Runt相關(guān)基因2修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的研究

馮桂娟??鄭科??宋冬惠??吳森斌??祝頌松??胡靜.南通大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，南通?600；.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院正頜與關(guān)節(jié)外科（四川大學(xué)），成都?6004

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Runt相關(guān)基因2修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的研究

馮桂娟1鄭科1宋冬惠1吳森斌1祝頌松2胡靜2
1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，南通?226001；2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院正頜與關(guān)節(jié)外科（四川大學(xué)），成都?610041

[摘要]目的 探討Runt相關(guān)基因2（Runx2）修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）促進(jìn)兔下頜牽張成骨新骨形成的可行性。方法 將48只成年雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：A組為Runx2重組質(zhì)粒組，B組為不含Runx2重組質(zhì)粒組，C組為生理鹽水對照組。建立兔下頜牽張成骨模型；于牽張的第5天，A組兔牽張間隙內(nèi)注射轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒adv-hRunx2-gfp的自體骨髓MSCs；B組注射轉(zhuǎn)染adv-gfp質(zhì)粒的自體骨髓MSCs；C組注射同體積生理鹽水。在牽張結(jié)束后第8周處死所有動物，進(jìn)行大體、影像學(xué)、組織學(xué)觀察和三點(diǎn)彎曲測試。結(jié)果 CT平掃及組織學(xué)結(jié)果表明，A組牽張間隙內(nèi)新骨形成和骨痂密度均明顯高于B、C組；雙能X線及三點(diǎn)彎曲測試表明，A組牽張間隙內(nèi)新生骨組織密度、新生骨礦物質(zhì)含量及最大載荷均高于B、C組（P<0.01）。結(jié)論 基于MSCs的Runx2體外基因治療可有效地促進(jìn)牽張成骨新骨形成，從而縮短固定期，為臨床顱頜面骨缺損的重建提供一個極具價值的修復(fù)策略。

[關(guān)鍵詞]Runt相關(guān)基因2； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 下頜骨； 牽張成骨

內(nèi)源性骨組織工程的牽張成骨最初在矯正肢體長度差異的矯形手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用，隨后被用于治療顱面短小癥和頜骨缺損。牽張成骨術(shù)是利用骨的自身愈合來增加新骨的一種方法。該技術(shù)通過牽張裝置，使骨切開處的骨組織受到緩慢而穩(wěn)定的牽引和張力，從而達(dá)到增長或伸直骨骼的目的。與傳統(tǒng)骨移植方法相比，牽張成骨能夠避免植骨區(qū)骨吸收以及供骨區(qū)功能障礙等一系列并發(fā)癥，且這種技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)周圍軟組織的三維空間生長并行延長。療程長以及可能的纖維性愈合或不愈合是阻礙牽張成骨廣泛應(yīng)用于臨床的主要因素[1]。Runt相關(guān)基因2 （Runt-related?transcription?factor?2，Runx2）編碼的核蛋白在成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中起重要作用，并參與骨骼基因的表達(dá)和調(diào)控。研究[2]表明，Runx2在體內(nèi)可以有效誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖分化和促進(jìn)新骨生成的質(zhì)量和數(shù)量。因此，促進(jìn)Runx2的表達(dá)可能是一個有效促進(jìn)骨形成的治療途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cells，MSCs）能在體外分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，在體內(nèi)促進(jìn)骨形成，已成為骨組織工程的主要細(xì)胞來源[3]。本研究擬采用Runx2基因修飾的MSCs來促進(jìn)下頜骨牽張成骨過程中的新骨生成，縮短治療周期，從而為臨床運(yùn)用Runx2體外基因治療促進(jìn)牽張成骨新骨形成的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 ?材料和方法

1.1??材料

48只成年雄性新西蘭白色家兔，體重2.6~3.0?kg。實(shí)驗(yàn)動物的喂養(yǎng)與使用遵守南通大學(xué)動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定。48枚單邊純鈦釘、外固定牽張器由本課題組與四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院共同設(shè)計(jì)和研制。牽張器最大牽張距離為20?mm，螺距1.0?mm，使用長35?mm、直徑1.8?mm的純鈦螺釘穿皮質(zhì)骨固定。CT機(jī)（μ CT-80型，Scanco?Medical?AG公司，瑞士）；雙能X線（dual?energy?X?ray，DXA）骨密度檢測儀（FR216Ⅲ1438型，DMS公司，法國，由四川大學(xué)華西醫(yī)院提供）；INSTRON?5565型生物力學(xué)測試系統(tǒng)（Instron公司，美國，由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；重組腺病毒（由北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司構(gòu)建）；兔Runx2抗體（上海博研生物工程研究中心）；兔Runx2引物（上海斯信生物科技有限公司，正向引物5’-GGAATGCCTCTGCTGTTATG-3’；反向引物5’-GGATTTGTGAAGACGGTTATGG-3’）。

1.2??MSCs分離、培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染

采用密度梯度離心法從兔脛骨中分離出骨髓MSCs進(jìn)行培養(yǎng)，取第3代的MSCs用于體外基因轉(zhuǎn)染和體內(nèi)基因移植。構(gòu)建攜帶有人Runx2基因和綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）復(fù)制缺陷型E1-/E3-腺病毒（adv-hRunx2-gfp），構(gòu)建只含有GFP復(fù)制缺陷型E1-/E3-腺病毒（adv-gfp）。當(dāng)骨髓MSCs生長至80%融合時，分別轉(zhuǎn)染adv-hRunx2-gfp和adv-gfp。轉(zhuǎn)染后GFP和Runx2的表達(dá)分別經(jīng)熒光顯微鏡和Western?blot及實(shí)時定量PCR檢測證實(shí)。

1.3??制備兔下頜骨牽張成骨模型

所有的白兔均行右側(cè)下頜骨牽張成骨。以自制的純鈦口外牽張裝置，截開下頜骨后固定。3?d的延遲期后以每天2?mm的速度逐漸牽張5?d。將48只兔子隨機(jī)分為3組，A組為Runx2重組質(zhì)粒組，B組為不含Runx2重組質(zhì)粒組，C組為生理鹽水對照組。術(shù)后2周內(nèi)喂予軟質(zhì)飼料，并每日肌注青霉素預(yù)防感染。

1.4??基因治療

在牽張的第5天，A組在牽張間隙內(nèi)注射含有1× 107個adv-hRunx2-gfp轉(zhuǎn)染的MSCs（重懸于0.15?mL生理鹽水中），B組注射含有相同劑量的adv-gfp轉(zhuǎn)染的MSCs（重懸于0.15?mL生理鹽水中），C組僅注射0.15?mL生理鹽水。

1.5??標(biāo)本獲取及檢測

在牽張結(jié)束后第8周動物均被處死，解剖并獲取牽張側(cè)的下頜骨。

1.5.1??大體觀察 ?觀察實(shí)驗(yàn)動物的一般表現(xiàn)、傷口愈合情況、下頜骨牽張區(qū)域新骨形成及新生骨與原宿主骨交界情況。

1.5.2???影像學(xué)觀察 ??各組動物分別行牽張成骨區(qū)CT平掃、DXA檢測，并測量下頜骨牽張間隙內(nèi)的骨密度（bone?mineral?density，BMD）及骨礦物質(zhì)含量（bone?mineral?content，BMC），觀察延長區(qū)新生骨生長狀況。

1.5.3???三點(diǎn)彎曲測試 ??每組隨機(jī)選取8個標(biāo)本，在生物力學(xué)測試機(jī)上采用三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測定牽張區(qū)成骨標(biāo)本力學(xué)性能直到標(biāo)本破壞，記錄標(biāo)本破壞時的最大載荷。

1.5.4??組織學(xué)觀察 ?取牽張間隙內(nèi)新生骨樣本，放置在4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24?h，EDTA脫鈣4周，經(jīng)石蠟包埋后切取組織學(xué)切片并行蘇木精-伊紅（hema-

toxylin?eosin，HE）染色分析。觀察各組牽張成骨區(qū)骨形成、鈣鹽沉積及骨細(xì)胞生長情況。

1.6??統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS?16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2??結(jié)果

2.1??CT平掃

CT平掃表明，A組牽張間隙內(nèi)新骨形成量明顯高于B組和C組，B組新骨形成量高于C組。A組的新生骨形態(tài)規(guī)則，與兩端自體皮質(zhì)骨開始連續(xù)且與原生骨難以區(qū)分（圖1）。

2.2??組織學(xué)觀察

3組標(biāo)本的組織學(xué)觀察見圖2。3組均可見新生的骨小梁。A組新生骨粗大、密集且排列規(guī)律，基本與原生骨一致；B組雖然新生骨良好，但骨小梁相對較纖細(xì)、大小不一且未能完全充滿牽張區(qū)；C組牽張間隙內(nèi)零星可見纖維組織以及小而無序的骨小梁。

圖 1??3組的CT檢查Fig?1??CT?examination?of?three?groups

圖 2??3組的組織學(xué)觀察 ?HE??×?40Fig?2??Histological?observation?of?three?groups??HE??×?40

2.3??DXA檢測

3組的DXA檢測結(jié)果見表1。A組的BMD是C組的1.86倍，是B組的1.47倍；A組的BMC是C組的1.97倍，是B組的1.52倍。A組的BMD及BMC均高于B、C組（P<0.?01）。

表 1 3組的DXA檢測Tab 1 DXA tests of three groups

2.4??三點(diǎn)彎曲測試結(jié)果

A、B、C組的新生骨最大載荷分別為384、328、254?N。A組新生骨最大載荷是C組的1.51倍，是B組的1.29倍。A組新生骨的最大載荷高于B、C組（P< 0.01）。

3??討論

本實(shí)驗(yàn)通過兔下頜骨快速牽張成骨動物模型的建立，評估了Runx2修飾的MSCs對骨形成和骨礦化的影響，結(jié)果表明MSCs移植可促進(jìn)牽張期的骨形成，且Runx2基因修飾的MSCs的增強(qiáng)效果更顯著。兔下頜牽張成骨過程中，5~7?d的延遲期和0.9~1.0?mm·d-1的牽張頻率被推薦為最佳牽張方法[4]。本實(shí)驗(yàn)采用快速牽張（短延遲期3?d和快速牽張率2?mm·d-1）以模擬一個匱乏的成骨情況，在牽張結(jié)束后8周牽張間隙內(nèi)可見較差的或不成熟的骨再生[5]。牽張過程中在適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激下，原始間充質(zhì)細(xì)胞聚集、定型和增殖并分化為成骨細(xì)胞是牽張間隙新骨再生的關(guān)鍵步驟[5]。牽張間隙骨再生貧乏，要么是原始成骨細(xì)胞聚集和增殖的問題，要么是原始成骨細(xì)胞的分化問題。臨床中尤其在原始細(xì)胞缺乏或外傷及放療后組織受損嚴(yán)重的患者中會出現(xiàn)這些問題[6-7]。因此，在上述情況下需要更多的骨生成時，自體骨髓MSCs補(bǔ)充成骨細(xì)胞似乎是保證牽張區(qū)理想骨再生的一個合理方法。Kitoh等[8-9]報道，在牽張成骨的臨床試驗(yàn)中骨髓MSCs的移植能縮短療程加速新骨形成以減少并發(fā)癥的發(fā)生。本研究表明，與注射生理鹽水的兔相比，將自體骨髓MSCs注入下頜牽張間隙可有更多的新骨形成，牽張間隙骨痂組織鈣化更快。局部移植骨髓MSCs能將更多的循環(huán)干/祖細(xì)胞向損傷區(qū)域聚集并有助于愈合[10]。此外，MSCs有保持成骨細(xì)胞表型譜系和分化成活躍成骨細(xì)胞的潛能，可能會直接分化為成骨細(xì)胞。MSCs較容易從骨髓中隔離和在體外培養(yǎng)。除了直接治療的潛力外，MSCs也被廣泛用作基因轉(zhuǎn)移的載體。

Runx2是一種可有效上調(diào)成骨細(xì)胞的基因表達(dá)并促進(jìn)成骨的骨轉(zhuǎn)錄因子[4,11-12]。研究[13-15]顯示，Runx2的表達(dá)能促進(jìn)骨膜的骨祖細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)MSCs的成骨向分化，Runx2是膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨過程中所需的生長因子，在成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中扮演著重要的角色。局部應(yīng)用Runx2基因療法可以促進(jìn)新骨形成的質(zhì)量[16]。本研究通過影像學(xué)、DXA、組織學(xué)檢查及生物力學(xué)測試表明，Runx2基因治療應(yīng)用于下頜骨快速牽張成骨中可促進(jìn)新骨生成的骨誘導(dǎo)效應(yīng)。Runx2基因傳遞到牽張間隙的時間是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)，固定早期階段是成骨最活躍的時期，在此時大量的骨源細(xì)胞和內(nèi)源性生長因子在牽張間隙內(nèi)積聚[17]。另一項(xiàng)研究[18]表明，在早期階段Runx2可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，但在后期會抑制成骨細(xì)胞的分化和成熟從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此外源Runx2基因傳遞到牽張間隙內(nèi)的最佳時間應(yīng)為牽張期結(jié)束。

復(fù)制缺陷型重組腺病毒是最有效的基因轉(zhuǎn)移載體，并且被廣泛應(yīng)用于傳遞外來基因到細(xì)胞內(nèi)[19-21]。缺陷型腺病毒載體具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和對宿主細(xì)胞的低致病性。此外，這些載體無能力整合到宿主基因組，從而保證了病毒的整組基因無法復(fù)制到宿主細(xì)胞內(nèi)。治療基因的表達(dá)水平在傳遞后逐漸下降，而骨誘導(dǎo)作用最終消失。這些特性規(guī)避了可能激活致瘤基因和通過無限制的轉(zhuǎn)基因表達(dá)引起的不利影響[22]。研究[23-24]表明，含有目的基因的腺病毒能被直接送入再生點(diǎn)，但其可能誘導(dǎo)異位成骨的生長，這尚需要進(jìn)一步的評估。因此本研究選擇使用注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為Runx2基因載體而不是直接的基因傳遞，結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)染效率和基因治療策略是滿意的。

通過細(xì)胞治療和基因技術(shù)的手段，本研究在兔下頜骨牽張成骨過程中應(yīng)用了一種局部Runx2基因促進(jìn)骨再生的輸送系統(tǒng)，這種方法可能是縮短牽張療程和簡化整個牽張成骨過程的有效方法。該方法為臨床應(yīng)用顱頜面骨缺損的重建尤其是對于那些成骨潛能退化、骨質(zhì)疏松癥及接受放射治療的患者提供了一個極具價值的修復(fù)策略。

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（本文采編 ?李彩）

[中圖分類號]R?782.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.004

[收稿日期]2015-06-16；?[修回日期] ?2015-09-18

[基金項(xiàng)目]江蘇省 “?六大人才高峰 ”?基金（2013-WSW-048）

[作者簡介]馮桂娟，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：fengguijuan2013@126. com

[通信作者]宋冬惠，副教授，博士，E-mail：sdh527@163.com

Mesenchymal stem cells modified with Runt-related transcription factor 2 promote bone regeneration in rabbit man-dibular distraction osteogenesis

Feng Guijuan1, Zheng Ke1, Song Donghui1, Wu Senbin1, Zhu Songsong2, Hu Jing2. (1. Dept. of Stomatology, The Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, China; 2. State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Orthognathic and Temporomandibular Joint Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: “Top Six Types of Talents” Financial Assistance Jiangsu Province Grant (2013-WSW-048). Correspondence: Song Donghui, E-mail: sdh527@163.com.

[Abstract]Objective This?work?investigated?mesenchymal?stem?cells?(MSCs)?modified?with?Runt-related?transcription?factor?2?(Runx2)?therapy?for?bone?regeneration?in?rabbit?mandibular?distraction?osteogenesis.?Methods???Forty-eight?New?Zealand?mature?white?rabbits?were?randomly?divided?into?three?groups?after?the?rabbit?model?of?mandibular?distraction?osteogenesis?was?established:?reconstruction?plasmid?modified?with?Runx2?(group?A),?plasmid?without?Runx2?(group?B),?and?the?same?dose?of?saline?as?control?(group?C).?At?the?fifth?day?of?distraction?phase,?MSCs?with?reconstruction?plasmid?modified?with?adv-hRunx2-gfp?were?injected?into?the?distraction?gap?of?group?A.?MSCs?with?reconstruction?plasmid?modified?with?adv-gfp?was?injected?into?the?distraction?gap?of?group?B,?whereas?group?C?was?injected?with?the?same?dose?of?saline.?At?8?weeks?after?injection,?all?animals?were?sacrificed,?and?the?distracted?mandibles?were?harvested.?The?general?imaging?histological?observation?and?three-point?bending?test?were?used?for?evaluation.?Results???CT?plain?scan?and?histological?analysis?confirmed?that?the?amount?of?new?bone?forming?in?the?distraction?gap?of?group?A?was?significantly?higher?than?those?in?groups?B?and?C.?Dual-energy?X?ray?and?three-point?bending?test?results?also?showed?that?the?bone?mineral?density,?bone?mineral? content,?and?maximum?load?of?the?distraction?gap?of?group?A?were?significantly?higher?than?those?of?groups?B?and?C?(P<0.01).?Conclusion??Runx2-ex vivo?gene?therapy?based?on?MSCs?can?effectively?promote?the?bone?regeneration?in?rabbit?mandibular?distraction?osteogenesis?and?shorten?the?stationary?phase.?Therefore,?reconstruction?of?craniofacial?fracture?would?be?a?valuable?strategy.

[Key words]Runt-related?transcription?factor?2;??mesenchymal?stem?cells;??mandibular;??distraction?osteogenesis