體外RNA干擾RhoA基因?qū)ι喟┘?xì)胞侵襲的影響

陳正崗??唐永平??童磊??王瑩??周元??王奇民??韓金宏??何宗軒??廖奕翔樊兵??鄒榮海??張健??孫曉峰??嚴(yán)國鑫.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島?26607；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?2000；.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊?2602；.無錫市第二人民醫(yī)院口腔科，無錫?2002

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體外RNA干擾RhoA基因?qū)ι喟┘?xì)胞侵襲的影響

陳正崗1,2唐永平1童磊1王瑩3周元3王奇民1韓金宏1何宗軒1廖奕翔1樊兵4鄒榮海4張健4孫曉峰4嚴(yán)國鑫4
1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島?266071；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?200011；3.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊?261021；4.無錫市第二人民醫(yī)院口腔科，無錫?214002

[摘要]目的 ?應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人舌癌細(xì)胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表達(dá)，探討RhoA基因表達(dá)下調(diào)對(duì)舌癌細(xì)胞侵襲的影響。方法 ??登錄Genbank數(shù)據(jù)庫確定人RhoA基因序列，針對(duì)RhoA的基因序列設(shè)計(jì)短鏈RNA，利用Lipofectamine2000介導(dǎo)法將RhoA-siRNA轉(zhuǎn)染至舌癌Tca8113和SCC-4細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后的舌癌細(xì)胞中RhoA?mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達(dá)，Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 ??舌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后，RhoA的基因和蛋白表達(dá)下降，galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞體外侵襲能力降低。結(jié)論 ??RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4細(xì)胞中RhoA的表達(dá)，通過降低galectin-3和MMP-9的表達(dá)從而降低細(xì)胞的侵襲能力。RhoA在舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要的作用。

[關(guān)鍵詞]RhoA基因； 半乳糖凝集素-3； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； RNA干擾； 舌癌； 侵襲

舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一。發(fā)病率要遠(yuǎn)高于其他部位的口腔癌[1-4]，并且近年來舌癌發(fā)病率逐漸增加，發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢[5-6]。舌癌的主要臨床特點(diǎn)是局部呈浸潤性或外生性生長，極易在病變的早期發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。由于惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段、多因素和多基因綜合作用的結(jié)果，因此侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制成為目前舌癌的研究熱點(diǎn)。

Rho家族蛋白是小G蛋白R(shí)as超家族成員，是一組具有三磷酸鳥苷（guanosine?triphosphate，GTP）酶活性、相對(duì)分子質(zhì)量為20×103～30×103的鳥苷酸結(jié)合蛋白，主要包括RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2和Cdc42。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族成員尤其是RhoA在多種腫瘤組織中如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腸癌等表達(dá)增加，并與腫瘤的惡性程度、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后有關(guān)，而對(duì)于RhoA在舌癌中的作用，目前的研究相對(duì)較少。本研究應(yīng)用RNA干擾（RNA?interference，RNAi）技術(shù)，以人舌癌細(xì)胞株Tca8113和SCC-4作為研究對(duì)象，利用體外合成針對(duì)RhoA基因的特異小干擾RNA（small?interfering?RNA，siRNA）將其轉(zhuǎn)染舌癌細(xì)胞，觀察siRNA對(duì)RhoA基因的抑制作用，探討其對(duì)舌癌Tca8113和SCC-4細(xì)胞侵襲的影響及可能的作用機(jī)制，為舌癌的治療提供新的思路。

1??材料和方法

1.1??材料

人舌癌細(xì)胞株Tca8113購自中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所，人舌癌細(xì)胞株SCC-4由山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。DMEM高糖培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic?acid，EDTA）/胰蛋白酶、Trizol、陽離子脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000 （Invitrogen公司，美國），胎牛血清、青霉素、鏈霉素（Gibco公司，美國），SYBR?Premix?Ex?Taq （Perfect?Real?Time）試劑盒（Takara公司，日本），RhoA鼠抗人單克隆抗體（Santa?Cruz公司，美國），辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），放射免疫沉淀法（radio?immunoprecipitation?assay，RIPA）蛋白裂解液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。siRNA序列合成及基因測序購自上海博尚生物技術(shù)有限公司。

1.2??細(xì)胞培養(yǎng)

Tca8113和SCC-4細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素100?mg·mL-1和鏈霉素100?mg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基在37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，向培養(yǎng)瓶（25?cm2）內(nèi)加入2?mL胰蛋白酶。消化在37?℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5?min后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即加入5?mL含有血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程按順序進(jìn)行，確保所有底部均被吹到。動(dòng)作輕柔，盡可能避免出現(xiàn)泡沫。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，按1︰1比例傳代接種在新的培養(yǎng)瓶中。

1.3??RhoA?siRNA的合成

登錄Genbank數(shù)據(jù)庫確定人RhoA基因序列，序列號(hào)為NM_001664，針對(duì)RhoA的基因序列設(shè)計(jì)2條RhoA-siRNA和1條陰性對(duì)照序列（NC-siRNA）（表1）。

表 1 ?針對(duì)RhoA基因序列設(shè)計(jì)的2條RhoA-siRNA和1條陰性對(duì)照序列?Tab 1 Sequences of two RhoA-siRNA and one negative control based on RhoA gene

1.4??siRNA轉(zhuǎn)染沉默RhoA基因

轉(zhuǎn)染前1?d按照每孔1×105個(gè)分別將舌癌Tca8113 和SCC-4細(xì)胞接種于不同的24孔板中，每孔培養(yǎng)基500 μL，不含抗生素。貼壁細(xì)胞融合率達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用50 μL Opti-MEI低血清（或無血清）培養(yǎng)基稀釋20?pmol?siRNA（轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA終濃度為33?nmol·L-1），輕輕混勻；使用前輕輕搖勻Lipofec-tamine2000，然后取1 μL Lipofectamine2000在50 μL Opti-MEI培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5?min。將前兩步所稀釋的siRNA和Lipofectamine2000混合（使總體積為100 μL），輕輕混勻，室溫放置20?min。每孔細(xì)胞中加入100 μL轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。37?℃培養(yǎng)48?h后檢測基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA，其中實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組分別對(duì)應(yīng)序列1的RhoA-siRNA和序列2的RhoA-siRNA；陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染NC-siRNA組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC-siRNA；空白對(duì)照組為轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipo組，僅加入轉(zhuǎn)染混合液，不轉(zhuǎn)染任何的siRNA。

1.5??實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reac-?????tion，PCR）檢測各組RhoA?mRNA的表達(dá)

按照Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA含量，取5 μL總RNA，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再取5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照。RhoA基因的引物序列，上游：5’-TTCCATCGACAGCCCTGATAGTTTA-3’，下游：5’-CACGTTGGGACAGAAATGCTTG-3’；GAPDH基因的引物序列，上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反應(yīng)條件：95?℃?30?s；然后95?℃?5?s，60?℃?34?s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測和數(shù)據(jù)分析由Stratagene熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，采用2-??Ct公式計(jì)算RhoA?mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中Ct值為循環(huán)閾值。

1.6???蛋白質(zhì)印跡法（Western?blot）檢測目的蛋白的表達(dá)

棄培養(yǎng)液后PBS沖洗細(xì)胞3次，用RIPA蛋白裂解液裂解，操作于冰上進(jìn)行，4?℃下10?000?r·min-1（離心半徑為4?cm）離心5?min取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic?acid，BCA）法測蛋白濃度后，100?℃變性10?min。用12%聚丙烯酰胺凝膠分離，再電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2?h后，單克隆抗體RhoA（1︰200）、半乳糖凝集素-3 （galectin-3）（1︰500）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinase，MMP）-9（1︰1?000）、β-actin （1︰1?000）4?℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine?buffered?saline，TBS-T）洗滌，辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1︰5?000）室溫孵育2?h，PBS洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminesce nce，ECL）溶液顯色曝光。

1.7??細(xì)胞體外侵襲能力的檢測

將質(zhì)量濃度為0.5?g·L-1的Matrigel人工基質(zhì)膠20 μL鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜（孔徑8 μm）的上表面，置37?℃?30?min使其聚成凝膠。Transwell上室中分別加入已消化重懸的各組細(xì)胞100 μL（1× 108個(gè)·mL-1），下室中分別加入對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)上清液，每孔600 μL。每個(gè)孔重復(fù)3次。37?℃、5%CO2孵育48?h后取出，PBS清洗，棉簽去除濾膜上層細(xì)胞，將已經(jīng)侵入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞固定并采用瑞氏染色法（Wright’s?stain）對(duì)貼附在聚酯膜上的侵襲細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過8 μm微孔的細(xì)胞數(shù)。以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.8??統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS?12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1???實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RNAi轉(zhuǎn)染后各組RhoA基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Tca8113和SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后，RhoA?mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.05，圖1）。

圖 1??轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后RhoA?mRNA的表達(dá)Fig?1??Expression?of?RhoA?mRNA?after?RhoA-siRNA?transfection

2.2???Western?blot檢測RNAi轉(zhuǎn)染后各組RhoA、gale-??????ctin-3和MMP-9的蛋白表達(dá)

Western?blot檢測結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Tca8113和SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后，RhoA、galectin-3和MMP-9蛋白的表達(dá)均明顯下降（P＜0.05，圖2、3）。

2.3??RhoA?siRNA對(duì)舌癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響

與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Tca8113 和SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后，穿膜細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（P＜0.05，表2，圖4），表明轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后降低了舌癌Tca8113和SCC-4細(xì)胞的體外侵襲能力。

圖 2??轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后galectin-3和MMP-9蛋白的表達(dá)?Fig?2??Expression?of?galectin-3?and?MMP-9?protein?after?RhoA-??siRNA?transfection

圖 3??轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后RhoA蛋白的表達(dá)Fig?3??Expression?of?RhoA?protein?after?RhoA-siRNA?transfection

表 2 ?轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后各組的穿膜細(xì)胞數(shù)?Tab 2 Cells number of transmembrane after RhoA-siRNA transfection

圖 4??轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA后細(xì)胞侵襲能力的檢測 ?倒置相差顯微鏡 ?×?100Fig?4??Evaluation?of?cell?invasion?after?RhoA-siRNA?transfection??inverted?phase?contrast?microscope??×?100

3??討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最為顯著的生物學(xué)特征。舌癌浸潤和轉(zhuǎn)移的程度是影響其臨床預(yù)后的主要因素，也是臨床上患者死亡的主要原因，但舌癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制目前尚未完全闡明。Rho蛋白的激活可引起一系列的效應(yīng)器反應(yīng)，如細(xì)胞黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的變化、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控變化、細(xì)胞周期的調(diào)控變化等[8]，而細(xì)胞骨架在細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附中發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞骨架、細(xì)胞間黏附以及細(xì)胞與基質(zhì)黏附的改變是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的先決和重要條件。

本實(shí)驗(yàn)以舌癌細(xì)胞系Tca8113和SCC-4為研究對(duì)象，將RhoA?siRNA轉(zhuǎn)染至舌癌細(xì)胞中，采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默RhoA基因，使RhoA的基因和蛋白水平表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示利用siRNA可以有效地抑制RhoA基因在舌癌細(xì)胞Tca8113和SCC-4中的表達(dá)，并且可以抑制細(xì)胞的侵襲，而惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移包括基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移和血管生成等一系列步驟，因此推測RhoA基因與舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，RhoA基因的表達(dá)下降，可以使galectin-3和MMP-9的表達(dá)下調(diào)。

gaglectin-3是一種β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，是半乳糖凝集素（galectins）家族中的重要成員之一。galectin-3具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附，參與免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥反應(yīng)及血管生成等[9-10]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，屬于Ⅳ型膠原酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等成分。MMP-9可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜來影響組織的重塑，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和血管的生成，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極為重要的作用[11]。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解以及新生血管的形成則是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移必需且又極其重要的步驟。已有研究證實(shí)[12]，galectin-3與MMP-9之間可以相互發(fā)生作用，在腫瘤細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要功能。galectin-3作為MMP-9的底物，可被MMP-9選擇性地進(jìn)行蛋白分解，產(chǎn)生一個(gè)分子量為22?kU的糖識(shí)別域和一個(gè)分子量為9?kU的氨基酸殘基組成的galectin-3末端片段。裂解之后的galectin-3更容易發(fā)揮作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。galectin-3表達(dá)較低時(shí)，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)有正常的黏附作用；而表達(dá)較高時(shí)，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用減弱，腫瘤細(xì)胞極易穿過基底膜發(fā)生局部浸潤和侵襲。MMP-9除了可以降解細(xì)胞外基質(zhì)之外，還能促進(jìn)腫瘤新生血管的生長[13-14]。血管生成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因素。其存在的機(jī)制可能是通過啟動(dòng)血管基底膜的蛋白降解，為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移打開通路從而形成新的血管；另外可能與活化血管內(nèi)皮生長因子有關(guān)。此外，MMP-9還可能通過裂解基質(zhì)有利于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移從而促進(jìn)淋巴管新生，而新生的毛細(xì)淋巴管僅由單層淋巴內(nèi)皮細(xì)胞組成，管壁薄、基底膜不完整，因而腫瘤細(xì)胞更易于進(jìn)入淋巴管道，進(jìn)而產(chǎn)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]。

目前已經(jīng)證實(shí)RhoA與胰腺癌[16]、結(jié)直腸癌[17-18]、肝癌[19]等惡性腫瘤的侵襲、遷移能力等密切相關(guān)；在舌癌的研究中，通過激活RhoA的上游調(diào)控基因蛋白激酶A（protein?kinase?A，PKA）可以活化RhoA，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)舌癌細(xì)胞的黏附及遷移能力增強(qiáng)[20]，因此證實(shí)了RhoA可以正性調(diào)控舌癌細(xì)胞的侵襲和遷移，但該研究并未對(duì)RhoA調(diào)控下游效應(yīng)基因的分子機(jī)制進(jìn)行探討[20-21]。RhoA對(duì)舌癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)可能與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）有關(guān)[22]，而β-catenin是Wnt信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)蛋白。本研究不僅證實(shí)了RhoA與舌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而且證實(shí)了RhoA可能通過調(diào)控galectin-3與MMP-9來發(fā)揮作用。至于galectin-3、MMP-9與β-catenin之間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制，尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，RhoA-siRNA可以有效地干擾或降低RhoA基因的表達(dá)，從而抑制舌癌Tca8113和SCC-4細(xì)胞的侵襲，這有可能成為一種新的舌癌基因治療方法。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，RhoA可能通過galectin-3與 MMP-9來調(diào)控舌癌細(xì)胞的遷移與侵襲，推測RhoA-siRNA在一定程度上可以阻止舌癌細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移運(yùn)動(dòng)，干擾細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 ?李彩）

[中圖分類號(hào)]Q?78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.016

[收稿日期]2015-09-16；?[修回日期] ?2015-12-18

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金（81372908）；南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2012NJMU248）；青島市衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃項(xiàng)目（2014-WJZD009，2013-WSZD011）

[作者簡介]陳正崗，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：chenzhg1973@163. com

[通信作者]嚴(yán)國鑫，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：yanguo_xin2015@ 163.com

Effects of RhoA gene silencing by RNA interference on invasion of tongue carcinoma

Chen Zhenggang1,2, Tang Yongping1, Tong Lei1, Wang Ying3, Zhou Yuan3, Wang Qimin1, Han Jinhong1, He Zongxuan1, Liao Yixiang1, Fan Bing4, Zou Ronghai4, Zhang Jian4, Sun Xiaofeng4, Yan Guoxin4. (1. Center of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3. College of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261021, China; 4. Dept. of Stomatology, Wuxi No 2. People’s Hospital, Wuxi 214002, China)

Supported by: Natural Science Foundation of China (81372908); Science and Technology Developing Major Project of Nanjing Medical University (2012NJMU248); Science and Technology Planning Project of Qingdao Municipal Health and Family Planning Commission (2014-WJZD009, 2013-WSZD011). Correspondence: Yan Guoxin, E-mail: yanguo_xin2015@ 163.com.

[Abstract]Objective ?To?study?the?effects?of?RhoA?down-regulation?by?RNA?interference?on?the?invasion?of?tongue?carcinoma?Tca8113?and?SCC-4. Methods ?Determination?of?the?human?RhoA?sequence?as?well?as?the?design?and?construction?of?a?short?specific?small?interfering?RNAs?(siRNA)?were?performed.?The?siRNA?of?RhoA?gene?was?transfected?into?human?tongue?squamous?cell?carcinoma?Tca8113?and?SCC-4?cells?line?by?Lipofectamine?2000.?Quantitative?real-time?polymerase? chain?reaction?was?used?to?examine?the?mRNA?expression?levels?of?RhoA.?Protein?expressions?of?mRNA,?galectin-3,?and?matrix?metalloproteinase?(MMP)-9?were?evaluated?by?Western?blot.?Transwell?invasion?assay?was?performed?to?assess?the?invasion?ability?of?tongue?carcinoma.?Results ?RhoA?expressions?in?Tca8113?and?SCC-4?cells?were?reduced?significantly?after?transfection?of?RhoA-siRNA.?Protein?levels?of?galectin-3?and?MMP-9?were?also?down-regulated?significantly.?Invasion?ability?was?inhibited?as?well.?Conclusion ?RhoA-siRNA?can?effectively?inhibit?RhoA?expression?in?Tca8113?and?SCC-4?cells.?The?invasion?ability?of?tongue?carcinoma?cells?decreased?with?down-regulation?of?the?protein?expressions?of?galectin-3?and?MMP-9,?indicating?that?RhoA-siRNA?can?inhibit?invasion?of?tongue?carcinoma.?Results?show?that?RhoA?may?play?an?important?role?in?the?processes?of?invasion?and?metastasis?of?tongue?carcinoma.

[Key words]RhoA?gene;??galectin-3;??matrix?metalloproteinase-9;??RNA?interference;??tongue?carcinoma;??invasion