5 mL離心管中，做好標(biāo)記后送公司制備組織病理切片，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.10小鼠肺病毒滴度的檢測(cè)

分別取攻毒后第3天和第5天的試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠右肺組織，充分研磨后離心取上清，在無(wú)菌環(huán)境下倍比稀釋至10-12，接種MDCK細(xì)胞，進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。對(duì)照組小鼠接種的是同種劑量的DMEM，具體操作流程與試驗(yàn)組小鼠一致。

2結(jié)果

2.1古典H1N1亞型SIV G11拯救株及突變株序列分析

利用反向遺傳技術(shù)及點(diǎn)突變技術(shù)，成功獲得了古典H1N1亞型SIV G11拯救株及突變株病毒，提取病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，序列分析結(jié)果表明，拯救株的PB2 627位氨基酸為K，而突變株的PB2 627位氨基酸為E，進(jìn)而證明成功獲得了古典H1N1亞型豬流感病毒的突變株。

2.2不同時(shí)間點(diǎn)MDCK細(xì)胞形態(tài)

不同時(shí)間點(diǎn)MDCK細(xì)胞形態(tài)的觀察結(jié)果(圖1)表明：拯救株與突變株在12 h時(shí)均沒有肉眼可見的CPE；24 h時(shí)拯救株出現(xiàn)CPE，突變株的病變?nèi)匀徊幻黠@；36 h時(shí)，突變株細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的病變，拯救株CPE較明顯；48 h時(shí)，拯救株細(xì)胞約有50%發(fā)生病變，突變株CPE程度輕于拯救株；60 h時(shí)，拯救株與突變株的病變程度均很明顯，但突變株較拯救株相比程度較輕；72 h時(shí)，突變株與拯救株細(xì)胞完全脫落。

2.3空斑形態(tài)

在相同條件下突變株與拯救株分別接種于MDCK細(xì)胞，觀察兩毒株在MDCK細(xì)胞上產(chǎn)生空斑形態(tài)的大小?？瞻咝螒B(tài)觀察結(jié)果(圖2)表明，PB2 K627E突變導(dǎo)致古典H1N1亞型SIV在MDCK細(xì)胞上的空斑形態(tài)變小，含PB2 627E位點(diǎn)的突變株的空斑明顯小于含PB2 627K位點(diǎn)的拯救株，說明突變株在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力弱于拯救株。

2.4拯救株與突變株生長(zhǎng)曲線

古典H1N1亞型豬流感病毒拯救株和突變株分別以相同劑量接種MDCK細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度(TCID50)，利用GraphPad Primer 5.0軟件對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度進(jìn)行差異性分析，結(jié)果(圖3)表明：12 h時(shí)突變株與拯救株的病毒滴度差異不顯著(P>0.05)，24、36、48 h時(shí)突變株與拯救株的病毒滴度差異極其顯著(P<0.001)，60、72 h差異非常顯著(P<0.01)，表明突變株在細(xì)胞上的復(fù)制能力較弱。

2.5小鼠肺病理切片的觀察

分別取攻毒后第3天和第5天左肺組織，制作病理切片，HE染色，由圖4可知，拯救株(A、B)具有明顯的炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)(圖中a黑色箭頭)，在同一視野下可見多個(gè)浸潤(rùn)灶，部分肺泡壁增粗(圖中b紅色箭頭)；突變株(C、D)局部炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞較少，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)正常，支氣管結(jié)構(gòu)正常。病理切片結(jié)果表明，攻毒后第3天和第5天，突變株與拯救株相比，突變株對(duì)小鼠肺組織損傷較輕。

2.6小鼠體重變化及存活率

由圖5和圖6可以看出：突變株(627E)組與對(duì)照組小鼠體重變化差異不顯著(P>0.05)，說明突變株在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力較弱，導(dǎo)致小鼠體重變化不明顯；病毒感染小鼠后第3天至第13天(dpi 3—dpi 13)，與突變株組和對(duì)照組小鼠體重變化情況相比，拯救株接種小鼠體重有明顯的下降，差異極其顯著(P<0.001)，表明拯救株在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力較強(qiáng)；而拯救株在使小鼠體重明顯下降的同時(shí)對(duì)小鼠具有致死性，導(dǎo)致小鼠部分死亡。

A.拯救株(rG11)在MDCK細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48、60、72 h)的CPE；B.突變株(rG11-K627E)在MDCK細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48、60、72 h)的CPEA.CPE of rescued strain in MDCK at different time；B.CPE of and mutant strain in MDCK at different time圖1　H1N1亞型豬流感病毒G11拯救株與突變株6個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDCK CPE(400×)Fig.1　CPE of rescued and mutant strain of G11 at different time(400×)

A.拯救株空斑形態(tài)；B.突變株空斑形態(tài)A.Plaque morphology of rescued strain；B.Plaque morphology of mutant strain圖2　G11拯救株與突變株空斑形態(tài)的觀察和比較Fig.2　The observation and comparison of plaque morphology of rescued and mutant strain

圖3　G11拯救株與突變株生長(zhǎng)曲線的比較Fig.3　The growth curve of the rescued and mutant strain

A.rG11-3 d病理切片；B.rG11-5 d病理切片；C.G11-K627E-3 d病理切片；D.G11-K627E-5 d病理切片；E.對(duì)照組；a.炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)； b.肺泡壁增粗A.rG11-3 d lung pathological；B.rG11-5 d lung pathological；C.G11-K627E-3 d lung pathological；D.G11-K627E-5 d lung pathological；E.Control；a.Focal infiltration of inflammatory cell；b.Thickening of alveolar walls圖4　第3、5天小鼠左肺組織拯救株及突變株病理切片的觀察(200×)Fig.4　The result of the rescued and mutant strains’ left lung pathological(200×)

2.7病毒滴度

利用GraphPad Primer 5.0軟件，對(duì)攻毒后小鼠肺組織的病毒滴度(TCID50)進(jìn)行差異性分析，結(jié)果(圖7)表明：攻毒后第3、5天小鼠右肺組織拯救株和突變株病毒滴度差異極顯著(P<0.001)，說明突變株與拯救株相比在小鼠肺的復(fù)制能力差異顯著，且突變株的復(fù)制能力明顯低于拯救株，而對(duì)照組小鼠未檢測(cè)到病毒。

圖5　G11拯救株與突變株小鼠體重變化情況Fig.5　Body weight changes of mice of the rescued and mutant strain

圖6　拯救株及突變株病毒感染小鼠存活率Fig.6　Survival rate of the mice infected by rescued and mutant strain

圖7　第3、5天小鼠右肺組織拯救株及突變株病毒的滴度檢測(cè)結(jié)果Fig.7　The result of the rescued and mutant strains’ titer of mice’ right lung

3討論

本研究所選用的古典H1N1亞型SIV拯救株的PB2 627位編碼的氨基酸為K，利用點(diǎn)突變技術(shù)將該位點(diǎn)的氨基酸突變?yōu)镋后，分別在MDCK細(xì)胞和小鼠體內(nèi)對(duì)突變前后病毒的復(fù)制能力進(jìn)行了比較。MDCK細(xì)胞試驗(yàn)中，分別在CPE、空斑形態(tài)、病毒滴度、生長(zhǎng)曲線等幾方面進(jìn)行其生物學(xué)特性的比較，結(jié)果表明突變株與拯救株間在體外的生物學(xué)特性差異明顯。與拯救株相比，突變株的CPE較?。辉谕耆嗤瑮l件下，突變株所產(chǎn)生的空斑的形態(tài)較小；且突變株與拯救株相比，其病毒滴度較低，生長(zhǎng)曲線差異極其顯著。同時(shí)，本研究還以BALB/c雌性小鼠為哺乳動(dòng)物模型，為探索拯救株與突變株在體內(nèi)條件下的差異提供了條件。在小鼠攻毒試驗(yàn)中，分別在小鼠體重變化、小鼠肺病毒滴度、小鼠肺病理切片等方面對(duì)拯救株與突變株生物學(xué)特性間的差異進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，拯救株能夠?qū)е滦∈篌w重明顯下降甚至死亡，而突變株使小鼠體重下降不明顯，攻毒至第13天，小鼠的適應(yīng)性增強(qiáng)，體重恢復(fù)并不斷增加；小鼠肺病毒滴度差異極其顯著；肺病理切片的結(jié)果表明兩毒株對(duì)小鼠致病性差異不顯著，但突變株與拯救株相比致病性較弱。從而表明PB2 627K是影響古典H1N1亞型SIV復(fù)制能力的重要因素之一 。

研究發(fā)現(xiàn)，人流感病毒PB2 627位氨基酸為K而禽源流感病毒該位點(diǎn)為E[11]。分離于北美的SIV，于1998年之前分離得到的大多數(shù)PB2 627位氨基酸為K，而1998年之后分離的絕大多數(shù)為E[12]。禽源流感病毒PB2 627位氨基酸為E，但病毒仍具有較強(qiáng)的感染性，究其原因是該位點(diǎn)與其他位點(diǎn)的相互作用[13]有關(guān)。SIV PB2 627位氨基酸由K突變?yōu)镋后，病毒的復(fù)制能力及致病性明顯降低，在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中的毒力明顯減弱，究其原因，這可能是由于PB2 627位氨基酸影響著病毒RNA復(fù)制的溫度敏感性決定的[14]。不同來(lái)源的流感病毒復(fù)制時(shí)所需的最適宜的溫度不同，人/豬流感病毒在上呼吸道復(fù)制，最適宜溫度約33 ℃，而禽流感病毒在禽類腸道中復(fù)制的最適宜的溫度為41 ℃左右。也就是說，當(dāng)PB2 627為E 時(shí)，該病毒在哺乳動(dòng)物的上呼吸道是不能進(jìn)行復(fù)制或者說復(fù)制效率很低[15]。有研究報(bào)道，PB2 627E之所以對(duì)低溫敏感，可能是因?yàn)榈蜏貤l件下PB2和NP蛋白之間的相互作用受到了破壞[16]，也可能是與細(xì)胞內(nèi)某些限制因子[17]或者某些宿主因子有關(guān)[18]，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SIV分子致病機(jī)制的研究比較少，主要研究仍然集中于人流感病毒和禽流感病毒。本研究通過對(duì)古典H1N1亞型SIV拯救株和突變株在體外和體內(nèi)條件下生物學(xué)特性的比較，解析了古典H1N1亞型SIV在體外及體內(nèi)的致病機(jī)制，彌補(bǔ)了該方面的不足，同時(shí)也為古典H1N1亞型SIV PB2 627位氨基酸的分子致病機(jī)制提供了一定的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]YU H，ZHANG G H，HUA R H，et al.Isolation and genetic analysis of human origin H1N1 and H3N2 influenza viruses from pigs in China[J].BiochemBiophysResCommun， 2007，356(1)：91-96.

[2]ELLIS J.Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field[J].VetMicrobiol， 2004，98(2)：159-163.

[4]MA W，VINCENT A L，GRAMER M R，et al.Identification of H2N3 influenza A viruses from swine in the United States[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2007，104(52)：20949-20954.

[5]陳義祥，蒙雪瓊.豬流感病毒在世界范圍內(nèi)的流行情況及公共衛(wèi)生意義[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(4)：582-588.

CHEN Y X，MENG X Q.The epidemiology of swine influenza virus in the world and its public health implication[J].Microbiology， 2008，35(4)：582-588.(in Chinese)

[6]唐續(xù)，楊煥良，鄢明華，等.一株人源H1N1亞型豬流感病毒的進(jìn)化分析與生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(4)：270-273，336.

TANG X，YANG H L，YAN M H，et al.Evolution analysis and biological characteristics of a human origin H1N1 subtype swine influenza virus[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine， 2012，34(4)：270-273，336.(in Chinese)

[7]HATTA M，GAO P，HALFMANN P，et al.Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses[J].Science， 2001，293(5536):1840-1842.

[8]SUBBARAO E K，LONDON W，MURPHY B R.A single amino acid in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range[J].JVirol， 1993，67(4):1761-1764.

[9]ALMOND J W.A single gene determines the host range of influenza virus[J].Nature， 1977，270(5638):617-618.

[10]ITOH Y，SHINYA K，KISO M，et al.Invitroandinvivocharacterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses[J].Nature，2009，460(7258):1021-1025.

[11]CHEN G W，CHANG S C，MOK C K，et al.Genomic signatures of human versus avian influenza A viruses[J].EmergInfectDis，2006，12(9):1353-1360.

[12]BUSSEY K A，BOUSSE T L，DESMET E A，et al.PB2 residue 271 plays a key role in enhanced polymerase activity of influenza A viruses in mammalian host cells[J].JVirol， 2010，84(9):4395-4406.

[13]LI J，ISHAQ M，PRUDENCE M，et al.Single mutation at the amino acid position 627 of PB2 that leads to increased virulence of an H5N1 avian influenza virus during adaptation in mice can be compensated by multiple mutations at other sites of PB2[J].VirusRes， 2009，144(1-2):123-129.

[14]MASSIN P，VAN DER WERF S，NAFFAKH N.Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses[J].JVirol，2001，75(11)：5398-5404.

[15]HATTA M，HATTA Y，KIM J H，et al.Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice[J].PLoSPathog，2007，3(10)：1374-1379.[16]RAMEIX-WELTI M A，TOMOIU A，DOS SANTOS AFONSO E，et al.Avian influenza A virus polymerase association with nucleoprotein，but not polymerase assembly，is impaired in human cells during the course of infection[J].JVirol，2009，83(3)：1320-1331.

[17]MEHLE A，DOUDNA J A.An inhibitory activity in human cells restricts the function of an avian-like influenza virus polymerase[J].CellHostMicrobe，2008，4(2)：111-122.

[18]MONCORGé O，MURA M，BARCLAY W S.Evidence for avian and human host cell factors that affect the activity of influenza virus polymerase[J].JVirol，2010，84(19)：9978-9986.

(編輯白永平)

The Effect of PB2 K627E Mutation on the Replication Competence of Classical H1N1 Subtype Swine Influenza Virus

WANG Xiu-hui1，GONG Xiao-qian1，RUAN Bao-yang1，2，LIU Xiao-min1，WANG Qi1，ZHANG Peng1，2，LI Ze-jun1，ZHOU Yan-jun1，TONG Wu1，ZHENG Hao1，TONG Guang-zhi1*，YU Hai1*

(1.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai200241，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271000，China)

Abstract:This experiment was conducted to explore the effect of PB2 K627E mutation on the replication competence of classical H1N1 subtype swine influenza virus(A/Swine/Guangdong/1/2011).The rescued and mutant strains of classical H1N1 subtype swine influenza virus were obtained by reverse genetics and point mutation technology，and researches were taken on MDCK cells and mice.The results on MDCK cells showed that，compared with the rescued strain，the mutant virus had a slight degree of CPE；the morphology of plaque of mutant virus was much smaller；the growth curve showed that it had a significant distinct difference.The results of experiments in mice showed that the mutant strain had a low pathogenicity and could not lead the mice loss weight，and virus titer in lung tissues on the 3rd and 5th day post challenge showed that there was a significant distinct difference between the two strains and the pathological damage caused by mutant one was not serious.The results on MDCK and mice both showed that the mutant strain’s replication competence was lower than the rescued one.This conclusion demonstrates that the amino acid of PB2 627 is not only one of the important virulence markers，but also provided the condition to further clarify its pathogenic mechanism.

Key words:classical H1N1 subtype swine influenza；PB2 K627E mutation；vitroexperiment in MDCK cells；vivoexperiment in mice；virus replication

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.017

收稿日期：2015-08-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家青年自然科學(xué)基金(31201916)；上海市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(12ZR1453500)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2015JB07)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程科研團(tuán)隊(duì)“動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)”項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：汪秀會(huì)(1988- )，女，山東聊城人，碩士生，主要從事豬流感病毒分子致病機(jī)制的研究，E-mail：wangxiuhui123@163.com *通信作者：童光志，研究員，E-mail：gztong@shvri.ac.cn；于海，副研究員，E-mail：haiyu@shvri.ac.cn

中圖分類號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0543-06