兔肝細(xì)胞中與RHDV VP60 P2亞區(qū)相互作用蛋白質(zhì)的篩選和初步鑒定

李　騰，姜　平，王　芳*，宋艷華，胡　波，范志宇，魏后軍，仇汝龍，劉　星

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

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兔肝細(xì)胞中與RHDV VP60 P2亞區(qū)相互作用蛋白質(zhì)的篩選和初步鑒定

李騰1，2，姜平1*，王芳1，2*，宋艷華2，胡波2，范志宇2，魏后軍2，仇汝龍2，劉星2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

摘要：兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60 P2亞區(qū)在病毒感染宿主細(xì)胞過程中可能起重要作用，為找尋RHDV靶細(xì)胞——兔肝細(xì)胞中與P2亞區(qū)相互作用的蛋白質(zhì)，以原核表達(dá)的P2蛋白為誘餌蛋白質(zhì)，通過免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP)結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與之有相互作用的肝細(xì)胞蛋白質(zhì)。經(jīng)分析選取層黏連蛋白受體(LamR)蛋白做進(jìn)一步研究。提取兔肝細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增LamR基因，將其插入pGEX-6p-1載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得GST-LamR融合蛋白，并通過GST pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證LamR蛋白與P2蛋白的結(jié)合。結(jié)果顯示，以P2蛋白為誘餌蛋白質(zhì)，免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜分析共篩選到26個(gè)與P2存在相互作用的肝細(xì)胞蛋白質(zhì)，其中LamR蛋白是多種病毒的受體。通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了LamR蛋白，經(jīng)pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證了LamR蛋白與P2蛋白有直接的相互作用。本研究證實(shí)兔肝細(xì)胞LamR蛋白與RHDV VP60 P2蛋白的相互作用，為深入研究RHDV的感染過程、揭示RHDV的致病機(jī)制提供了線索。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒(RHDV)；VP60 P2亞區(qū)；免疫共沉淀；層黏連蛋白受體(LamR)

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸傳染性、致死性疾病，是兔的一種毀滅性傳染病。RHDV屬杯狀病毒科兔病毒屬，無囊膜，為20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。病毒衣殼由180個(gè)VP60蛋白形成的90個(gè)二聚體組裝而成。VP60蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含形成病毒衣殼內(nèi)殼的S區(qū)和在衣殼外表面形成刺突結(jié)構(gòu)的P區(qū)。P區(qū)變異性較高，與病毒的抗原性相關(guān)，是宿主抗體識(shí)別的主要區(qū)域并在病毒粒子吸附宿主細(xì)胞及隨后的感染致病過程中起重要作用[1-3]。該區(qū)又可進(jìn)一步劃分為P1亞區(qū)和P2亞區(qū)。P2亞區(qū)位于病毒衣殼表面，具有突出的β桶核心結(jié)構(gòu)，推測(cè)P2區(qū)在病毒整個(gè)感染過程中起關(guān)鍵作用。此外，P2區(qū)還包含7個(gè)loop環(huán)，其loop區(qū)與其他杯狀病毒有顯著不同，這可能是病毒感染宿主特異性的主要決定因素[4]。因此，本研究選用P2亞區(qū)蛋白作為誘餌蛋白質(zhì)，以RHDV的主要靶器官兔肝作為研究對(duì)象，通過Co-IP法釣取兔肝細(xì)胞中與P2相互作用的蛋白質(zhì)，以期為研究RHDV的致病機(jī)制提供線索。

1材料與方法

1.1載體、蛋白質(zhì)、菌株及細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、BL21購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；供體質(zhì)粒pET-32a(+)、pGEX-6p-1及真核表達(dá)的VP60蛋白[5]、pET-32a(+)表達(dá)的重組IFN-γ蛋白均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑

Platinum?Pfx高保真DNA 聚合酶(50 U·μL-1)購(gòu)自Invitrogen公司；抗GST標(biāo)簽單抗抗體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗LamR山羊多抗購(gòu)自Santa Cruz公司；識(shí)別VP60-P2區(qū)的單克隆抗體1B8由本實(shí)驗(yàn)室制備；柱式DNA質(zhì)粒OUT試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；HiTrapTMProtein G HP純化柱試劑盒、His TrapTMHP 純化柱購(gòu)自GE公司；Pierce?交聯(lián)IP試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；GST-resin純化樹脂購(gòu)自上海點(diǎn)創(chuàng)生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3P2亞區(qū)基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)RHDV皖阜株基因序列(FJ794180，RHDVa型)，以pMD19-T-VP60為模板，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)P2亞區(qū)基因引物(表1)擴(kuò)增RHDVVP60 P2亞區(qū)基因。

1.4pET-32a-P2重組載體的構(gòu)建

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收P2亞區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物。pET-32a(+)供體質(zhì)粒及目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ 37 ℃雙酶切3 h，用T4 DNA Ligase 4 ℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定后，陽性克隆送上海華津生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒，最終獲得重組質(zhì)粒，命名為pET-32a-P2。

表1　引物序列

下劃線為內(nèi)切酶位置

The underlined letters show the restriction endonuclease sites

1.5P2重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化及鑒定

經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL 21大腸桿菌，以1 mmol·L-1的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，離心收集菌體并重懸至原體積的1/5，經(jīng)超聲波破碎后收集含可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)的上清。使用His TrapTMHP 純化柱試劑盒，按照說明對(duì)P2重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。SDS-PAGE和Western blotting鑒定P2蛋白的表達(dá)及純化效果。

1.6肝細(xì)胞全蛋白質(zhì)的制備

采用膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞[6]。IP裂解液重懸細(xì)胞，4 ℃搖床上孵育10 min以裂解肝細(xì)胞，13 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，取上清備用。超微量核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.7間接免疫熒光鑒定P2蛋白與兔肝細(xì)胞的結(jié)合

分離正常兔肝細(xì)胞，PBS洗滌兩次后，稀釋至5×106個(gè)·mL-1，鋪覆0.1 mg·mL-1多聚L-賴氨酸包被的細(xì)胞板。用含0.1% TritonX100的2%多聚甲醛固定液4 ℃固定肝細(xì)胞30 min，PBS洗滌兩次，加入純化的P2蛋白，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌三次，加入5～10 μg·mL-11B8單抗200 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。洗滌，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃ 1 h。PBS洗滌三次，倒置熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照(VP60蛋白)和陰性對(duì)照(重組IFN-γ蛋白)。

1.8Co-IP篩選與P2蛋白相互作用的兔肝細(xì)胞蛋白

根據(jù)Pierce交聯(lián)IP試劑盒使用說明書，P2蛋白、肝細(xì)胞蛋白質(zhì)分別經(jīng)對(duì)照瓊脂糖樹脂預(yù)處理，去除與瓊脂糖非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)后，備用。將識(shí)別P2區(qū)的單克隆抗體1B8結(jié)合到protein A/G 瓊脂糖上，經(jīng)洗滌后，再將誘餌蛋白質(zhì)P2與之共孵育，洗滌去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后將肝細(xì)胞蛋白質(zhì)與結(jié)合有1B8和P2的protein A/G瓊脂糖共孵育，4 ℃搖床過夜。低pH洗脫液洗脫蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照A只加入1B8和P2蛋白，用以鑒定抗體和誘餌蛋白質(zhì)上樣時(shí)結(jié)合到瓊脂糖上的非特異蛋白；設(shè)置對(duì)照B以重組IFN-γ蛋白替代P2誘餌蛋白質(zhì)做陰性對(duì)照，以鑒別肝細(xì)胞蛋白質(zhì)與瓊脂糖或1B8抗體的非特異結(jié)合蛋白。

1.9質(zhì)譜鑒定

分別從SDS-PAGE凝膠上切取整個(gè)泳道的蛋白質(zhì)，去除誘餌蛋白質(zhì)和抗體重輕鏈條帶后，送杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析。篩出質(zhì)譜結(jié)果中試驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異蛋白質(zhì)，并通過GO分析注釋差異蛋白質(zhì)的分子功能和生物進(jìn)程。通過文獻(xiàn)查閱最終選擇laminin receptor(LamR)進(jìn)行后期驗(yàn)證。

1.10LamR基因擴(kuò)增

以兔肝細(xì)胞提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中 LamR(LOC100354806)的CDS序列設(shè)計(jì)引物(表1)擴(kuò)增LamR基因。

1.11pGEX-6p-1-LamR重組表達(dá)載體的構(gòu)建

方法同“1.4”，以pGEX-6p-1為載體，構(gòu)建pGEX-6p-1-LamR重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。

1.12GST-LamR重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及鑒定

方法同“1.5”，SDS-PAGE及Western blotting鑒定LamR蛋白的表達(dá)。

1.13P2蛋白與GST-LamR蛋白的體外pull-down試驗(yàn)

將GST-LamR或GST(陰性對(duì)照)結(jié)合到Glutathione樹脂上，再與P2蛋白共孵育，4 ℃ 2 h。還原性谷胱甘肽GSH洗脫并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析。設(shè)置空白對(duì)照不加GST蛋白，P2蛋白直接與Glutathione樹脂共孵育。

2結(jié)果

2.1pET-32a-P2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD19-T-VP60為模板，PCR擴(kuò)增P2亞區(qū)基因，獲得591 bp與預(yù)期大小相符的目的片段(圖1)。雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-32a-P2，結(jié)果與預(yù)期一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果與基因序列完全一致。

M．DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1．P2亞區(qū)基因PCR產(chǎn)物M．2 000 bp ladder；1．The PCR product of P2 subdomain gene圖1　P2亞區(qū)基因擴(kuò)增結(jié)果Fig．1　The amplified results of P2 gene

M1．DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4．重組質(zhì)粒pET-32a-P2雙酶切產(chǎn)物；M2．DL15000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M1．2 000 bp ladder；1-4．Digestion products of pET-32a-P2 by enzymes；M2．15 000 bp ladder圖2　重組質(zhì)粒pET-32a-P2的酶切鑒定Fig．2　Enzyme digestion of recombinant plasmid pET-32a-P2

2.2P2重組蛋白質(zhì)表達(dá)、純化及鑒定

pET-32a-P2重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解，離心分離上清和沉淀。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，約40 ku處有特異性條帶，與預(yù)期大小一致；經(jīng)HisTrap親和柱純化后，蛋白質(zhì)雜帶減少，濃度變大(圖3)。Western blotting 鑒定表達(dá)的融合蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在40 ku處有特異性條帶。

M．蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、4．pET-32a(+)空載體表達(dá)蛋白質(zhì)；2、5．重組表達(dá)的P2蛋白(未純化)；3．純化的P2蛋白M．Protein marker；1，4．Protein expressed by pET-32a(+)； 2，5．Recombined P2 protein(unpurified)；3．Purified P2 protein圖3　重組蛋白P2的SDS-PAGE和Western blotting鑒定Fig．3　SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant P2 protein

2.3P2與肝細(xì)胞結(jié)合的IFA鑒定

用純化的P2蛋白與兔正常肝細(xì)胞共孵育，識(shí)別P2的單克隆抗體1B8和羊抗鼠FITC熒光二抗檢測(cè)P2蛋白與兔肝細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果顯示P2蛋白能與兔肝細(xì)胞發(fā)生較強(qiáng)的特異性吸附作用，有特異性綠色熒光，且強(qiáng)于陽性對(duì)照組(VP60)，而陰性對(duì)照組(重組IFN-γ)肝細(xì)胞無綠色熒光(圖4)。

A．P2蛋白；B．VP60陽性對(duì)照；C．重組IFN-γ陰性對(duì)照；D．陰性對(duì)照(明場(chǎng)圖)A．P2 protein；B．Positive control (VP60)；C．Negative control (IFN-γ)；D．Negative control (bright)圖4　P2與肝細(xì)胞結(jié)合的IFA鑒定Fig．4　Detection the binding of P2 to liver cells by IFA

2.4Co-IP篩選與P2蛋白相互作用的兔肝細(xì)胞蛋白質(zhì)

以pET-32a(+)表達(dá)的P2蛋白為誘餌蛋白質(zhì)，利用Co-IP法釣取與之互作的兔肝細(xì)胞蛋白質(zhì)。SDS-PAGE結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組有多條肉眼可見的差異條帶，如箭頭所指(圖5)。

2.5質(zhì)譜分析

分別切下試驗(yàn)組、對(duì)照A、對(duì)照B 整個(gè)泳道條帶，去除1B8抗體條帶和P2誘餌蛋白質(zhì)條帶后，分別做LC-MS/MS質(zhì)譜分析。去除與對(duì)照組重復(fù)的蛋白質(zhì)、可信度低的蛋白質(zhì)(Unique Peptides<2)及未鑒定蛋白質(zhì)，共篩出26個(gè)差異蛋白質(zhì)，并通過GO分析注釋各蛋白質(zhì)的分子功能和生物進(jìn)程(表2)。從分子功能上看，大部分蛋白質(zhì)為binding蛋白質(zhì)和具有酶活性的蛋白質(zhì)。binding蛋白質(zhì)包括嘌呤核苷酸binding、金屬離子binding、RNA binding、DNA binding、輔因子binding、ATP binding蛋白質(zhì)。酶活性蛋白質(zhì)包括具有脫氫酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、磷酸化酶、裂解酶、連接酶等活性的蛋白質(zhì)。還有小部分蛋白質(zhì)為核糖體結(jié)構(gòu)成分。從生物進(jìn)程上來看，這些蛋白質(zhì)多參與蛋白質(zhì)的翻譯、修飾、組裝過程以及血紅素、膽固醇等物質(zhì)的代謝過程，還有部分蛋白質(zhì)參與細(xì)胞凋亡、有氧呼吸及脂質(zhì)、膽固醇的平衡過程。

表2　質(zhì)譜分析結(jié)果

(轉(zhuǎn)下頁)(Continued on the next page)

表2(續(xù))Table 2(continued)

(轉(zhuǎn)下頁)(Continued on the next page)

表2(續(xù))Table 2(continued)

1、2．試驗(yàn)組樣品；3、4．對(duì)照A樣品； 5、6．對(duì)照B樣品1，2．The experimental sample；3，4．Control A sample；5，6．Control B sample圖5　Co-IP篩選與P2蛋白相互作用的兔肝細(xì)胞蛋白Fig．5　Detection of P2-interacting proteins in rabbit liver cells by Co-IP

通過文獻(xiàn)查閱，選擇laminin receptor(LamR)蛋白進(jìn)行后期驗(yàn)證。

2.6pGEX-6p-1-LamR重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以兔肝組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增LamR基因，獲得888 bp與預(yù)期大小相符的目的片段(圖6)，重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-LamR雙酶切鑒定正確(圖7)，測(cè)序結(jié)果顯示克隆的LamR堿基序列與NCBI兔LamR(LOC100354806)堿基序列相似性為98%，氨基酸序列相似性為97.3%。

M．DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．LamR基因RT-PCR產(chǎn)物M．2 000 bp DNA ladder；1．The product of LamR by RT-PCR圖6　LamR基因擴(kuò)增結(jié)果Fig．6　The amplified results of LamR gene

M1．DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3．重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-LamR雙酶切產(chǎn)物；M2．DL15000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M1．2 000 bp DNA ladder；1-3．Digestion products of pGEX-6p-1-LamR by enzyme；M2．15 000 bp ladder圖7　重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-LamR的酶切鑒定Fig．7　Enzyme digestion of recombinant plasmid pGEX-6p-1-LamR

2.7LamR重組蛋白質(zhì)表達(dá)鑒定

pGEX-6p-1-LamR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blotting分析顯示在60 ku處有GST-LamR特異性條帶，與預(yù)期相符(圖8)。

M．蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、4．pGEX-6p-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)；2、3．重組表達(dá)的GST-LamR蛋白質(zhì)M．Protein marker；1，4．Protein expressed by pGEX-6p-1；2，3．Recombined GST-LamR protein圖8　融合蛋白質(zhì)GST-LamR的SDS-PAGE和Western blotting鑒定Fig．8　SDS-PAGE and Western blotting analysis of GST-LamR fusion protein

2.8P2蛋白與GST-LamR蛋白的體外pull-down試驗(yàn)

為驗(yàn)證LamR與P2是否存在直接相互作用，分別以GST-LamR和GST(陰性對(duì)照)為誘餌蛋白質(zhì)，進(jìn)行體外GST-pulldown試驗(yàn)并進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果顯示試驗(yàn)組有P2蛋白特異性條帶，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照無條帶(圖9)。

1．試驗(yàn)組(GST-LamR)；2．陰性對(duì)照(GST)；3．空白對(duì)照1．Treatment(GST-LamR)；2．Negative control(GST)；3．Blank control圖9　P2蛋白與LamR蛋白相互作用的體外pull-down驗(yàn)證Fig.9　Pull-down analysis of P2 interacts with LamR in vitro

3討論

RHDV衣殼蛋白VP60 P區(qū)包括P1亞區(qū)(238—286、450—466、484—579 aa)和P2亞區(qū)(287—449、467—483 aa)，其中P2亞區(qū)包含7個(gè)高變區(qū)，推測(cè)與受體的結(jié)合相關(guān)[4]。M.Tan等研究發(fā)現(xiàn)諾如病毒(NVs)P2亞區(qū)是受體HBGAs結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域[7]，R.Chen等也發(fā)現(xiàn)杯狀病毒P2亞區(qū)與受體識(shí)別，宿主特異性和免疫逃避有關(guān)[8]。而NVs和RHDV具有相同受體(HBGAs)[9-10]和相似的病毒作用機(jī)制。且兩種病毒的衣殼蛋白P2亞區(qū)均位于病毒衣殼的最突出區(qū)域，最有可能在病毒入侵宿主的過程中率先與宿主細(xì)胞接觸并在病毒感染致病過程中發(fā)揮重要作用。由此推測(cè)RHDV P2亞區(qū)可能在病毒感染整個(gè)過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究構(gòu)建了P2融合蛋白質(zhì)，免疫熒光試驗(yàn)顯示，表達(dá)的P2蛋白與肝細(xì)胞存在顯著的結(jié)合，這表明以P2為誘餌蛋白質(zhì)釣取的宿主蛋白質(zhì)可能在病毒結(jié)合、侵染和致病過程中具有重要作用。

兔肝是RHDV感染的主要靶器官之一，RHDV能引起兔肝細(xì)胞程序性死亡，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肝炎癥狀[11-12]，以兔肝作為研究RHDV P2互作蛋白質(zhì)的研究對(duì)象具有代表性。試驗(yàn)通過Co-IP法共篩選出兔肝細(xì)胞中26個(gè)與P2亞區(qū)相互作用的蛋白質(zhì)，GO分析分子功能顯示，這些蛋白質(zhì)多屬于binding蛋白質(zhì)和具有酶活性的蛋白質(zhì)；生物進(jìn)程顯示，這些蛋白質(zhì)涉及生理調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡等過程。推測(cè)RHDV感染肝細(xì)胞時(shí)，可能通過P2與這些蛋白質(zhì)的互作，改變肝細(xì)胞的正常代謝，致使機(jī)體產(chǎn)生一系列的應(yīng)答反應(yīng)。

LamR是以二聚體形式存在的跨膜蛋白質(zhì)，又稱67 ku層黏連蛋白受體，是由37 ku的前體經(jīng)翻譯后加工形成[13]。LamR被認(rèn)為是多種病原的受體。E.V.Protopopova等[14]使用獨(dú)特型抗體發(fā)現(xiàn)LamR是蜱傳腦炎病毒的細(xì)胞受體。K.S.Wang等[15]發(fā)現(xiàn)LamR是新培斯病毒進(jìn)入BHK-21的功能受體。蚊源LamR蛋白被認(rèn)為是委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒[16]和登革病毒[17-20]的假定受體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上，LamR又被認(rèn)為是朊病毒的細(xì)胞受體[21-22]。J.Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)LamR是經(jīng)典豬瘟病毒的細(xì)胞吸附受體。李茂中通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析對(duì)RHDV感染兔和未感染兔肝組織中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)LamR是其中的差異蛋白質(zhì)之一[24]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但是他們沒有對(duì)LamR與RHDV的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。因此本研究選擇LamR蛋白，對(duì)其與P2蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，證實(shí)了兩者在體外確實(shí)存在直接的相互作用，但LamR蛋白在病毒入侵宿主的過程中究竟起到怎樣的作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論

通過Co-IP的方法，以P2為誘餌蛋白質(zhì)，以RHDV感染的靶器官兔肝為研究對(duì)象，結(jié)合質(zhì)譜鑒定共篩選到了26個(gè)蛋白質(zhì)。經(jīng)分析選取LamR蛋白進(jìn)行進(jìn)一步研究。利用GST pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證了P2與LamR蛋白存在直接的相互作用，為RHDV致病機(jī)制的研究提供了線索。

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(編輯白永平)

Screening and Identification of RHDV VP60 P2 Domain Interacting Proteins in Rabbit Liver Cells

LI Teng1，2，JIANG Ping1*，WANG Fang1，2*，SONG Yan-hua2，HU Bo2，F(xiàn)AN Zhi-yu2，WEI Hou-jun2，QIU Ru-long2，LIU Xing2

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseasesDiagnosticandImmunology，CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China；2.KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture，NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

Abstract:According to reports，VP60 P2 subdomain of RHDV may play an important role in the viral infection． In this study，we used co-immunoprecipitation(Co-IP) with RHDV VP60 P2 expressed inE.colias bait protein and mass spectrometry analysis to screen the RHDV interacting hepatocellular proteins.Laminin receptor (LamR)，as receptors of many other viruses，was identified and verified as potential interacting partner of P2.LamRgene was amplified by RT-PCR from rabbit liver cells．The recombinant LamR protein was expressed inE.coliand used in GST pull-down to verify the interaction of LamR and P2．Here we screened 26 proteins as potential P2 interacting proteins.After verification，the protein LamR could interact with P2 directly.We found that RHDV VP60 P2 interacted with LamR which would contributed to further study of the infectious process and pathogenesis of RHDV．

Key words:rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV)；VP60 P2 subdomain；co-immunoprecipitation； laminin receptor (LamR)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.018

收稿日期：2015-08-21

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)兔體系病毒病預(yù)防與控制崗位(CARS-44-C-1); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31502073)

作者簡(jiǎn)介：李騰(1990-)，女，湖南邵東人，碩士生，主要從事家畜傳染病學(xué)研究，Tel：025-84390337，E-mail: 2013107045@njau.edu.cn *通信作者：姜平，教授， E-mail：jiangp@njau.edu.cn；王芳，研究員，E-mail：rwangfang@126.com

中圖分類號(hào)：S855.3；S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0549-10