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    阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中樹突細(xì)胞的影響

    2016-07-08 04:42:50陳志紅黃桂林張霓霓易杰姚禮張林貴州省人民醫(yī)院口腔科貴陽55000遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科遵義563000
    華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2016年2期
    關(guān)鍵詞:鱗狀阿司匹林炎癥

    陳志紅??黃桂林??張霓霓??易杰??姚禮??張林.貴州省人民醫(yī)院口腔科,貴陽?55000;.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,遵義?563000

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    阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中樹突細(xì)胞的影響

    陳志紅1黃桂林2張霓霓2易杰2姚禮2張林2
    1.貴州省人民醫(yī)院口腔科,貴陽?550002;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,遵義?563000

    [摘要]目的 探索阿司匹林及炎癥對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌上清液中樹突細(xì)胞(DC)成熟及功能的影響。方法 通過瘤粒植入術(shù)及機械創(chuàng)傷+高糖飲食的方法,建立兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型,將模型兔分為3組。實驗組:制造頰癌及炎癥后使用阿司匹林灌胃治療3?d;對照組:制造頰癌及炎癥后以生理鹽水灌胃作為對照;空白組:不制造炎癥的單純腫瘤兔組。3?d后收集各組腫瘤標(biāo)本,制成勻漿,取上清液與正常兔外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)以使其向DC分化,采用流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD83、CD86、人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)的表達(dá),混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果 實驗組和對照組中CD83、CD86、HLA-DR陽性率均低于空白組(P< 0.05),而實驗組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);同樣,實驗組和對照組刺激T細(xì)胞增殖的能力弱于空白組(P<0.05),而兩組間刺激T細(xì)胞增殖的能力無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 炎癥可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)和功能發(fā)揮,短期、小劑量服用阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC的表型改善和功能發(fā)揮無明顯作用。

    [關(guān)鍵詞]阿司匹林;?炎癥;?VX-2鱗狀細(xì)胞癌;?樹突細(xì)胞

    口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的口腔頜面部惡性腫瘤,在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[1]。阿司匹林是一種非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥,已有研究[2-5]發(fā)現(xiàn)該藥物在抑制一些伴有炎癥的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中起重要作用。口腔是一個污染環(huán)境,腫瘤局部常常伴有感染性炎癥,但目前關(guān)于阿司匹林在口腔鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究較少。本研究應(yīng)用阿司匹林治療兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌的局部炎癥,檢測代表樹突細(xì)胞(dendritic?cells,DC)成熟及功能的表面分子CD83、CD86、人類白細(xì)胞DR抗原(human?leukocyte?antigen-DR,HLADR)的表達(dá)及DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。

    1 ?材料和方法

    1.1??VX-2鱗狀細(xì)胞癌的來源

    VX-2鱗狀細(xì)胞癌的荷瘤兔購自中山大學(xué),為種植在新西蘭兔后腿的VX-2瘤塊。

    1.2??實驗動物

    25只2~4月齡新西蘭大白兔,質(zhì)量1.5~2.0?kg,雌雄隨機,購自重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

    1.3??主要實驗試劑

    阿司匹林腸溶片(山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司);兔外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司),F(xiàn)ITC-HLA-DR、FITC-IgG2a、APC-CD83、APC-IgG1、PE-CD86、PE-IgG1抗體(BD公司,美國);尼龍毛(鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司);活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。

    1.4??實驗方法

    1.4.1??兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型的建立 ?參考田軍等[6]的建模方法,切取荷瘤兔的VX-2腫瘤制備成大小約1?mm3的瘤粒,植入到實驗兔頰肌內(nèi),6~ 7?d可捫及腫瘤形成。第14天,參考張林等[7]的方法建立炎癥模型。在腫瘤表面切除一塊長寬厚分別約為1、1、0.3?cm的黏膜,術(shù)后全部實驗兔以高糖黏性牛奶(白砂糖、水、純牛奶的質(zhì)量比為20∶30∶50)替代普通飲水。第17天,可見腫瘤表面破潰糜爛并伴有腐臭味,提示建模成功。

    1.4.2???實驗動物的干預(yù) ??實驗組(VX-2腫瘤+炎癥+阿司匹林組):選取6只腫瘤伴炎癥模型兔,第17天開始給予阿司匹林片(劑量10?mg·kg-1)灌胃。對照組(VX-2腫瘤+炎癥組):6只腫瘤伴炎癥模型兔,第17天開始給予20?mL生理鹽水灌胃??瞻捉M(單純腫瘤組):6只單純VX-2腫瘤兔,第17天開始給予20?mL生理鹽水灌胃。各組均每天灌胃1次,連續(xù)3?d。

    1.4.3??腫瘤組織的病理學(xué)觀察 ?實驗第20天,完整切取各組實驗兔的頰部腫瘤,然后處死動物。部分標(biāo)本放入10%甲醛固定液中固定,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,置于光鏡下觀察各組標(biāo)本的組織學(xué)形態(tài)。其余標(biāo)本按200?g·L-1的質(zhì)量濃度與無血清RPMI?1640培養(yǎng)基混合,制成勻漿,3?000?r·min-1離心20?min,重復(fù)離心2次,取上清液保存于-20?℃冰箱內(nèi)備用。

    1.4.4??兔外周血單核細(xì)胞的分離 ?取正常新西蘭大白兔1只,通過心臟穿刺采血15?mL,按淋巴細(xì)胞分離液說明書分離外周血單核細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為2× 106·mL-1,以每孔1?mL的體積加入6孔培養(yǎng)板中,置于37?℃、5%?CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?h,吸棄上清液,剩余細(xì)胞即為單核細(xì)胞。將1.4.3中所得上清液用0.22 μm過濾器過濾除菌3遍,然后與單核細(xì)胞共培養(yǎng),并依此分為3組。1)實驗組:每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL,添加1?mL腫瘤+炎癥+阿司匹林組上清液。2)對照組:每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL,添加1?mL腫瘤+炎癥組上清液。3)空白組:每孔加入含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基2?mL,添加1?mL單純腫瘤組上清液。

    每組隔日半量換液,細(xì)胞培養(yǎng)至第6天,收集各組細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá),收集部分細(xì)胞在掃描電子顯微鏡(scanning?electron?microscope,SEM)下觀察細(xì)胞形態(tài)。其余的各組細(xì)胞進(jìn)一步行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

    1.4.5??流式細(xì)胞儀檢測CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá) ?將各組細(xì)胞制備成為單細(xì)胞懸液,密度為1× 106·mL-1,活細(xì)胞率>95%。將實驗組、對照組、空白組的每組取6個樣本,每個樣本分別設(shè)2個加樣管,即實驗管(100 μL細(xì)胞懸液,加入10 μL CD83-APC+ 10 μL CD86-PE+10 μL HLA-DR-FITC)和對照管(100 μL細(xì)胞懸液,加入10 μL IgG1-APC+10 μLIgG1-PE+10 μL IgG2a-FITC),室溫條件下避光孵育20?min。孵育結(jié)束后,1?500?r·min-1離心10?min,棄上清液,PBS清洗2次,加0.5?mL?PBS混勻,然后加0.5?mL?1%多聚甲醛固定,4?℃冰箱避光保存,采用流式細(xì)胞儀檢測CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)情況。

    1.4.6??T細(xì)胞的分離(尼龍毛柱法)及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) ??按1.4.4的方法分離外周血單核細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3?h,輕輕吸取懸浮細(xì)胞備用。按照說明書分離T細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×106·mL-1。各組加入25?mg·L-1絲裂霉素C,37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱中處理30?min,PBS清洗3遍,懸于含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1。分別以實驗組、對照組、空白組DC作為刺激細(xì)胞,T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,另設(shè)陰性對照組(只添加T細(xì)胞)和單純培養(yǎng)液對照組。將DC和T細(xì)胞以1∶10的比例,每組3個復(fù)孔,置于96孔板混合,終體積 200 μL。置于37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72?h,然后每孔加入活細(xì)胞計數(shù)試劑盒試劑20 μL,繼續(xù)孵育3?h。采用酶標(biāo)儀于450?nm波長處檢測各組的吸光度A值并計算刺激指數(shù)(stimulation?index,SI),SI=(待測樣品孔A值-單純培養(yǎng)液對照組A值)/(陰性對照組A 值-單純培養(yǎng)液對照組A值)。

    1.5??統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS?21.0軟件進(jìn)行分析,3組間各指標(biāo)的比較使用方差分析,兩兩比較使用LSD檢驗,檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

    2 ?結(jié)果

    2.1??兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型的肉眼及病

    理學(xué)改變

    在炎癥制造后第3天(實驗第17天),肉眼觀可見實驗組和對照組瘤兔的腫瘤外露,組織紅腫、滲血,其中對照組的滲血及紅腫更為嚴(yán)重;空白組頰部腫瘤表面黏膜完整,未見明顯破潰(圖1上)。鏡光下觀察可見各組腫瘤組織異型性明顯,有大量大小和形態(tài)不一的癌細(xì)胞。實驗組和對照組中有較多炎癥細(xì)胞浸潤,而空白組炎癥細(xì)胞浸潤較少(圖1下)。

    圖 1??3組兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌的形態(tài)及病理學(xué)改變Fig?1??Morphological?and?pathological?changes?of?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?of?three?groups

    2.2??DC的形態(tài)

    細(xì)胞培養(yǎng)第6天,在倒置顯微鏡下觀察可見,部分DC呈懸浮或半懸浮狀態(tài)生長,并且聚集成團(tuán),細(xì)胞呈不規(guī)則形(圖2左);SEM下可見,DC表面粗糙不平,有大量褶皺及長短、粗細(xì)不等的樹突樣突起(圖2右)。

    2.3??各組兔外周血源DC表型的流式細(xì)胞學(xué)檢測

    各組兔外周血源DC表型的流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果見表1。將3組CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)情況進(jìn)行方差分析,各組CD83、?CD86和HLA-DR陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為41.003、65.099、27.199,P值均小于0.01)。進(jìn)一步行LSD兩兩比較,CD83、CD86和HLA-DR陽性率在空白組和實驗組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),空白組大于實驗組,而實驗組和對照組之間陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    圖 2??培養(yǎng)第6天DC的形態(tài)Fig?2??Morphology?of?DC?on?the?sixth?day?of?cell?culture

    表 ?1 3組CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)Tab 1 The expression of CD83 , CD86 and HLA-DR of three groups

    2.4??混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

    實驗組、對照組、空白組經(jīng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測,其刺激T細(xì)胞增殖能力SI的結(jié)果分別為1.547± 0.049、1.553±0.057、1.741±0.028,經(jīng)方差分析,3組間SI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.894,P<0.05)。進(jìn)一步行LSD兩兩比較,實驗組DC刺激T細(xì)胞增殖的能力較空白組弱,兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而實驗組與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    3 ?討論

    目前認(rèn)為,阿司匹林可通過環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)依賴途徑和COX-2非依賴途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。COX-2是一種炎癥因子,在腫瘤炎癥微環(huán)境中可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤血管生成,參與腫瘤侵襲及免疫抑制等機制發(fā)揮作用[9]。其中,免疫抑制就涉及DC,DC是迄今為止發(fā)現(xiàn)的功能最強大且唯一能激活原始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞,而在腫瘤炎癥微環(huán)境中,由于受多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子的作用,DC發(fā)生表型缺陷,無法有效提呈腫瘤抗原,從而導(dǎo)致免疫缺陷的發(fā)生[10-12];因此,從理論意義上來說,阿司匹林可通過抑制COX-2活性,減少前列腺素釋放,減輕腫瘤炎癥微環(huán)境的炎癥,促進(jìn)DC表型改善,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。張洪濤等[13]將應(yīng)用COX-2抑制劑塞來昔布預(yù)處理的C6細(xì)胞上清液與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng),培養(yǎng)第10天收集DC,檢測表面分子CDla、CD80、CD83、CD86的表達(dá)情況,并行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測DC的功能狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組DC表面分子CDla、CD83的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,單純C6細(xì)胞上清液組中CD80、CD86的表達(dá)低于塞來昔布處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與之相應(yīng)的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力也降低;由此得出結(jié)論認(rèn)為,通過抑制COX-2的活性可降低腫瘤局部微環(huán)境中前列腺素-2的水平,塞來昔布可促進(jìn)DC的表型改善和功能發(fā)揮。

    在本實驗中,首先建立兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌及其炎癥模型,通過肉眼和鏡下觀察各組實驗兔局部炎癥輕重,在連續(xù)3?d使用阿司匹林后,肉眼觀察可見實驗組腫瘤表面紅腫、潰爛情況較對照組稍有好轉(zhuǎn),鏡下觀察見腫瘤組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤無明顯減少,實驗組中DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR較對照組稍有升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而與空白組相比,仍明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣地,實驗組刺激T細(xì)胞增殖的能力也無統(tǒng)計學(xué)意義,這與張洪濤等[13]的研究結(jié)果不完全一致。筆者推測可能的原因為:首先,阿司匹林為抗炎藥物,實驗兔腫瘤局部伴有感染,阿司匹林并不具有抗感染作用,因此,不能從病因上減輕腫瘤局部炎癥;其次,早有研究[14]發(fā)現(xiàn),長期服用阿司匹林可使癌癥發(fā)病率或死亡率降低40%,近年Rothwell等[15]和Bastiaannet 等[16]的研究仍支持這一觀點,但是短期服用阿司匹林則幾乎不能受益,因此本實驗結(jié)果可能與服藥時間有關(guān);再次,關(guān)于阿司匹林使用劑量的問題,近年來的研究結(jié)果也不完全一致,多數(shù)研究認(rèn)為低劑量的阿司匹林可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā),也有部分研究[17]認(rèn)為低劑量阿司匹林不能增加腫瘤的生存率;最后,有研究[9]認(rèn)為,阿司匹林發(fā)揮抗腫瘤作用與腫瘤類型、微環(huán)境情況密切相關(guān)。

    通過本實驗可以看出,短時間內(nèi)阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC表型的改善及功能的發(fā)揮無明顯作用,這可能與其劑量和作用時間有關(guān)。接下來將進(jìn)一步從多種劑量和多個時間點來探索阿司匹林對兔頰VX-2鱗狀細(xì)胞癌炎癥微環(huán)境中DC的影響。

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    [17]?Cardwell?CR,?Kunzmann?AT,?Cantwell?MM,?et?al.?Low-dose?aspirin?use?after?diagnosis?of?colorectal?cancer?does?not?increase?survival:?a?case-control?analysis?of?a?population-based?cohort[J].?Gastroenterology,?2014,?146(3):700-708.

    (本文編輯 ?吳愛華)

    [中圖分類號]R?730.5

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.015

    [收稿日期]2015-08-25;?[修回日期] ?2015-11-12

    [基金項目]遵義市科技局科研基金[遵市科合社字(2013)32號]

    [作者簡介]陳志紅,住院醫(yī)師,碩士,E-mail:465936809@qq.com

    [通信作者]黃桂林,主任醫(yī)師,博士,E-mail:chaojiehuanghgl@163. com

    Effects of aspirin on dendritic cells in the inflammatory microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell car-cinoma

    Chen Zhihong1, Huang Guilin2, Zhang Nini2, Yi Jie2, Yao Li2, Zhang Lin2. (1. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550002, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China)
    Supported by: Technology Bureau Scientific Research Foundation of Zunyi (No. 32 in 2013). Correspondence: Huang Guilin, E-mail: chaojiehuanghgl@163.com.

    [Abstract]Objective To?explore?the?effects?of?aspirin?and?inflammation?on?the?maturation?and?function?of?dendritic?cells?(DC)?on?the?supernatant?of?VX-2?squamous?cell?carcinoma.?Methods???The?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?models?with?inflammation?were?established?by?tumor?particle?implantation,?mechanical?trauma,?and?high?sugar?diet.?The?rabbits?were?divided?into?three?groups.?For?the?experimental?group?(rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?with?local?inflammation),?aspirin?were?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?For?the?control?group?(rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?with?local?inflammation),?normal?saline?was?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?For?the?blank?group?(tumor?without?inflammation),?normal?saline?was?given?by?gavage?for?three?consecutive?days.?Each?tumor?specimens?were?collected?in?three?days?and?made?into?tissue?homogenate.?The?supernatant?was?collected?after?centrifugation.?Normal?rabbit?peripheral?blood?mononuclear?cells?were?separated?and?co-cultured?with?different?states?of?supernatant.?The?expression?of?DC?surface?markers?CD83,?CD86,?and?human?leukocyte?antigen-DR?(HLA-DR)?were?detected?by?flow?cytometry.?The?state?of?function?of?DC?was?tested?by?mixed?lymphocyte?reaction.?Results???The?positive?rate?of?CD83,?CD86,?and?HLA-DR?of? the?experimental?and?control?groups?were?both?lower?than?that?of?the?blank?group?(P<0.05).?In?addition,?the?ability?to?stimulate?T?cell?proliferation?of?the?experimental?and?control?groups?were?weaker?than?that?of?the?blank?group?(P<0.05).?No?significant?difference?was?observed?between?the?experi-mental?and?control?groups?(P>0.05).?Conclusion???Inflammation?may?inhibit?the?function?and?expression?of?CD83,?CD86,?and?HLADR?of?DC.?The?short-term?administration?of?aspirin?is?not?conducive?to?the?phenoty?and?function?of?DC?in?a?rabbit?buccal?VX-2?squamous?cell?carcinoma?inflammatory?environment.

    [Key words]aspirin;??inflammation;??VX-2?squamous?cell?carcinoma;??dendritic?cell

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