阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中樹突細(xì)胞的影響

陳志紅??黃桂林??張霓霓??易杰??姚禮??張林.貴州省人民醫(yī)院口腔科，貴陽?55000；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，遵義?563000

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阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中樹突細(xì)胞的影響

陳志紅1黃桂林2張霓霓2易杰2姚禮2張林2
1.貴州省人民醫(yī)院口腔科，貴陽?550002；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，遵義?563000

[摘要]目的 探索阿司匹林及炎癥對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌上清液中樹突細(xì)胞（DC）成熟及功能的影響。方法 通過瘤粒植入術(shù)及機械創(chuàng)傷+高糖飲食的方法，建立兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型，將模型兔分為3組。實驗組：制造頰癌及炎癥后使用阿司匹林灌胃治療3?d；對照組：制造頰癌及炎癥后以生理鹽水灌胃作為對照；空白組：不制造炎癥的單純腫瘤兔組。3?d后收集各組腫瘤標(biāo)本，制成勻漿，取上清液與正常兔外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)以使其向DC分化，采用流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD83、CD86、人類白細(xì)胞DR抗原（HLA-DR）的表達(dá)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果 實驗組和對照組中CD83、CD86、HLA-DR陽性率均低于空白組（P< 0.05），而實驗組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；同樣，實驗組和對照組刺激T細(xì)胞增殖的能力弱于空白組（P<0.05），而兩組間刺激T細(xì)胞增殖的能力無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 炎癥可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)和功能發(fā)揮，短期、小劑量服用阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC的表型改善和功能發(fā)揮無明顯作用。

[關(guān)鍵詞]阿司匹林；?炎癥；?VX-2鱗狀細(xì)胞癌；?樹突細(xì)胞

口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的口腔頜面部惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[1]。阿司匹林是一種非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，已有研究[2-5]發(fā)現(xiàn)該藥物在抑制一些伴有炎癥的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中起重要作用。口腔是一個污染環(huán)境，腫瘤局部常常伴有感染性炎癥，但目前關(guān)于阿司匹林在口腔鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究較少。本研究應(yīng)用阿司匹林治療兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌的局部炎癥，檢測代表樹突細(xì)胞（dendritic?cells，DC）成熟及功能的表面分子CD83、CD86、人類白細(xì)胞DR抗原（human?leukocyte?antigen-DR，HLADR）的表達(dá)及DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。

1 ?材料和方法

1.1??VX-2鱗狀細(xì)胞癌的來源

VX-2鱗狀細(xì)胞癌的荷瘤兔購自中山大學(xué)，為種植在新西蘭兔后腿的VX-2瘤塊。

1.2??實驗動物

25只2～4月齡新西蘭大白兔，質(zhì)量1.5～2.0?kg，雌雄隨機，購自重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

1.3??主要實驗試劑

阿司匹林腸溶片（山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司）；兔外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司），F(xiàn)ITC-HLA-DR、FITC-IgG2a、APC-CD83、APC-IgG1、PE-CD86、PE-IgG1抗體（BD公司，美國）；尼龍毛（鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司）；活細(xì)胞計數(shù)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）。

1.4??實驗方法

1.4.1??兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型的建立 ?參考田軍等[6]的建模方法，切取荷瘤兔的VX-2腫瘤制備成大小約1?mm3的瘤粒，植入到實驗兔頰肌內(nèi)，6~ 7?d可捫及腫瘤形成。第14天，參考張林等[7]的方法建立炎癥模型。在腫瘤表面切除一塊長寬厚分別約為1、1、0.3?cm的黏膜，術(shù)后全部實驗兔以高糖黏性牛奶（白砂糖、水、純牛奶的質(zhì)量比為20∶30∶50）替代普通飲水。第17天，可見腫瘤表面破潰糜爛并伴有腐臭味，提示建模成功。

1.4.2???實驗動物的干預(yù) ??實驗組（VX-2腫瘤+炎癥+阿司匹林組）：選取6只腫瘤伴炎癥模型兔，第17天開始給予阿司匹林片（劑量10?mg·kg-1）灌胃。對照組（VX-2腫瘤+炎癥組）：6只腫瘤伴炎癥模型兔，第17天開始給予20?mL生理鹽水灌胃?？瞻捉M（單純腫瘤組）：6只單純VX-2腫瘤兔，第17天開始給予20?mL生理鹽水灌胃。各組均每天灌胃1次，連續(xù)3?d。

1.4.3??腫瘤組織的病理學(xué)觀察 ?實驗第20天，完整切取各組實驗兔的頰部腫瘤，然后處死動物。部分標(biāo)本放入10%甲醛固定液中固定，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光鏡下觀察各組標(biāo)本的組織學(xué)形態(tài)。其余標(biāo)本按200?g·L-1的質(zhì)量濃度與無血清RPMI?1640培養(yǎng)基混合，制成勻漿，3?000?r·min-1離心20?min，重復(fù)離心2次，取上清液保存于-20?℃冰箱內(nèi)備用。

1.4.4??兔外周血單核細(xì)胞的分離 ?取正常新西蘭大白兔1只，通過心臟穿刺采血15?mL，按淋巴細(xì)胞分離液說明書分離外周血單核細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為2× 106·mL-1，以每孔1?mL的體積加入6孔培養(yǎng)板中，置于37?℃、5%?CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?h，吸棄上清液，剩余細(xì)胞即為單核細(xì)胞。將1.4.3中所得上清液用0.22 μm過濾器過濾除菌3遍，然后與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，并依此分為3組。1）實驗組：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL，添加1?mL腫瘤+炎癥+阿司匹林組上清液。2）對照組：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL，添加1?mL腫瘤+炎癥組上清液。3）空白組：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL，添加1?mL單純腫瘤組上清液。

每組隔日半量換液，細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)，收集部分細(xì)胞在掃描電子顯微鏡（scanning?electron?microscope，SEM）下觀察細(xì)胞形態(tài)。其余的各組細(xì)胞進(jìn)一步行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

1.4.5??流式細(xì)胞儀檢測CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá) ?將各組細(xì)胞制備成為單細(xì)胞懸液，密度為1× 106·mL-1，活細(xì)胞率>95%。將實驗組、對照組、空白組的每組取6個樣本，每個樣本分別設(shè)2個加樣管，即實驗管（100 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL CD83-APC+ 10 μL CD86-PE+10 μL HLA-DR-FITC）和對照管（100 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL IgG1-APC+10 μLIgG1-PE+10 μL IgG2a-FITC），室溫條件下避光孵育20?min。孵育結(jié)束后，1?500?r·min-1離心10?min，棄上清液，PBS清洗2次，加0.5?mL?PBS混勻，然后加0.5?mL?1%多聚甲醛固定，4?℃冰箱避光保存，采用流式細(xì)胞儀檢測CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)情況。

1.4.6??T細(xì)胞的分離（尼龍毛柱法）及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) ??按1.4.4的方法分離外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3?h，輕輕吸取懸浮細(xì)胞備用。按照說明書分離T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106·mL-1。各組加入25?mg·L-1絲裂霉素C，37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱中處理30?min，PBS清洗3遍，懸于含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1。分別以實驗組、對照組、空白組DC作為刺激細(xì)胞，T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，另設(shè)陰性對照組（只添加T細(xì)胞）和單純培養(yǎng)液對照組。將DC和T細(xì)胞以1∶10的比例，每組3個復(fù)孔，置于96孔板混合，終體積 200 μL。置于37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72?h，然后每孔加入活細(xì)胞計數(shù)試劑盒試劑20 μL，繼續(xù)孵育3?h。采用酶標(biāo)儀于450?nm波長處檢測各組的吸光度A值并計算刺激指數(shù)（stimulation?index，SI），SI=（待測樣品孔A值-單純培養(yǎng)液對照組A值）/（陰性對照組A 值-單純培養(yǎng)液對照組A值）。

1.5??統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS?21.0軟件進(jìn)行分析，3組間各指標(biāo)的比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 ?結(jié)果

2.1??兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型的肉眼及病

理學(xué)改變

在炎癥制造后第3天（實驗第17天），肉眼觀可見實驗組和對照組瘤兔的腫瘤外露，組織紅腫、滲血，其中對照組的滲血及紅腫更為嚴(yán)重；空白組頰部腫瘤表面黏膜完整，未見明顯破潰（圖1上）。鏡光下觀察可見各組腫瘤組織異型性明顯，有大量大小和形態(tài)不一的癌細(xì)胞。實驗組和對照組中有較多炎癥細(xì)胞浸潤，而空白組炎癥細(xì)胞浸潤較少（圖1下）。

圖 1??3組兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌的形態(tài)及病理學(xué)改變Fig?1??Morphological?and?pathological?changes?of?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?of?three?groups

2.2??DC的形態(tài)

細(xì)胞培養(yǎng)第6天，在倒置顯微鏡下觀察可見，部分DC呈懸浮或半懸浮狀態(tài)生長，并且聚集成團(tuán)，細(xì)胞呈不規(guī)則形（圖2左）；SEM下可見，DC表面粗糙不平，有大量褶皺及長短、粗細(xì)不等的樹突樣突起（圖2右）。

2.3??各組兔外周血源DC表型的流式細(xì)胞學(xué)檢測

各組兔外周血源DC表型的流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果見表1。將3組CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)情況進(jìn)行方差分析，各組CD83、?CD86和HLA-DR陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為41.003、65.099、27.199，P值均小于0.01）。進(jìn)一步行LSD兩兩比較，CD83、CD86和HLA-DR陽性率在空白組和實驗組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），空白組大于實驗組，而實驗組和對照組之間陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖 2??培養(yǎng)第6天DC的形態(tài)Fig?2??Morphology?of?DC?on?the?sixth?day?of?cell?culture

表 ?1 3組CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)Tab 1 The expression of CD83 , CD86 and HLA-DR of three groups

2.4??混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

實驗組、對照組、空白組經(jīng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測，其刺激T細(xì)胞增殖能力SI的結(jié)果分別為1.547± 0.049、1.553±0.057、1.741±0.028，經(jīng)方差分析，3組間SI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.894，P<0.05）。進(jìn)一步行LSD兩兩比較，實驗組DC刺激T細(xì)胞增殖的能力較空白組弱，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而實驗組與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 ?討論

目前認(rèn)為，阿司匹林可通過環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）依賴途徑和COX-2非依賴途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。COX-2是一種炎癥因子，在腫瘤炎癥微環(huán)境中可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，參與腫瘤侵襲及免疫抑制等機制發(fā)揮作用[9]。其中，免疫抑制就涉及DC，DC是迄今為止發(fā)現(xiàn)的功能最強大且唯一能激活原始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，而在腫瘤炎癥微環(huán)境中，由于受多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子的作用，DC發(fā)生表型缺陷，無法有效提呈腫瘤抗原，從而導(dǎo)致免疫缺陷的發(fā)生[10-12]；因此，從理論意義上來說，阿司匹林可通過抑制COX-2活性，減少前列腺素釋放，減輕腫瘤炎癥微環(huán)境的炎癥，促進(jìn)DC表型改善，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。張洪濤等[13]將應(yīng)用COX-2抑制劑塞來昔布預(yù)處理的C6細(xì)胞上清液與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)第10天收集DC，檢測表面分子CDla、CD80、CD83、CD86的表達(dá)情況，并行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測DC的功能狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各組DC表面分子CDla、CD83的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，單純C6細(xì)胞上清液組中CD80、CD86的表達(dá)低于塞來昔布處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與之相應(yīng)的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力也降低；由此得出結(jié)論認(rèn)為，通過抑制COX-2的活性可降低腫瘤局部微環(huán)境中前列腺素-2的水平，塞來昔布可促進(jìn)DC的表型改善和功能發(fā)揮。

在本實驗中，首先建立兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型，通過肉眼和鏡下觀察各組實驗兔局部炎癥輕重，在連續(xù)3?d使用阿司匹林后，肉眼觀察可見實驗組腫瘤表面紅腫、潰爛情況較對照組稍有好轉(zhuǎn)，鏡下觀察見腫瘤組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤無明顯減少，實驗組中DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR較對照組稍有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與空白組相比，仍明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣地，實驗組刺激T細(xì)胞增殖的能力也無統(tǒng)計學(xué)意義，這與張洪濤等[13]的研究結(jié)果不完全一致。筆者推測可能的原因為：首先，阿司匹林為抗炎藥物，實驗兔腫瘤局部伴有感染，阿司匹林并不具有抗感染作用，因此，不能從病因上減輕腫瘤局部炎癥；其次，早有研究[14]發(fā)現(xiàn)，長期服用阿司匹林可使癌癥發(fā)病率或死亡率降低40%，近年Rothwell等[15]和Bastiaannet 等[16]的研究仍支持這一觀點，但是短期服用阿司匹林則幾乎不能受益，因此本實驗結(jié)果可能與服藥時間有關(guān)；再次，關(guān)于阿司匹林使用劑量的問題，近年來的研究結(jié)果也不完全一致，多數(shù)研究認(rèn)為低劑量的阿司匹林可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)，也有部分研究[17]認(rèn)為低劑量阿司匹林不能增加腫瘤的生存率；最后，有研究[9]認(rèn)為，阿司匹林發(fā)揮抗腫瘤作用與腫瘤類型、微環(huán)境情況密切相關(guān)。

通過本實驗可以看出，短時間內(nèi)阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC表型的改善及功能的發(fā)揮無明顯作用，這可能與其劑量和作用時間有關(guān)。接下來將進(jìn)一步從多種劑量和多個時間點來探索阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC的影響。

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（本文編輯 ?吳愛華）

[中圖分類號]R?730.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.015

[收稿日期]2015-08-25；?[修回日期] ?2015-11-12

[基金項目]遵義市科技局科研基金[遵市科合社字（2013）32號]

[作者簡介]陳志紅，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：465936809@qq.com

[通信作者]黃桂林，主任醫(yī)師，博士，E-mail：chaojiehuanghgl@163. com

Effects of aspirin on dendritic cells in the inflammatory microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell car-cinoma

Chen Zhihong1, Huang Guilin2, Zhang Nini2, Yi Jie2, Yao Li2, Zhang Lin2. (1. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550002, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China)
Supported by: Technology Bureau Scientific Research Foundation of Zunyi (No. 32 in 2013). Correspondence: Huang Guilin, E-mail: chaojiehuanghgl@163.com.

[Abstract]Objective To?explore?the?effects?of?aspirin?and?inflammation?on?the?maturation?and?function?of?dendritic?cells?(DC)?on?the?supernatant?of?VX-2?squamous?cell?carcinoma.?Methods???The?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?models?with?inflammation?were?established?by?tumor?particle?implantation,?mechanical?trauma,?and?high?sugar?diet.?The?rabbits?were?divided?into?three?groups.?For?the?experimental?group?(rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?with?local?inflammation),?aspirin?were?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?For?the?control?group?(rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?with?local?inflammation),?normal?saline?was?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?For?the?blank?group?(tumor?without?inflammation),?normal?saline?was?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?Each?tumor?specimens?were?collected?in?three?days?and?made?into?tissue?homogenate.?The?supernatant?was?collected?after?centrifugation.?Normal?rabbit?peripheral?blood?mononuclear?cells?were?separated?and?co-cultured?with?different?states?of?supernatant.?The?expression?of?DC?surface?markers?CD83,?CD86,?and?human?leukocyte?antigen-DR?(HLA-DR)?were?detected?by?flow?cytometry.?The?state?of?function?of?DC?was?tested?by?mixed?lymphocyte?reaction.?Results???The?positive?rate?of?CD83,?CD86,?and?HLA-DR?of? the?experimental?and?control?groups?were?both?lower?than?that?of?the?blank?group?(P<0.05).?In?addition,?the?ability?to?stimulate?T?cell?proliferation?of?the?experimental?and?control?groups?were?weaker?than?that?of?the?blank?group?(P<0.05).?No?significant?difference?was?observed?between?the?experi-mental?and?control?groups?(P>0.05).?Conclusion???Inflammation?may?inhibit?the?function?and?expression?of?CD83,?CD86,?and?HLADR?of?DC.?The?short-term?administration?of?aspirin?is?not?conducive?to?the?phenoty?and?function?of?DC?in?a?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?inflammatory?environment.

[Key words]aspirin;??inflammation;??VX-2?squamous?cell?carcinoma;??dendritic?cell