鼠傷寒沙門菌cpxR和acrB雙基因缺失菌株的構(gòu)建及其對(duì)抗菌藥物敏感性分析

黃　慧，劉保光，孫亞偉，馬彩琿，陳麗鵬，苑　麗，潘玉善，胡功政*

(1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453001)

?

鼠傷寒沙門菌cpxR和acrB雙基因缺失菌株的構(gòu)建及其對(duì)抗菌藥物敏感性分析

黃慧1，劉保光1，孫亞偉2，馬彩琿1，陳麗鵬1，苑麗1，潘玉善1，胡功政1*

(1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453001)

摘要：為了探索cpxR基因?qū)κ髠抽T菌多重耐藥性的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)避免外排泵acrB的存在掩蓋cpxR對(duì)其他外排泵或外膜蛋白的調(diào)控作用，利用基于Red同源重組系統(tǒng)的一步法失活染色體基因，用含有同源臂的線性打靶DNA片段替換目的基因，構(gòu)建鼠傷寒沙門菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，以前期構(gòu)建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan為供體菌，本研究新構(gòu)建的JSΔacrB為受體菌，在P22噬菌體的作用下構(gòu)建雙基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan，同時(shí)制備cpxR基因回補(bǔ)菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀釋法測(cè)定10種臨床常用代表性抗菌藥物對(duì)JS和各缺失株的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明,成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌的雙基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互補(bǔ)菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC結(jié)果顯示，acrB基因缺失后，多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松和頭孢噻呋的MIC值分別降低32、4、4、16、32、4、2和128倍；雙基因缺失后，多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋的MIC值進(jìn)一步降低2、8、2和2倍；而將cpxR基因回補(bǔ)之后，這4種抗菌藥物的MIC值會(huì)升高4、16、2和4倍。結(jié)果表明，cpxR能調(diào)控鼠傷寒沙門菌對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋的敏感性。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌；cpxR；acrB；雙基因缺失；MIC

CpxAR系統(tǒng)是革蘭陰性菌中普遍存在的與耐藥性和致病性相關(guān)的一種雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCS)，其應(yīng)答調(diào)控子CpxR含有多個(gè)可與不同的DNA序列特異性結(jié)合的位點(diǎn)[1]，可有選擇地上調(diào)或下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控細(xì)菌的生命活動(dòng)。有研究顯示，CpxR可調(diào)控大腸桿菌對(duì)新生霉素、卡那霉素[2]以及部分β-內(nèi)酰胺類抗生素[3](苯唑西林、頭孢美唑等六種藥物)的耐藥性。W.S.Hu等[4]將鼠傷寒沙門菌頭孢曲松耐藥菌株R200的cpxAR敲除后，發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)頭孢菌素、頭孢羥唑的耐藥性明顯降低，對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、慶大霉素等藥物的耐藥性也有不同幅度的降低。T.F.Mahoney等[5]的研究顯示，CpxR磷酸化后能降低氨基糖苷類藥物和羥基脲的敏感性。這些初步表明：CpxAR對(duì)細(xì)菌多重耐藥性(multidrug resistance，MDR)有重要調(diào)控作用。

主動(dòng)外排系統(tǒng)是MDR形成的一個(gè)重要機(jī)制，陰性菌中有多個(gè)外排系統(tǒng)與MDR有關(guān)，其中AcrAB-TolC是MDR形成最重要的外排系統(tǒng)。現(xiàn)有的研究表明：acrAB的表達(dá)不受任何雙組份調(diào)控子的調(diào)控[2]，不同的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)MDR的調(diào)控是通過調(diào)控acrB以外的其他外排泵來實(shí)現(xiàn)[2，6-8]，但acrB的存在和表達(dá)可能會(huì)掩蓋其他外排系統(tǒng)的作用[9]。H.Hirakawa等[2]的研究發(fā)現(xiàn)在acrB缺失大腸桿菌中，cpxR可上調(diào)外排泵acrD的表達(dá)量。W.S.Hu等[4]的研究發(fā)現(xiàn)cpxAR的缺失可影響外排泵acrD和acrF的表達(dá)量。而K.Nishino等[10]的研究發(fā)現(xiàn)BaeSR、AcrD和MdtABC對(duì)耐藥性的調(diào)控作用只能在acrB缺失菌中被觀察到。目前未見有鼠傷寒沙門菌acrB缺失時(shí)，研究cpxR對(duì)細(xì)菌抗菌藥物敏感性影響的報(bào)道。作者前期已將鼠傷寒沙門菌cpxR基因敲除并進(jìn)行了回補(bǔ)試驗(yàn)，初步證實(shí)了cpxR可影響鼠傷寒沙門菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的頭孢曲松和頭孢噻呋以及氨基糖苷類的阿米卡星和慶大霉素的敏感性。本研究為避免acrB的存在掩蓋cpxR對(duì)其他外排泵或外膜蛋白的調(diào)控作用，構(gòu)建cpxR和acrB雙基因缺失株，并分析該缺失株對(duì)抗菌藥物敏感性的變化，為闡明cpxR調(diào)控鼠傷寒沙門菌MDR作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌種(CVCC541，以下命名為JS)：本實(shí)驗(yàn)室保存，源自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；質(zhì)控菌：大腸埃希菌ATCC?25922，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心；pKD4質(zhì)粒、pKD46質(zhì)粒、pCP20質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)室保存；沙門菌噬菌體P22HT105/int：河南科技學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2主要試劑和藥品

LB肉湯、LB瓊脂、MH肉湯等培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；BM5000 DNA Marker購(gòu)自北京Biomed公司；PrimerSTAR Max Premix(2×)購(gòu)自TaKaRa公司；pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物有限公司；PCR引物由上海生工公司合成；氨芐青霉素、卡那霉素購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；多西環(huán)素、土霉素、慶大霉素、阿米卡星、喹乙醇、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢噻呋均為國(guó)產(chǎn)原料藥，符合中國(guó)藥典或中國(guó)獸藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用前置4 ℃冰箱保存，使用時(shí)均在有效期之內(nèi)。

1.3acrB基因缺失株的構(gòu)建

1.3.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的鼠傷寒沙門菌acrB基因全序列(HG326213.1)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，其中LBF/LBR為acrB基因敲除引物(其5′末端的部分序列與acrB兩側(cè)序列同源，靠近3′末端的部分序列與質(zhì)粒pKD4上kan兩側(cè)序列互補(bǔ))，用于同源重組；BF/BR為acrB敲除鑒定引物，用于檢測(cè)acrB缺失突變株；Cr-F/Cr-R為cpxR基因失活鑒定引物，與BF/BR同時(shí)用來鑒定cpxR和acrB雙基因缺失突變株，引物序列見表1。

1.3.2一步法失活acrB基因[11]以pKD4質(zhì)粒為模板，用LBF/LBR引物擴(kuò)增兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的kan及acrB兩側(cè)同源臂的線性融合PCR產(chǎn)物(線性打靶DNA片段)。將編碼Red重組系統(tǒng)的pKD46質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到JS感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)10 mmol·L-1的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后，將線性融合PCR產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化入JS/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，在kanr(25 μg·mL-1)的LB平板上篩選重組突變體。將陽(yáng)性重組突變體置42 ℃培養(yǎng)6 h，再在LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選出僅在kanr的LB中生長(zhǎng)的突變體，即為帶有kan基因的acrB缺失突變體JSΔacrB∷kan，此時(shí)質(zhì)粒pKD46被消除。將pCP20質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入JSΔacrB∷kan，42 ℃振蕩培養(yǎng)6 h后，篩選無(wú)ampr和kanr的突變體，此突變體kan基因被消除，只剩下一個(gè)FRT位點(diǎn)，即JSΔacrB。最后以其基因組DNA為模板，用JS做對(duì)照，用BF/BR引物進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。

表1　鼠傷寒沙門菌cpxR基因同源重組引物

帶下劃?rùn)M線的堿基為同源臂

The underlined bases are the homologous arms

1.4cpxR和acrB雙基因缺失株的構(gòu)建

利用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)[12]，以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的kan替代cpxR基因后的菌株JSΔcpxR∷kan為供體菌，JSΔacrB為受體菌，制備雙基因缺失菌株(圖1)。

1.4.1噬菌體增殖挑取JS單個(gè)菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，使其濃度達(dá)到108CFU·mL-1。取噬菌體原液100 μL加入到10 mL細(xì)菌培養(yǎng)液中，37 ℃靜置20 min，使噬菌體吸附細(xì)菌，后置37 ℃振蕩培養(yǎng)5～8 h，可見細(xì)菌被裂解。加入100 μL氯仿，振蕩混勻，離心取上清液用0.22 μm濾膜過濾，即得較純的噬菌體，4 ℃保存。將噬菌體增殖液與LB瓊脂制成雙層瓊脂培養(yǎng)板，觀察噬菌斑的形成并進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)。

1.4.2含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒的制備挑取供體菌JSΔcpxR∷kan單個(gè)菌落接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，后加入適量的噬菌體增殖液，37 ℃靜置20 min后振蕩培養(yǎng)5～8 h，制備出含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒。

1.4.3噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)挑取受體菌JSΔacrB單菌落接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，取10 μL含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒與190 μL過夜培養(yǎng)的受體菌JSΔacrB菌液混合，室溫靜置20 min，后加入1 mL LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min。離心收集細(xì)菌沉淀，用100 μL LB肉湯培養(yǎng)基懸浮，后涂布于的kanr(50 μg·mL-1)LB瓊脂平板上，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)子。

1.4.5轉(zhuǎn)導(dǎo)子的鑒定挑取篩選平板上的單克隆接種于5 mLkanr(50 μg·mL-1)的LB肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物見表1。同時(shí)將PCR產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序以驗(yàn)證。

H1、H2.同源臂；LBF/LBR.擴(kuò)增線性打靶DNA片段的引物；Cr-F/Cr-R.鑒定cpxR缺失的引物；BF/BR.鑒定acrB缺失的引物H1，H2.Homologous arms；LBF/LBR.Primers for the amplification of the linear target DNA fragment；Cr-F/Cr-R.Primers for the confirmation of cpxR deletion；BF/BR.Primers for the confirmation of acrB deletion圖1　雙基因缺失過程及引物使用策略Fig.1　The strategy of two gene deletion and the using of primers

1.5cpxR基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

將事先構(gòu)建好的pBAD-CpxR表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入雙基因缺失菌株中，獲得回補(bǔ)菌株，命名為JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。

1.6MIC值的測(cè)定

用微量肉湯稀釋法[13-14]測(cè)定10種抗菌藥物多西環(huán)素、土霉素、慶大霉素、阿米卡星、喹乙醇、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢噻呋對(duì)JS、JSΔacrB、JSΔacrBΔcpxR∷kan和JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR的最小抑菌濃度(MIC)，質(zhì)控菌為大腸桿菌ATCC?25922，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2結(jié)果

2.1acrB基因缺失株的鑒定

用引物BF/BR對(duì)acrB基因敲除前后的菌株JS和JSΔacrB進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出大小為4 000 bp左右和1 400 bp左右的片段，如圖2。同時(shí)測(cè)序結(jié)果也證明acrB被成功敲除，只剩83 bp的殘留FRT位點(diǎn)。

2.2cpxR和acrB雙基因缺失株的鑒定

2.2.1噬菌斑的形成噬菌體增殖后，在雙層瓊脂培養(yǎng)板上形成明顯的噬菌斑，如圖3。

M.BM5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.用BF/BR引物擴(kuò)增JS的acrB基因；2.用BF/BR引物擴(kuò)增JSΔacrB的acrB基因缺失后的片段M.BM5000 DNA marker；1. acrB gene amplified from JS by primers BF/BR；2.The fragment amplified from JSΔacrB by primers BF/BR圖2　acrB基因缺失株的PCR鑒定Fig.2　Identification of acrB gene deletion by PCR

2.2.2轉(zhuǎn)導(dǎo)子的篩選與鑒定含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒與受體菌JSΔacrB混合培養(yǎng)后，在kanr(50 μg·mL-1)LB瓊脂平板上長(zhǎng)出kanr的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，如圖4A所示，說明噬菌粒已將ΔcpxR∷kan片段傳導(dǎo)給受體菌JSΔacrB。挑取轉(zhuǎn)導(dǎo)子的單克隆，用cpxR缺失，鑒定引物Cr-F/Cr-R和acrB缺失鑒定引物BF/BR分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖電泳均出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，如圖4B。同時(shí)測(cè)序結(jié)果也證實(shí)篩選的轉(zhuǎn)導(dǎo)子為cpxR和acrB雙基因缺失株。

2.3藥敏試驗(yàn)

圖3　噬菌體P22HT105/int侵染鼠傷寒沙門菌后形成的噬菌斑Fig.3　The plaques assay after the infection of Salmonella Typhimurium by P22HT105/int

藥敏試驗(yàn)中，質(zhì)控菌大腸桿菌ATCC?25922對(duì)所有抗菌藥物均敏感，每種抗菌藥物的MIC值均在CLSI[13-14]允許的范圍內(nèi)(喹乙醇暫無(wú)質(zhì)控菌的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù))。acrB缺失后，與親本菌JS相比，對(duì)多種抗菌藥物的敏感性均明顯升高，多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松和頭孢噻呋的MIC值分別降低了32、4、4、16、32、4、2和128倍；雙基因缺失后，其中4種抗菌藥物(多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋)的MIC值分別又降低了2、8、2和2倍；而將cpxR基因回補(bǔ)到雙基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan中后，這4種抗菌藥物的 MIC值分別升高了4、16、2和4倍，且頭孢曲松的MIC也升高了2倍(表2)。

A.kanr平板上白色菌落即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)子所形成的菌落；B.PCR鑒定； M.BM5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1.引物Cr-F/Cr-R擴(kuò)增菌株JSΔcpxR∷kan所得產(chǎn)物；2.引物BF/BR擴(kuò)增菌株JSΔcpxR∷kan所得片段；3.引物 Cr-F/Cr-R 擴(kuò)增菌株JSΔacrB所得產(chǎn)物；4.引物BF/BR擴(kuò)增菌株JSΔacrB所得片段；5.用引物Cr-F/Cr-R 擴(kuò)增菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan所得片段；6.引物BF/BR 擴(kuò)增JSΔacrBΔcpxR∷kan所得片段A.Positive transductants grow on the kanamycin resistant plate；B.PCR；M.BM5000 DNA marker；1.The fragment amplified from JSΔcpxR∷kan by primers Cr-F/Cr-R；2.The fragment amplified from JSΔcpxR∷kan by primers BF/BR；3.The fragment amplified from JSΔacrB by primers Cr-F/Cr-R；4.The fragment amplified from JSΔacrB by primers BF/BR；5.The fragment amplified from JSΔacrBΔcpxR∷kan by primers Cr-F/Cr-R；6.The fragment amplified from JSΔacrBΔcpxR∷kan by primers BF/BR圖4　轉(zhuǎn)導(dǎo)子的篩選與PCR鑒定Fig.4　Screening and confirmation of the transductants by PCR

表2　雙基因缺失株對(duì)10種臨床常用代表藥物的敏感性檢測(cè)(MIC)

a不加誘導(dǎo)劑和0.2%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)

aStrain was uninduced or induced by 0.2% L-arabinose

3討論

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為基因精細(xì)結(jié)構(gòu)分析的常用方法，它是以噬菌體為媒介將一個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移給另一個(gè)細(xì)胞的過程。作者首先利用基于λ噬菌體短同源序列重組功能的Red同源重組系統(tǒng)分別構(gòu)建鼠傷寒沙門菌cpxR缺失株和acrB缺失株，然后利用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，在P22噬菌體的作用下將cpxR失活片段轉(zhuǎn)移給acrB缺失株，成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌cpxR和acrB雙基因缺失菌株。該方法不需要限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶，不需要復(fù)雜的體外重組操作，高效、簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)。

本研究中，鼠傷寒沙門菌acrB缺失后，其對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋的敏感性均明顯增強(qiáng)，尤其是對(duì)多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和頭孢噻呋(MIC值降低16～128倍)。多重耐藥泵acrB具有廣泛的底物，包括氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等[15]。S.Baucheron等的研究發(fā)現(xiàn)acrB在鼠傷寒沙門菌的氟喹諾酮類藥物抗性中發(fā)揮重要作用，acrB的失活可使恩諾沙星耐藥性降低32倍[16]。孟春萍[17]在鴨源大腸桿菌中缺失acrB時(shí)，發(fā)現(xiàn)慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素的MIC值分別降低2、133、8、66、16倍。本研究在鼠傷寒沙門菌中敲除acrB后MIC變化與以往的報(bào)道基本一致，說明acrB作為最主要的外排泵對(duì)鼠傷寒沙門菌MDR形成尤其是氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性形成中發(fā)揮重要作用。在acrB基因缺失中同時(shí)缺失cpxR基因時(shí)，菌株對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋這四種藥物的敏感性進(jìn)一步升高(2～8倍)，土霉素和頭孢曲松分別與多西環(huán)素和頭孢噻呋屬同一類藥物，而它們的敏感性卻未發(fā)生變化，可能是因?yàn)閏pxR對(duì)MDR的調(diào)控是通過調(diào)控外排泵和外膜蛋白來實(shí)現(xiàn)的，而相關(guān)的外排泵或外膜蛋白對(duì)同一類的不同藥物的外排能力和滲透能力可能不同；在acrB和cpxR雙基因缺失株中將cpxR回補(bǔ)后，菌株對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松和頭孢噻呋的敏感性卻有不同程度的降低(2～16倍)。這一結(jié)果說明cpxR可調(diào)控鼠傷寒沙門菌對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋的敏感性。前期通過構(gòu)建cpxR基因缺失株進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)cpxR可影響鼠傷寒沙門菌對(duì)慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松和頭孢噻呋的敏感性，本研究通過構(gòu)建acrB和cpxR雙基因缺失株后進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)cpxR還可影響鼠傷寒沙門菌對(duì)多西環(huán)素的敏感性。

K.Nishino等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌TCS中的應(yīng)答調(diào)控子可通過調(diào)控一些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)而調(diào)控細(xì)菌的MDR，例如，大腸桿菌雙組分調(diào)控子EvgA可上調(diào)藥物外排基因emrKY、yhiUV的表達(dá)[6-7]，BeaR可上調(diào)控外排泵acrD和mdtABC的表達(dá)[2，8]。沙門菌的9個(gè)功能性藥物外排泵中，acrB是MDR形成最重要的外排泵，acrD被證實(shí)是調(diào)控大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類敏感性的重要外排泵[18]，也有研究證實(shí)大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類敏感性主要受依賴TolC的5種RND家族外排系統(tǒng)(acrAB、acrD、acrEF、mdtABC、mdtEF)的協(xié)調(diào)調(diào)控[9]，W.S.Hu等[4]發(fā)現(xiàn)cpxAR可影響外排泵acrD、acrF以及部分外膜蛋白的表達(dá)量。本試驗(yàn)中cpxR缺失后，菌株對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松和頭孢噻呋的MIC值降低，可能與其調(diào)控外排泵acrD及外膜蛋白的表達(dá)量有關(guān)。然而，cpxR具體是調(diào)控哪些外排泵或外膜蛋白基因以及其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

構(gòu)建鼠傷寒沙門菌JS株的cpxR和acrB雙基因缺失株，并分析其對(duì)抗菌藥物敏感性的變化。發(fā)現(xiàn)cpxR能調(diào)控鼠傷寒沙門菌對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋的敏感性。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]STEPHENSON K，HOCH J A.Two-component and phosphorelay signal-transduction systems as therapeutic targets[J].CurrOpinPharmacol，2002，2(5)：507-512.

[2]HIRAKAWA H，NISHINO K，HIRATA T，et al.Comprehensive studies on the drug resistance mediated by overexpression of response regulators of two-component signal transduction systems inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2003，185(6)：1851-1856.

[3]HIRAKAWA H，NISHINO K，YAMADA J，et al.β-lactam resistance modulated by the overexpression of response regulators of two-component signal transduction systems inEscherichiacoli[J].JAntimicrobChemother，2003，52(4)：576-582.

[4]HU W S，CHEN H W，ZHANG R Y，et al.The expression levels of outer membrane proteins STM1530 and OmpD，which are influenced by the CpxAR and BaeSR two-component systems，play important roles in the ceftriaxone resistance ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium[J].AntimicrobAgentsChemother，2011，55(8)：3829-3837.

[5]MAHONEY T F，SILHAVY T J.The Cpx stress response confers resistance to some，but not all，bactericidal antibiotics[J].JBacteriol，2013，195(9)：1869-1874.

[6]NISHINO K，YAMAGUCHI A.EvgA of the two-component signal transduction system modulates production of the yhiUV multidrug transporter inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2002，184(8)：2319-2323.

[7]NISHINO K，YAMAGUCHI A.Overexpression of the response regulator evgA of the two-component signal transduction system modulates multidrug resistance conferred by multidrug resistance transporters[J].JBacteriol，2001，183(4)：1455-1458.

[8]NAGAKUBO K，NISHINO K，HIRATA T，et al.The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance ofEscherichiacolivia a novel multidrug exporter system，MdtABC[J].JBacteriol，2002，184(15)：4161-4167.

[9]NISHINO K，YAMADA J，HIRAKAWA H，et al.Roles of TolC-dependent multidrug transporters ofEscherichiacoliin resistance to β-lactams[J].AntimicrobAgentsChemother，2003，47(9)：3030-3033.

[10]NISHINO K，NIKAIDO E，YAMAGUCHI A.Regulation of multidrug efflux systems involved in multidrug and metal resistance ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium[J].JBacteriol，2007，189(24)：9066-9075.

[11]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(12)：6640-6645.

[12]DAVIS R W，BOLSTEIN D，ROTH J R.Advanced bacterial genetics[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1980：254.

[13]CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing，Twenty-second Informational Supplement，CLSI document M100-S22[S].Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[14]CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals，Approved standard-Fourth Edition，CLSI document VET01-A4[S].Clinical and Laboratory Standards Institute，2013.

[15]SULAVIK M C，HOUSEWEART C，CRAMER C，et al.Antibiotic susceptibility profiles ofEscherichiacolistrains lacking multidrug efflux pump genes[J].AntimicrobAgentsChemother，2001，45(4)：1126-1136.[16]BAUCHERON S，IMBERECHTS H，CHASLUS-DANCLA E，et al.TheAcrBmultidrug transporter plays a major role in high-level fluoroquinolone resistance inSalmonellaentericaserovar typhimurium phage type DT204[J].MicrobDrugResist，2002，8(4)：281-289.

[17]孟春萍.鴨大腸桿菌acrB基因的缺失突變株構(gòu)建及其相關(guān)功能研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

MENG C P.Construction of theacrBgene deletion mutant from avianEscherichiacoliand some related biological functions[D].Zhengzhou：Henan Agricultural University，2012.(in Chinese)

[18]劉建華，苑麗，潘玉善，等.氨基糖苷類耐藥鴨大腸桿菌acrD基因mRNA表達(dá)水平[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31(6)：814-818.

LIU J H，YUAN L，PAN Y S，et al.The expression ofacrDgene of aminoglycosides-resistant enteropathogenicE.coliisolated from duckling[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2011，31(6)：814-818.(in Chinese)

(編輯白永平)

Construction ofcpxRandacrBDouble Gene Deletion Strain ofSalmonellaentericaSerovar Typhimurium and Analysis of Its Susceptibility to Antibacterial Agents

HUANG Hui1，LIU Bao-guang1，SUN Ya-wei2，MA Cai-hui1，CHEN Li-peng1，YUAN Li1，PAN Yu-shan1，HU Gong-zheng1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453001，China)

Abstract:The aim of this study was to explore the role ofcpxRgene in the multidrug resistance ofSalmonellaentericaSerovar Typhimurium and exclude a possibility thatacrBmasks the effect ofcpxRon the other efflux pumps or outer membrane proteins.AacrBgene deletion strain JSΔacrBwas constructed by the method of one-step inactivation of chromosomal genes on basis of Red homologous recombination system.A double gene deletion strain JSΔacrBΔcpxR∷kanwas constructed by phage P22-mediated transduction with strain JSΔcpxR∷kanconstructed in the previous study as the donor and strain JSΔacrBas the recipient.Meanwhile，thecpxRcomplemental strain JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxRwas prepared through introducting the expression plasmid pBAD-CpxR into the double gene mutant.At last the minimal inhibitory concentrations(MICs) of 10 kinds of commonly used representative antibacterial agents for JS and the above strains constructed in this study were determined with broth microdilution method.The double gene deletion strain and relatedcpxRcomplemental strain were constructed successfully.Strain JSΔacrBshowed 32-，4-，4-，16-，32-，4-，2- and 128-fold decrease in the MICs of doxycycline，gentamycin，amikacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，florfenicol，ceftriaxone and ceftiofur respectively，compared to the parent strain JS.Strain JSΔacrBΔcpxR∷kanshowed 2-，8-，2- and 2-fold decrease in the MICs of doxycycline，gentamicin，amikacin，and ceftiofur compared to strain JSΔacrB.While the complemental strain JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxRshowed 4-，16-，2- and 4-fold increase in the MICs of the above four kinds of antibacterial agents compared to strain JSΔacrBΔcpxR∷kan.In conclusion，cpxRis able to regulate the antimicrobial susceptibility ofS.entericaSerovar Typhimurium to doxycycline，gentamicin，amikacin，and ceftiofur.

Key words:S.entericaSerovar Typhimurium；cpxR;acrB；double gene deletion；minimal inhibitory concentration(MIC)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.024

收稿日期：2015-06-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31372481)

作者簡(jiǎn)介：黃慧(1988-)，女，河南羅山人，博士生，主要從事抗感染藥物藥理及細(xì)菌耐藥性研究，E-mail：hhcshwj@126.com *通信作者：胡功政，教授，E-mail：yaolilab@163.com

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0595-08