Notch和Wnt信號(hào)通路在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合富血小板纖維蛋白修復(fù)兔牙槽骨缺損中的表達(dá)

周春梅??李淑慧??溫齊古麗·乃庫(kù)力??于莉??袁萍??趙璐??吳佩玲??尼加提·吐?tīng)栠d新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊?830063

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Notch和Wnt信號(hào)通路在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合富血小板纖維蛋白修復(fù)兔牙槽骨缺損中的表達(dá)

周春梅??李淑慧??溫齊古麗·乃庫(kù)力??于莉??袁萍??趙璐??吳佩玲??尼加提·吐?tīng)栠d
新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊?830063

[摘要]目的 通過(guò)建立自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合富血小板纖維蛋白（PRF）修復(fù)兔拔牙窩骨缺損的動(dòng)物模型，探討Notch和Wnt信號(hào)通路在牙槽骨缺損修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及意義。方法 選用36只健康雄性2月齡新西蘭兔，隨機(jī)分為4組，均于全身麻醉下微創(chuàng)拔除下頜左側(cè)中切牙。A組植入BMSCs-PRF復(fù)合物，B、C組分別植入單一PRF和BMSCs，D組未植入任何材料作為空白對(duì)照。術(shù)后4、8、12周（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只動(dòng)物）處死動(dòng)物，立即在骨缺損同一部位取材，制作骨標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色檢測(cè)骨缺損修復(fù)過(guò)程中Notch1和Wnt3a的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：第4、8周，A、B、C組Notch1和Wnt3a表達(dá)均高于D組（P<0.05）；第12周，D組Notch1和Wnt3a表達(dá)高于其他3組（P<0.05）。免疫熒光染色顯示：第4周，骨缺損區(qū)新生骨細(xì)胞Notch1和Wnt3a的表達(dá)最多，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，骨缺損修復(fù)完成，表達(dá)逐漸降低。結(jié)論 Notch1和Wnt3a信號(hào)分子在BMSCs復(fù)合PRF促進(jìn)骨缺損修復(fù)過(guò)程中均有表達(dá)，可以通過(guò)調(diào)控BMSCs的增殖與分化加速牙槽骨缺損修復(fù)的愈合過(guò)程；二者表達(dá)情況相似，有可能存在串話機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]Notch1； Wnt3a； 牙槽骨缺損； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 富血小板纖維蛋白

拔牙后不可避免的牙槽骨吸收會(huì)導(dǎo)致牙槽嵴高度和寬度降低以及骨密度減小，會(huì)對(duì)后期活動(dòng)和種植義齒修復(fù)的臨床效果產(chǎn)生不利影響[1-2]，因此牙槽骨缺損的修復(fù)是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題。在特定微環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone?marrow?stem?cells，BMSCs）在適宜細(xì)胞因子作用下可以分化成多種組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等[3]。研究[4-5]證實(shí)，BMSCs與富血小板纖維蛋白（platelet-rich?fibrin，PRF）形成的骨組織工程復(fù)合材料可以促進(jìn)牙槽骨的再生與修復(fù)，但如何促進(jìn)細(xì)胞生成的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)，Notch 和Wnt信號(hào)通路幾乎涉及所有已知?jiǎng)游锏呐咛グl(fā)育和組織損傷修復(fù)中細(xì)胞的增殖和分化活動(dòng)，其中，Notch1和Wnt3a在口腔組織中的表達(dá)具有細(xì)胞特異性[6]，二者調(diào)控骨形成的機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用BMSCs和PRF復(fù)合物BMSCs-PRF修復(fù)兔牙槽骨缺損，通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色檢測(cè)不同時(shí)間段Notch1和Wnt3a信號(hào)蛋白在牙槽骨缺損前后的表達(dá)情況，分析Notch和Wnt雙信號(hào)通路在骨組織工程材料修復(fù)牙槽骨缺損中的作用。

1??材料和方法

1.1??主要試劑和儀器

大鼠抗兔一抗Notch1（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），大鼠抗兔一抗Wnt3a（Ana?Spec公司，美國(guó)），Envision兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒（DAKO公司，丹麥）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）、抗體稀釋液、封閉用正常羊血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4’,6-diamidino-2-phenylindole?dihydrochloride，DAPI）（北京高科恒輝技術(shù)發(fā)展有限公司）；免疫熒光二抗試劑盒（Abbkine公司，美國(guó)）。C2型激光掃描共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；DM5000型正置熒光顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）；生物組織包埋機(jī)（金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Microm?HM?315型病理切片機(jī)（GMI?公司，德國(guó)）。

1.2??實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1???動(dòng)物模型建立方法 ??健康雄性2月齡新西蘭大白兔36只（質(zhì)量2.5～3.5?kg，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分為4組，即實(shí)驗(yàn)組（A、B、C）和空白組（D），均于全身麻醉下微創(chuàng)拔除下頜左側(cè)中切牙。A組植入自體BMSCs與PRF復(fù)合物BMSCs-PRF，B、C組分別植入PRF和BMSCs，D組拔牙窩內(nèi)未植入任何材料。分別于術(shù)后4、8和12周（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組有3只動(dòng)物）處死動(dòng)物并立即在骨缺損部位取材，0.9%氯化鈉溶液沖洗下頜骨缺損部位標(biāo)本，放入固定液（4%多聚甲醛）中固定48?h。標(biāo)本經(jīng)過(guò)脫鈣、包埋，切片（厚度4 μm）后部分用于組織學(xué)觀察，部分進(jìn)行免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2??BMSCs的體外培養(yǎng) ??A和C組的每只新西蘭大白兔均采用3%戊巴比妥鈉（1?mL·kg-1）通過(guò)耳緣靜脈注射麻醉后，選股骨第3轉(zhuǎn)子稍下方為進(jìn)針點(diǎn)，持16號(hào)骨髓穿刺針與股骨軸線垂直刺入骨髓腔，抽取5?mL骨髓，采用細(xì)胞密度梯度離心法在超級(jí)工作臺(tái)內(nèi)分離并收集細(xì)胞。在37?℃、體積分?jǐn)?shù)5%?CO2的飽和濕度孵育條件下，采用DMEM液（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100?U·L-1青霉素、100?mg·L-1鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞，首次換液48?h后，每間隔2～3?d換液1次。待顯微鏡下顯示細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%以上后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞2?min，離心5?min（1?200?r·min-1）。按照常規(guī)1∶2的比例傳代、擴(kuò)增，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3???PRF的制備 ??從A和B組的每只新西蘭大白兔耳緣抽取10?mL動(dòng)脈血，放置于無(wú)菌采血管中，以3?000?r·min-1離心15?min后，管內(nèi)出現(xiàn)分層，由下至上依次為紅細(xì)胞層、白色凝膠狀PRF層、血清層。采用中間PRF層進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4???BMSCs與PRF的復(fù)合及培養(yǎng) ??無(wú)菌條件下將PRF層制備成4?mm×6?mm大小后置于24孔板內(nèi)，用DMEM預(yù)濕后，紫外線消毒45?min。調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升6×107個(gè)細(xì)胞，將BMSCs接種至24孔板內(nèi)，每塊接種20 μL，加培養(yǎng)液2?mL，在37?℃、體積分?jǐn)?shù)5%的飽和濕度條件下孵育，間隔1?d換液，在倒置相差顯微鏡下每日觀察，培養(yǎng)至第3天時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。1.3??免疫熒光染色

切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，使用檸檬酸鈉緩沖液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。待抗原修復(fù)后，依次使用PBS清洗和10%正常山羊血清封閉。37?℃避光孵育1?h后，加入Notch1單克隆抗體（1∶100）及Wnt3a多克隆抗體（1∶100），置于4?℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。PBS清洗3次，加入二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記（1∶1?000），常溫下避光孵育2?h，再次經(jīng)PBS沖洗后，加入稀釋后的DAPI（DAPI與甲醇體積比為1∶1?000）染色5～10?min，PBS清洗3次，最后封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4??免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟，室溫下置于3%H2O2溶液中15?min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后利用枸櫞酸緩沖溶液行抗原熱修復(fù)12?min，隨即于40?min~1?h內(nèi)冷卻至室溫，滴加羊封閉血清30～50 μL，置于37?℃恒溫箱內(nèi)孵育30?min后，滴加一抗Notch1（1∶500），4?℃條件下濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。室溫放置1?h，滴加二抗后于濕盒內(nèi)37?℃恒溫孵育25?min，DAB顯色，蘇木素5?min均勻染色，脫水、透明、封片。Wnt3a（1∶300）染色實(shí)驗(yàn)步驟同上。選取各時(shí)間點(diǎn)各組骨缺損部位的15個(gè)高倍鏡視野（放大400倍），拍攝圖片，利用Image?Pro?Plus軟件（Media?Cybernetics公司，美國(guó)）測(cè)量各組Notch1和Wnt3a平均光密度（average?optical?density，AOD）值。測(cè)量步驟如下：1）光密度校正，即本底修正；2）設(shè)置測(cè)量參數(shù)；3）描繪測(cè)量區(qū)域；4）設(shè)置色彩選擇，本研究采用色調(diào)、飽和度、亮度模式；5）測(cè)量描繪區(qū)域面積；6）測(cè)量積分光密度；7）計(jì)算出比值即為AOD。

1.5??統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS?17.0軟件對(duì)Notch1和Wnt3a的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2??結(jié)果

2.1??組織學(xué)切片觀察

術(shù)后4周，A組見(jiàn)骨細(xì)胞和少量哈弗系統(tǒng)以及粗大密集的骨小梁；B、C組表現(xiàn)出不典型的骨組織結(jié)構(gòu)和哈弗系統(tǒng)，骨小梁較稀疏，排列較為紊亂；D組為纖維組織，罕見(jiàn)成骨細(xì)胞。術(shù)后8周，A組新生骨及骨小梁逐漸增加，B、C組有少量新生骨形成，D組多為纖維結(jié)締組織。術(shù)后12周，A組缺損區(qū)新生的編織骨及板層骨里可見(jiàn)成熟的哈弗系統(tǒng)；B組可見(jiàn)較稀疏的骨小梁，新生的編織骨及板層骨充填少于A組；C組骨組織排列欠規(guī)則，成熟的哈弗系統(tǒng)少見(jiàn)；D組主要為纖維結(jié)締組織，可見(jiàn)少量骨樣組織生成（圖1）。

圖 1??第12周4組的組織學(xué)切片觀察 ??蘇木精-伊紅染色??×?20Fig?1??Typical?histological?sections?of?specimens?harvested?from?the?four?groups?12?weeks?after?operation??hematoxylin-eosin?staining??×?20

2.2??Notch1和Wnt3a的表達(dá)

2.2.1??免疫熒光染色 ?4周時(shí)，Notch1和Wnt3a在各組骨缺損區(qū)新生牙槽骨內(nèi)均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)，新生組織血管周均可見(jiàn)Notch1強(qiáng)表達(dá)，而細(xì)胞核未見(jiàn)Notch1和Wnt3a的表達(dá)（圖2、3）；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組Notch1和Wnt3a的表達(dá)均逐漸下降，到12周時(shí)，除D組有少量表達(dá)外，其他組已無(wú)明顯表達(dá)。

圖 2??第4周Notch1表達(dá)情況 ??免疫熒光染色 ??×?40Fig?2??The?expression?of?Notch1?four?weeks?after?surgery??immunofluorescence?staining??×?40

圖 3??第4周Wnt3a表達(dá)情況 ??免疫熒光染色 ??×?40Fig?3??The?expression?of?Wnt3a?four?weeks?after?surgery??immunofluorescence?staining??×?40

2.2.2??免疫組織化學(xué)染色 ??Notch1和Wnt3a陽(yáng)性表達(dá)呈棕色，表達(dá)在骨小梁周圍、牙槽骨的成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)4、8周時(shí)，4組均有陽(yáng)性表達(dá)，A組表達(dá)最高，B、C組次之，D組最低（圖4、 5）；12周時(shí)，隨著骨形成時(shí)間的增加，A、B、C組的陽(yáng)性表達(dá)水平低于D組。4組在不同時(shí)間點(diǎn)的AOD值見(jiàn)圖6。

圖 4??第4周Notch1表達(dá)情況 ??免疫組織化學(xué)染色 ??×?40Fig?4??The?expression?of?Notch1?four?weeks?after?surgery??immunohistochemical?staining??×?40

圖 5??第4周Wnt3a表達(dá)情況 ??免疫組織化學(xué)染色 ??×?40Fig?5??The?expression?of?Wnt3a?four?weeks?after?surgery??immunohistochemical?staining??×?40

圖 6??4組Notch1（左）和Wnt3a（右）表達(dá)的AOD值Fig?6??The?AOD?of?Notch1?(left)?and?Wnt3a?（right)?in?four?groups

由圖6可見(jiàn)，4周時(shí)，A組Notch1和Wnt3a表達(dá)量最高，高于其他各組（P<0.05），B、C組表達(dá)量較A組降低，但高于D組（P<0.05）；隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，8、12周時(shí)A、B、C組表達(dá)量均逐漸降低，但8周時(shí)A組表達(dá)量仍高于其他各組，12周時(shí)A組表達(dá)量高于B、C組；D組則隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高，12周時(shí)，D組Notch1和Wnt3a表達(dá)量最高，高于其他3組（P<0.05）。

3??討論

牙槽骨缺損修復(fù)是一個(gè)持續(xù)的骨組織吸收和骨形成的過(guò)程[7]。Notch和Wnt信號(hào)對(duì)調(diào)控干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、黏附及維持均具有十分重要的作用[8]。兩者在成骨細(xì)胞的發(fā)生及骨形成中的作用是近年來(lái)的研究焦點(diǎn)。

Notch信號(hào)通路是一類穿膜受體蛋白[7]，其激活是通過(guò)位于細(xì)胞膜上的Notch受體與配體和細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白間相互作用，釋放出胞內(nèi)段[9-11]，將原來(lái)的協(xié)同抑制復(fù)合物轉(zhuǎn)換為協(xié)同活化復(fù)合物，傳到細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。Wnt3a信號(hào)蛋白是Wnt信號(hào)通路家族的成員之一，是一種富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通過(guò)旁分泌或自分泌作用與相鄰細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)各級(jí)信號(hào)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)和目標(biāo)細(xì)胞的增殖和分化[12]。

骨組織工程技術(shù)是由種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和支架材料組成。BMSCs取材容易，在體外連續(xù)傳代多達(dá)30次，仍具有很強(qiáng)的成骨潛能。骨形態(tài)發(fā)生蛋白、維生素C、β-甘油磷酸鈉和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)物可促進(jìn)其向成骨方向分化。與其他成骨種子細(xì)胞相比，BMSCs有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[13-14]。PRF為新一代血小板濃縮物，呈立體網(wǎng)狀，可提供細(xì)胞生存的三維空間，對(duì)骨組織修復(fù)的促進(jìn)作用有賴于濃縮血小板被激活后α顆粒緩慢釋放出高濃度的各類生長(zhǎng)因子和自身的纖維蛋白支架作用[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兔牙槽骨缺損的動(dòng)物模型，向牙槽窩回植不同的骨組織工程材料，結(jié)果顯示：4周時(shí)各組均表達(dá)Notch1和Wnt3a，其中A組表達(dá)最高，B、C組次之，D組最低。提示Notch1和Wnt3a不同程度參與調(diào)控骨髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖和分化以及新骨形成，A組新骨形成量?jī)?yōu)于B、C組。8周時(shí)，A、B、C組的Notch1和Wnt3a表達(dá)量下降，D組逐漸升高。12周時(shí)，各組表達(dá)量與4周時(shí)相比均有明顯下降，且A、B、C組Notch1和Wnt3a表達(dá)量均低于D組?？赡苁请S著骨缺損區(qū)新生骨增多并逐漸成熟，Notch1和Wnt3a不參與調(diào)控成熟的成骨細(xì)胞；而空白組（D組）的成骨細(xì)胞仍處于增殖分化狀態(tài)，骨形成正在進(jìn)行，成骨效果較其他3組滯后，致使Notch1和Wnt3a的表達(dá)量增加。

本研究結(jié)果提示，在促進(jìn)骨組織缺損的修復(fù)過(guò)程中，骨組織工程材料通過(guò)Notch和Wnt信號(hào)通道參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖與分化，加速新骨形成。在生物材料逐步降解的同時(shí)，由于PRF有促細(xì)胞增殖與遷徙的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易于種子細(xì)胞的附著并在預(yù)制形態(tài)的三維支架上生長(zhǎng)，同時(shí)獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并進(jìn)行氣體交換和排除廢料，BMSCs-PRF復(fù)合物能促進(jìn)成骨細(xì)胞的不斷增殖，增加新骨形成量[15]。

與BMSCs-PRF復(fù)合物相比，單純使用PRF組的成骨效果略差；BMSCs組缺乏由PRF形成的細(xì)胞外基質(zhì)，使其植入的BMSCs失去依托，影響新骨形成的微環(huán)境，不能形成優(yōu)勢(shì)成骨細(xì)胞群，而使生長(zhǎng)能力強(qiáng)的成纖維細(xì)胞入侵骨缺損修復(fù)區(qū)，形成纖維結(jié)締組織，阻礙新骨的形成[17]?？瞻捉M（D組）中缺乏細(xì)胞因子及具有定向分化能力的BMSCs，骨缺損區(qū)新骨形成的量明顯低于3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

綜上所述，自體BMSCs復(fù)合PRF修復(fù)兔牙槽骨缺損的過(guò)程中，Notch1和Wnt3a信號(hào)分子在新骨形成區(qū)均存在表達(dá)。兩者在表達(dá)順序及調(diào)控作用上具有協(xié)同作用，共同調(diào)控BMSCs-PRF向成骨細(xì)胞的增殖與分化。在此過(guò)程中，兩者表達(dá)相似，兩條通路可能存在串話。

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（本文采編 ?王晴）

[中圖分類號(hào)]R?782

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.005

[收稿日期]2015-10-30；?[修回日期] ?2015-12-21

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81460103）；新疆維吾爾自治區(qū)青年科學(xué)基金（2013211B53）

[作者簡(jiǎn)介]周春梅，碩士，E-mail：zcm420@126.com

[通信作者]尼加提·吐?tīng)栠d，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：kqnijate@ 126.com

The expressions of the Notch and Wnt signaling pathways and their significance in the repair process of alveolar bone defects in rabbits with bone marrow stem cells compounded with platelet-rich fibrin

Zhou Chunmei, Li Shuhui, Wen- qiguli·Naikuli, Yu Li, Yuan Ping, Zhao Lu, Wu Peiling, Nijiati·Tuerxun. (Dept. of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830063, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (81460103); Youth Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013211B53). Correspondence: Nijiati·Tuerxun, E-mail: kqnijate@126.com.

[Abstract]Objective We?explored?the?expressions?of?the?Notch?and?Wnt?signaling?pathways?and?their?significance?in?the?repair?process?of?alveolar?bone?defects?by?establishing?animal?models?with?a?composite?of?autologous?bone?marrow?mesenchymal?stem?cells?(BMSCs)?and?platelet-rich?fibrin?(PRF)?to?repair?bone?defects?in?the?extraction?sockets?of?rabbits.?Methods??A?total?of?36?two-month-old?male?New?Zealand?white?rabbits?were?randomly?divided?into?four?groups,?and?the?left?mandibular?incisors?of?all?the?rabbits?were?subjected?to?minimally?invasive?removalunder?general?anesthesia.?BMSC-PRF?compounds,?single?PRF,?and?single?BMSC?were?implanted?in?Groups?A,?B,?and?C.?No?material?was?implanted?in?Group?D?(blank?control).?The?animals?were?sacrificed?at?4,?8?and?12?weeks?after?surgery,?the?bone?defect?was?immediately?drawn,?and?the?bone?specimens?underwent?surgery?after?four,?eight,?and?twelve?weeks,?with?three?rabbits?per?time?point.?The?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?the?repair?process?of?the?bone?defect?were?measured?via?immunohistochemical?and?immunofluorescence?detection.?Results??Immunohistochemistry?showed?that?the?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?Groups?A,?B,?and?C?were?higher?than?that?in?Group?D?at?the?fourth?and?eighth?week?after?operation?(P<0.05).?By?contrast,?the?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?Group?D?were?higher? than?those?in?Groups?A,?B,?and?C?at?the?twelfth?week?(P< 0.05).?Immunofluorescence?showed?that?the?expressions?of?both?Notch1?and?Wnt3a?reached?their?peaks?in?the?new?bone?cells?of?the?bone?defect?after?four?weeks?following?surgery?and?gradually?disappeared?when?the?bone?was?repaired?com-pletely.?Conclusion???Notch1?and?Wnt3a?signaling?molecules?are?expressed?in?the?process?of?repairing?bone?defects?using?BMSC-PRF?composites?and?can?accelerate?the?healing?by?regulating?the?proliferation?and?differentiation?of?BMSCs.?Moreover,?the?expressions?of?Notch?and?Wnt?are?similar,?and?a?crosstalk?between?them?may?exist.

[Key words]Notch1;??Wnt3a;??alveolar?bone?defect;??bone?marrow?stem?cells;??platelet-rich?fibrin