芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量的HPLC分析

李占省劉玉梅*方智遠(yuǎn)楊麗梅莊　木張揚(yáng)勇李凌云孫培田

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)測檢驗(yàn)中心，北京 100081）

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芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量的HPLC分析

李占省1劉玉梅1*方智遠(yuǎn)1楊麗梅1莊木1張揚(yáng)勇1李凌云2孫培田1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)測檢驗(yàn)中心，北京 100081）

摘 要：以23份芥藍(lán)純合自交系和21份雜交F1為試材，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定花薹中萊菔硫烷含量，分析芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明：44份芥藍(lán)材料花薹中萊菔硫烷含量變異范圍為46.89～419.45 mg·kg-1（DW），供試材料間萊菔硫烷含量差異達(dá)顯著水平。獲得了1份萊菔硫烷含量較高的F1材料A86，含量為419.45 mg·kg-1（DW）；3份萊菔硫烷含量較高的高代純合自交系材料A1、A17和A53，含量分別為298.50、354.19、361.06 mg·kg-1（DW），可用于芥藍(lán)抗癌新品種的選育和利用。

關(guān)鍵詞：芥藍(lán)；花薹；萊菔硫烷；高效液相色譜法

李占省，男，博士，助理研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：lizhansheng@caas.cn

芥藍(lán)（Brassica albograbra L．H．Bailey）是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類的一個變種，目前在廣東、廣西、臺灣等地廣泛栽培，可食用部位為花薹、嫩葉和幼苗，富含VC、K、Ca等營養(yǎng)成分和礦物質(zhì)（張慎好 等，2004）。據(jù)報(bào)道，芥藍(lán)還含有4-甲基亞磺?；』蜍眨╣lucoraphanin，GRA或RAA），該成分能被黑芥子酶水解生成生物活性物質(zhì)萊菔硫烷（Fahey et al.，2001）。

萊菔硫烷（sulforaphane，SF）又稱蘿卜硫素，是硫苷中的GRA與黑芥子酶發(fā)生水解反應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物，是一種異硫氰酸鹽類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，GRA普遍存在于十字花科蕓薹屬蔬菜中，如青花菜、甘藍(lán)、芥藍(lán)、羽衣甘藍(lán)等，其水解產(chǎn)物萊菔硫烷是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性較強(qiáng)的有效成分之一（Fahey et al.，2001）。流行病學(xué)和小鼠試驗(yàn)表明，萊菔硫烷能夠顯著降低肝癌（Keck et al.，2003）、乳腺癌（Pawlik et al.，2013）、胃癌（Fahey et al.，2002）、前列腺癌（Cho et al.，2005）、結(jié)腸癌（Rong et al.，2003）、皮膚癌（Xu et al.，2006）等的發(fā)生幾率。其抗癌機(jī)理是通過抑制體內(nèi)Ⅰ相解毒酶的形成和誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶中的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶-GST、還原型輔酶Ⅱ-NADPH、苯醌還原酶-QR、苯醌氧化還原酶-1NQO1等（Singletary & MacDonald，2000；Misiewic et al.，2004）激活并發(fā)揮自身免疫功能；同時，萊菔硫烷在DNA損傷修復(fù)、抑制細(xì)菌和病毒（Galan et al.，2004），誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（Dinkova-Kostova et al.，2002；Yanaka et al.，2005）等方面亦有一定的生理功效，在抗癌新藥開發(fā)與流行病學(xué)研究方面具有重大的社會價值與科研價值。所以，挖掘富含萊菔硫烷的芥藍(lán)種質(zhì)資源并明確其含量變化，將為選育芥藍(lán)抗癌新品種及研究萊菔硫烷活性提供材料和依據(jù)。

陳新娟等（2006）對芥藍(lán)葉和薹中的硫苷成分進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明芥藍(lán)這兩個器官中的硫苷組分相同，均包含6種脂肪族硫苷和4種吲哚族硫苷，其中脂肪族硫苷包含萊菔硫烷前體GRA；同時指出花薹中脂肪族硫苷含量較高，而葉中吲哚族硫苷含量較高。孫勃等（2011）在對芥藍(lán)不同器官主要營養(yǎng)成分的報(bào)道中指出，芥藍(lán)的一些品種富含GRA成分，且該成分在總硫苷含量中所占比例較大，這為從芥藍(lán)中篩選富含GRA的材料提供了依據(jù)。當(dāng)前對萊菔硫烷的報(bào)道多集中在青花菜上，何洪巨等（2003）、夏薇等（2005）、Liang等（2006）、張嬋娟等（2007）都證實(shí)了青花菜富含萊菔硫烷成分，并且分布在不同的營養(yǎng)器官中，如花球、莖和種子等，采用的檢測方法主要為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。而對芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量的研究鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)以23份芥藍(lán)高代純合自交系和21份雜交F1為試材，采用HPLC法測定其萊菔硫烷含量，分析其含量變化規(guī)律，旨在篩選出萊菔硫烷含量較高的芥藍(lán)材料，為選育高萊菔硫烷含量的芥藍(lán)抗癌新品種和滿足人們的多樣化需求奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以2014年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)基地的23份芥藍(lán)高代純合自交系和21份雜交F1為試驗(yàn)材料，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每重復(fù)20株。

芥藍(lán)成熟期選取成熟度一致的芥藍(lán)主花薹（商品芥藍(lán)），每重復(fù)取5株，去除下端的大葉，保留靠近上端的嫩葉，切段后用液氮處理，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，經(jīng)機(jī)械粉碎后于4 ℃干燥器中密封保存。

1.2萊菔硫烷提取

準(zhǔn)確稱取粉碎后的芥藍(lán)樣品0.50 g，加入pH值為7.0的磷酸鉀緩沖液（0.1 mol·L-1，用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制）15.0～20.0 mL，酶解2.0 h后加入乙酸乙酯30 mL萃?。ㄊ覝兀?，然后5 500 rpm離心10.0 min，取上清液；重復(fù)萃取2次后合并3次萃取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸干（35 ℃），最后用10.0 mL色譜級甲醇定容，經(jīng)0.22 μm過濾膜后-20 ℃低溫保存待測。

1.3HPLC檢測

1.3.1色譜條件 采用SHIMADZU LC-20A系列高效液相色譜儀，配備Waters PAH反相C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流速0.8 mL·min-1，柱溫32 ℃，檢測波長254 nm，自動進(jìn)樣量為10 μL，梯度洗脫見表1；流動相A泵為5%四氫呋喃溶液，流動相B泵為100%甲醇，25.0 min時結(jié)束進(jìn)樣。

1.3.2線性方程、精密度、回收率 將10.0 mg萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品（美國LKT公司，純度≥98%）用色譜級甲醇定容于10.0 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再分別稀釋成濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、200.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（橫坐標(biāo)）和濃度（縱坐標(biāo)）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 梯度洗脫程序

精密度測定：吸取濃度為50 μg·mL-1的萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，反復(fù)進(jìn)樣測定6次（n=6），根據(jù)測得的峰面積計(jì)算精密度。

回收率測定：先準(zhǔn)確稱取濃度為100 μg· mL-1的萊菔硫烷樣品100 μL，再分別加入5.51、12.55、20.43、45.51、60.27、80.69 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2萊菔硫烷提取方法測定回收率。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA。

2　結(jié)果與分析

2.1精密度與回收率

采用HPLC法，分別對濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、200.0 μg·mL-1的萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積（橫坐標(biāo)）和濃度（縱坐標(biāo)）計(jì)算線性方程。結(jié)果表明，萊菔硫烷在5.0～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)的線性方程為y=3.691× 10-4x-1.264，R2=0.999 5（RSD=1.27%）。

精密度良好，測得的6次峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.24%。

回收率較高，6次樣品中萊菔硫烷的平均加樣回收率為96.3%（RSD=1.30%）。

2.2芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量

HPLC圖譜顯示（圖1），芥藍(lán)提取樣品和萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時間一致，定性出峰時間為7.23 min，峰形較好，不受雜質(zhì)干擾，表明采用該方法能夠準(zhǔn)確檢測到萊菔硫烷成分。

從表2可以看出，44份芥藍(lán)材料花薹中均檢測到萊菔硫烷成分，其含量變異范圍為46.89～419.45 mg·kg-1（DW），平均含量為188.31 mg·kg-1（DW）；供試材料間萊菔硫烷含量差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。44份芥藍(lán)材料中，23份自交系花薹中萊菔硫烷含量變異范圍為79.46～361.06 mg·kg-1（DW），平均含量為195.56 mg·kg-1（DW），最高含量（A53）約是最低含量（A45）的4.5倍；21份F1花薹中萊菔硫烷含量變異范圍為46.89～419.45 mg·kg-1（DW），平均含量為180.16 mg·kg-1（DW），最高含量（A86）約是最低含量（A147）的9倍。雜交F1花薹中的萊菔硫烷含量變幅大于自交系材料，且供試材料中的最低含量和最高含量均為F1材料，這可能與十字花科作物具有明顯的雜交優(yōu)勢有關(guān)。

圖1 萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)樣品和芥藍(lán)提取樣品（A45）的HPLC圖譜

表2 44份芥藍(lán)材料花薹中萊菔硫烷含量

芥藍(lán)自交系材料A1〔298.50 mg·kg-1（DW）〕、A17〔354.19 mg·kg-1（DW）〕和A53〔361.06 mg· kg-1（DW）〕花薹中萊菔硫烷含量較高，可用作育種材料進(jìn)行新品種配制；雜交F1材料A86〔419.45mg·kg-1（DW）〕花薹中萊菔硫烷含量在所有參試材料中最高，可作為抗癌芥藍(lán)新品種進(jìn)行推廣和開發(fā)；另外，雜交F1材料A97〔230.35 mg·kg-1（DW）〕、A106〔304.36 mg·kg-1（DW）〕、A140 〔231.80 mg·kg-1（DW）〕和A145〔240.30 mg· kg-1（DW）〕花薹中萊菔硫烷含量也處于較高水平，可考慮作為富含萊菔硫烷芥藍(lán)品種加以利用，豐富市場品種。

3　結(jié)論與討論

芥藍(lán)是我國特色蔬菜之一，在南方地區(qū)廣泛栽培，其花薹脆嫩、清甜，越來越多的消費(fèi)者開始食用芥藍(lán)。本試驗(yàn)對44份芥藍(lán)材料花薹中萊菔硫烷含量進(jìn)行了測定，豐富了有關(guān)芥藍(lán)營養(yǎng)方面的報(bào)道，其含有的生物活性成分萊菔硫烷已經(jīng)被證實(shí)具有降低癌癥患病率的功能（Keck et al.，2003；Rong et al.，2003；Cho et al.，2005；Xu et al.，2006；Pawlik et al.，2013），這將使得人們對芥藍(lán)的營養(yǎng)價值和醫(yī)學(xué)價值的認(rèn)識更加全面，從而有可能引導(dǎo)人們通過多樣化的攝取食物來提高自身免疫力，最終實(shí)現(xiàn)降低癌癥發(fā)病幾率、提高我國人民的健康水平。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同芥藍(lán)材料花薹中萊菔硫烷含量差異較大，這可能是由基因型決定的，該結(jié)論在青花菜上報(bào)道較多，但在芥藍(lán)中鮮有報(bào)道。Kushad等（1999）、Fahey等（2001）、Farnham等（2004）、Abercrombie等（2005）、謝祝捷等（2010）的研究結(jié)果都表明，青花菜中的GRA主要受基因型調(diào)控。李占省等（2012）對青花菜DH群體花球中萊菔硫烷含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明萊菔硫烷這一性狀受3對主基因并存在加性-上位性+多基因控制，主基因遺傳率較高，為89.28%。陳新娟等（2006）采用HPLC法測定芥藍(lán)薹和葉中的硫苷組分，結(jié)果表明花薹中GRA含量為455.2 μg·g-1（DM），葉中為55.5 μg·g-1（DM），由此可見芥藍(lán)花薹中GRA含量遠(yuǎn)高于葉中，該結(jié)果鼓勵人們多食用芥藍(lán)花薹。但是，GRA自身并沒有生物活性，其水解產(chǎn)物萊菔硫烷才具有抗癌活性，只有通過體外生物提取或體內(nèi)咀嚼消化的方式讓芥藍(lán)中的GRA轉(zhuǎn)化成萊菔硫烷才具有醫(yī)學(xué)功效，因此在食用芥藍(lán)時盡可能養(yǎng)成細(xì)嚼慢咽的習(xí)慣，這樣才能最大程度地生成生物活性成分萊菔硫烷。

本試驗(yàn)參試的44份芥藍(lán)材料中，3份自交系材料A1、A17和A53花薹中的萊菔硫烷含量較高，可作為抗癌芥藍(lán)親本材料配制不育系和新品種，同時也可根據(jù)市場和人們的需要，通過與青花菜雜交配制西蘭薹新品種用于內(nèi)銷和出口。A86花薹中的萊菔硫烷含量在所有參試材料中最高，且為雜交F1，可直接作為抗癌芥藍(lán)新品種進(jìn)行推廣和利用；萊菔硫烷含量處于中等或中上等水平的A97、A106、A140和A145可作為備選抗癌芥藍(lán)品種進(jìn)行推廣和利用，以滿足人們對芥藍(lán)不同風(fēng)味的需要，豐富市場品種。對芥藍(lán)中萊菔硫烷的遺傳代謝機(jī)理進(jìn)行研究，將有助于篩選出富含萊菔硫烷的芥藍(lán)新材料和抗癌新品種，但這方面尚待深入研究。

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Analysis of Sulforaphane in Chinese kale（Brassica albograbra L. H. Bailey）by HPLC

LI Zhan-sheng1，LIU Yu-mei1*，F(xiàn)ANG Zhi-yuan1，YANG Li-mei1，ZHUANG Mu1，ZHANG Yangyong1，LI Ling-yun2，SUN Pei-tian1
（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2Supervision and Testing Center for Vegetable Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）

Abstract：Forty four lines of Chinese kale（Brassica albograbra L．H．Bailey）including 23 high inbred lines and 21 F1generations were used to detect the sulforaphane contents in flower stalk of Chinese kale by RPHPLC，and to analyze the changing rule in sulforaphane contents．The results showed that the changing range of sulforaphane contents in 44 Chinese kale was 46.89-419.45 mg·kg-1（DW），and there were significant differences between sulforaphane contents of the testing lines．Four lines were detected with higher sulforaphane contents，among them one line was F1generation A86 with 419.45 mg·kg-1（DW）sulforaphane content，the other 3 were inbred lines A1，A17 and A53．Their sulforaphane contents were 298.50 mg·kg-1（DW），354.19 mg·kg-1（DW），361.06 mg·kg-1（DW），respectively．They could be used for breeding of Chinese kale in anti-cancer and marketing promotion．

Key words：Brassica albograbra L．H．Bailey；Flower stalk；Sulfoaphane；High performance liquid chromatography（HPLC）

*通訊作者（

Corresponding author）：劉玉梅，女，研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：liuyumei@caas.cn

收稿日期：2015-11-27；接受日期：2016-02-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372067，31501761），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-25-A），國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIPIVFCAAS）