野生型PTEN基因增強(qiáng)青蒿琥酯抑制K562細(xì)胞的作用

成志勇，　徐　倩，　趙亞玲，　付建珠，　谷　蕾，　李　密,　梁麗青，　劉　芳

(1保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科， 河北 保定 071000； 2承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

野生型PTEN基因增強(qiáng)青蒿琥酯抑制K562細(xì)胞的作用

成志勇1△，徐倩1, 2，趙亞玲1, 2，付建珠1, 2，谷蕾1，李密1,梁麗青1，劉芳1

(1保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科， 河北 保定 071000；2承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

[摘要]目的： 探討野生型PTEN轉(zhuǎn)染人白血病K562細(xì)胞系對(duì)青蒿琥酯敏感性的影響及其分子作用機(jī)制。方法: 將野生型PTEN以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染(感染復(fù)數(shù)為200)人白血病K562細(xì)胞(Ad-WT-PTEN)，同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載體腺病毒(Ad)及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照組，與青蒿琥酯(ART)聯(lián)合作用，觀察野生型PTEN增強(qiáng)青蒿琥酯抑制K562細(xì)胞的作用。根據(jù)IC50計(jì)算PTEN對(duì)青蒿琥酯的增敏倍數(shù)。以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，real-time PCR檢測(cè)PTEN 的mRNA水平，Western blot檢測(cè)PTEN、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平；caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3/7的活性。結(jié)果: Ad-WT-PTEN轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，對(duì)青蒿琥酯敏感性明顯增加，依據(jù)IC50計(jì)算增敏倍數(shù)為2.25倍。至第3天，Ad-WT-PTEN +ART組較Ad+ART組細(xì)胞活力下降、凋亡率升高。Ad-WT-PTEN轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后PTEN 的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加，p-Akt水平及caspase-3/7活性下調(diào)，以PTEN及青蒿琥酯聯(lián)合作用組下調(diào)尤為明顯。結(jié)論: 野生型PTEN可能通過(guò)降低K562細(xì)胞Akt磷酸化的水平，并增加caspase-3/7活性，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的敏感性。

[關(guān)鍵詞]PTEN基因； 青蒿琥酯； Akt； Caspase-3/7

青蒿琥酯(artesunate，ART)為青蒿素衍生物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很好的靶向性，同時(shí)毒副作用小，對(duì)正常組織細(xì)胞毒性低[1]。研究顯示，青蒿琥酯能夠抑制多種造血系統(tǒng)腫瘤如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡[2-3]。青蒿素衍生物與吡柔比星、多柔吡星、氟尿嘧啶等多種化療藥物具有協(xié)同作用[4-5]，但其作用機(jī)制尚不清楚。

PTEN作為抑癌基因，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、黏附、浸潤(rùn)、遷移等方面具有重要病理、生理作用。它通過(guò)抑制Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路的磷酸化發(fā)揮抗腫瘤作用。在包括造血系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中存在PTEN表達(dá)下調(diào)[5-7]，并與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)[6]。PTEN基因能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性[5]，但未見(jiàn)與中藥提取物之間的相互作用研究。

青蒿琥酯與抑癌基因PTEN均能夠抑制腫瘤細(xì)胞，而二者之間是否具有相互協(xié)同抗腫瘤作用目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將二者聯(lián)合作用于白血病K562細(xì)胞，探討了二者相互協(xié)同抗白血病作用及可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1藥物與試劑

ART為桂林南藥股份有限公司產(chǎn)品。使用前溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中配成1 g/L，放置于-20 ℃保存。所選用的青蒿琥酯終濃度分別為0、12.5、25和50 mg/L。

碘化丙啶(propidium iodide，PI)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、引物(北京賽百盛)；PTEN抗體、Akt及 p-Akt(Ser473)抗體(Santa Cruz)；山羊抗鼠Ⅱ抗(北京鼎國(guó)生物)；caspase-3/7活性檢測(cè)試劑盒(Promega)。

2細(xì)胞

人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)中培養(yǎng)，放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。293A 細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同K562細(xì)胞。

3方法

3.1腺病毒轉(zhuǎn)染以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為200，加入含有PTEN基因或空載體腺病毒轉(zhuǎn)染人白血病K562細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)綠色熒光的K562細(xì)胞比例，計(jì)算腺病毒轉(zhuǎn)染效率。

3.2實(shí)驗(yàn)分組 陰性對(duì)照(negative control，NC)組：未加用青蒿琥酯，同時(shí)未轉(zhuǎn)染腺病毒； ART組：青蒿琥酯作用K562細(xì)胞組； 空載體腺病毒(Ad)組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體腺病毒； Ad-WT-PTEN組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因組； Ad+ART組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體腺病毒同時(shí)聯(lián)合青蒿琥酯作用組； Ad-WT-PTEN+ART組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因同時(shí)聯(lián)合青蒿琥酯作用組。

3.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)將不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，離心細(xì)胞后，PBS清洗，涂片后Wright染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.4MTT法檢測(cè)K562細(xì)胞活力選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞 1×107/L，加入96孔板。不同處理組在不同時(shí)點(diǎn)加入MTT，繼續(xù)孵育4 h，然后離心去上清，加入DMSO振蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)各處理組的490 nm處吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞活力=1-(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/對(duì)照組A×100%。計(jì)算藥物的IC50(半數(shù)抑制濃度)。實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，計(jì)算PTEN基因?qū)η噍镧ピ雒舯稊?shù)=ART與Ad聯(lián)合作用的IC50/ART與Ad-WT-PTEN聯(lián)合作用的IC50。

3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡收集處理不同處理組不同作用時(shí)間的細(xì)胞，每組1×106個(gè)，用70%乙醇固定，4 ℃過(guò)夜；加入RNA酶， 于37 ℃水浴15～30 min，加入碘化丙啶，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

3.6定量RT-PCR收集不同組細(xì)胞，應(yīng)用1×PBS清洗2次。TRIzol提取總RNA定量，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系總量為25.0 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，上、下游引物各為0.5 μL， 20×SYBR染料 1.25 μL，RealMasterMix 10 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算所檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。PTEN的上游引物序列為5’-TTG TCA TTA TCC GCA CGC TC-3’，下游引物序列為5’-ATA CCA GGA CCA GAG GAA ACC-3’ (產(chǎn)物 101 bp)；β-actin的上游引物序列為5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CCG C-3’，下游引物序列為5’-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3’(產(chǎn)物 382 bp)。

3.7Western blot檢測(cè)PTEN及p-Akt的蛋白水平收集每組107細(xì)胞，1×PBS洗滌2次。將沉淀溶于200 μL細(xì)胞裂解液中4 ℃裂解1 h。4 ℃、 12 000 r/min離心20 min。取上清溶解蛋白質(zhì)，并測(cè)定蛋白含量。配制8%的分離膠和5%的濃縮膠取蛋白樣品，加入上樣緩沖液混勻，充分變性蛋白。120 V恒壓電泳。將凝膠、PVDF膜和濾紙浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。4 ℃、100 V恒壓，轉(zhuǎn)膜約2 h。轉(zhuǎn)膜完畢，取出PVDF膜浸入封閉液，37 ℃封閉1 h。取出封閉好的膜，加入適量用1×TBS稀釋好的 I 抗，4 ℃過(guò)夜。用1×TBS漂洗膜5 min×3次，加入適量用1×TBS稀釋好的 II 抗(辣根酶標(biāo)抗鼠IgG)，37 ℃孵育1 h。TBS漂洗膜5 min×3次。將膜置于培養(yǎng)皿中，加入發(fā)光劑，顯色。后進(jìn)行顯影、定影及灰度掃描分析。

3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p-Akt取對(duì)不同處理組細(xì)胞作用48 h后，收集各組細(xì)胞，用1×PBS清洗2遍，在含2%甲醛中固定10 min，于90%甲醇中4 ℃孵育15 min，各取細(xì)胞懸液100 μL，分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組分別加入PE標(biāo)記的p-Akt抗體各5 μL，對(duì)照組加入IgG 5 μL，各組輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，立即在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，計(jì)數(shù)10 000細(xì)胞，以對(duì)照組作為陰性對(duì)照，CellQuest軟件分析，表達(dá)水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

3.9Caspase-3/7的活性檢測(cè)以MOI=100轉(zhuǎn)染1～3 d后，選取96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取不同轉(zhuǎn)染組的K562細(xì)胞5 000個(gè)(100 μL)，同時(shí)將caspase-3/7底物與緩沖液相混合，取100 μL加入孔板，混合孵育4 h，選取波長(zhǎng)405 nm處吸光度數(shù)值，數(shù)值愈高，caspase活化程度則愈高。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.0計(jì)算，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1不同處理組光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

本研究觀察了對(duì)照組、Ad+12.5 mg/L ART組和Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART組，上述3種處理方法作用K562細(xì)胞3 d后，觀察光鏡下不同處理組的細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果顯示未應(yīng)用任何藥物的對(duì)照組K562細(xì)胞呈圓形，體積大，核染色質(zhì)疏松;Ad+ART處理組的部分細(xì)胞體積縮小，核染色質(zhì)輕度濃縮、邊集;而Ad-WT-PTEN+ART組細(xì)胞大部分出現(xiàn)典型的凋亡變化，細(xì)胞體積明顯縮小，核染色質(zhì)濃縮，部分出現(xiàn)核碎裂及核溶解，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The morphologic changes of the K562 cells with different treatments for 3 d (Wright staining, ×400).

圖1不同處理組3 d后K562細(xì)胞形態(tài)的變化

2野生型PTEN對(duì)白血病K562細(xì)胞活力的影響

腺病毒感染K562細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為(81.2±5.4)%。以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)K562細(xì)胞對(duì)照組、Ad組及Ad-WT-PTEN組的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PTEN基因后0～3 d，各組之間無(wú)明顯差異，4～7 d出現(xiàn)明顯差異，第5天時(shí)細(xì)胞活力下降最大，為61.33%，明顯低于Ad組的94.69%(P<0.05)，而Ad組與NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型PTEN對(duì)青蒿琥酯敏感性的影響

PTEN對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在最初轉(zhuǎn)染野生型PTEN 3 d內(nèi)，細(xì)胞活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異，因此我們檢測(cè)了野生型PTEN聯(lián)合不同濃度青蒿琥酯作用3 d內(nèi)對(duì)K562細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示在干預(yù)后1～3 d，以NC組為對(duì)照，各組細(xì)胞活力為Ad組>Ad-WT-PTEN組>Ad+ART組> Ad-WT-PTEN+ART組，其中NC組、Ad組及Ad-WT-PTEN組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ad-WT-PTEN+ART組的細(xì)胞活力明顯高于其它各組(P<0.05)。其中第3天，Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART組的細(xì)胞活力為明顯低于Ad+12.5 mg/L ART組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

在干預(yù)3 d 后，MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示ART與Ad聯(lián)合作用的IC50為31.89 mg/L，ART與Ad-WT-PTEN聯(lián)合作用的IC50為14.14 mg/L，因此PTEN基因?qū)η噍镧サ脑雒舯稊?shù)為2.25。

4轉(zhuǎn)染野生型PTEN聯(lián)合青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞凋亡率影響

Figure 2.The effects of Ad-WT-PTEN or Ad transfection on the viability of the K562 cells treated with different concentrations of ART. Mean±SD.n=3.

圖2不同濃度ART對(duì)轉(zhuǎn)染Ad-WT-PTEN或Ad的K562細(xì)胞活力的影響

流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示干預(yù)后3 d，Ad+12.5 mg/L ART組及Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART 組均出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，后者細(xì)胞凋亡率高于前者(P<0.01)，二者均高于Ad組及Ad-WT-PTEN組(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。

Figure 3.The apoptotic rate of the K562 cells with different treatmens for 3 d.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組處理K562細(xì)胞3 d后的細(xì)胞凋亡情況

5PTEN基因轉(zhuǎn)染對(duì)K562細(xì)胞PTEN mRNA/蛋白及p-Akt蛋白水平的影響

以MOI為200轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞第3天，PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平最高，3組mRNA水平分別為23.58±4.52、0.575±0.226和0.650±0.516。Ad-WT-PTEN組及Ad組mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的mRNA及蛋白水平(P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)總Akt水平無(wú)明顯變化，而Ad-WT-pTEN組p-Akt水平顯著低于Ad組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein levels of PTEN, p-Akt and total Akt in K562 cells transfected with or withoutPTENgene after 3 d. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAd-WT-PTEN group.

圖4K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染PTEN第3 d 未轉(zhuǎn)染組、Ad組及Ad-WT-PTEN組PTEN、p-Akt及總Akt蛋白水平的變化

6Caspase-3/7活性的檢測(cè)

不同處理組干預(yù)K562細(xì)胞后，PTEN轉(zhuǎn)染聯(lián)合ART組的caspase-3/7活性均高于空載體腺病毒轉(zhuǎn)染聯(lián)合ART組(P<0.05)，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性及劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1不同濃度ART作用K562細(xì)胞3 d后細(xì)胞凋亡率以及作用12 h和24 h后凋亡蛋白caspase-3/7活性的變化

Table 1.The apoptotic rate of the K562 cells with different treatmens after 3 d and the caspase-3 and -7 activity in the K562 cells after treated with different concentrations of ART at 12 h or 24 h (Mean±SD.n=3)

GroupApoptoticrate(%)Caspase-3/7activity12h24hAd1.93±0.850.245±0.0220.256±0.027Ad-WT-PTEN3.12±1.510.252±0.0260.271±0.029Ad+12.5mg/LART19.60±2.10*0.295±0.023*0.321±0.035*Ad-WT-PTEN+12.5mg/LART30.20±3.10*0.368±0.032*0.441±0.046*Ad+25mg/LART26.58±2.80*0.312±0.030*0.384±0.039*Ad-WT-PTEN+25mg/LART43.15±4.50*0.392±0.036*0.531±0.042*

*P<0.05vsAd group and Ad-WT-PTEN group.

討論

青蒿琥酯具有抗腫瘤活性，能抑制多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞如肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡[1]。目前研究顯示，青蒿琥酯亦能夠抑制多種造血系統(tǒng)腫瘤，如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡[2-3]。

本研究表明青蒿琥酯能夠明顯抑制白血病K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能包括降低白血病細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位；激活caspase介導(dǎo)的凋亡通路，誘導(dǎo)凋亡基因如bcl-2、bax、p53等表達(dá)[8]。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路，其磷酸化后，激活下游NF-κB及Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步滅活caspase，在細(xì)胞增殖、凋亡、多藥耐藥中發(fā)揮重要的生理、病理功能[1]，在包括惡性血液病在內(nèi)的多種腫瘤中存在此信號(hào)通路的異?；罨痆5-6]。本研究亦表明在K562細(xì)胞中存在高強(qiáng)度p-Akt的活化。

PTEN通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性調(diào)控Akt去磷酸化發(fā)揮抗腫瘤作用[3, 5, 9]，將野生型PTEN轉(zhuǎn)染白血病K562細(xì)胞系后，能增加細(xì)胞對(duì)阿霉素[5]的敏感性。本研究顯示，野生型PTEN過(guò)表達(dá)的K562細(xì)胞p-Akt水平明顯減低，支持PTEN對(duì)PI3K/Akt通路的去磷酸化作用。

研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有較強(qiáng)的抑制實(shí)體腫瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路的作用，并能上調(diào)抑癌基因PTEN表達(dá)[8]。因此青蒿琥酯能增強(qiáng)多種化療藥物如多柔吡星、利妥昔單抗等抗腫瘤活性[4-5, 10]。

青蒿琥酯及PTEN均能夠抑制PI3K/Akt通路活性，提示二者在抗腫瘤作用機(jī)制中具有協(xié)同累加作用，本研究結(jié)果表明，野生型PTEN過(guò)表達(dá)的K562細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯敏感性明顯增加，對(duì)其增敏倍數(shù)為2.25倍。二者聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞凋亡率亦明顯高于單獨(dú)干預(yù)組。而p-Akt水平及caspase-3/7活性在二者聯(lián)合作用組較單獨(dú)作用組有明顯下調(diào)，因此本研究提示青蒿琥酯與野生型PTEN可能通過(guò)相互協(xié)同作用，共同降低K562細(xì)胞Akt磷酸化水平，并增加caspase-3/7活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，最終達(dá)到誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡作用。

青蒿琥酯具有高效低毒的抗腫瘤活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)靶向作用，與其它抗腫瘤藥物具有相互協(xié)同作用[4-5, 10]。其與PTEN基因聯(lián)合作用，通過(guò)降低p-Akt及抑制caspase活性促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，在抗白血病治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉志龍，曹明溶，李強(qiáng)，等. 青蒿琥酯對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響及聯(lián)合化療藥物的抗肝癌效應(yīng)[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(2): 287-291.

[2]Holien T, Olsen OE, Misund K, et al. Lymphoma and myeloma cells are highly sensitive to growth arrest and apoptosis induced by artesunate[J]. Eur J Haematol, 2013, 91(4):339-346.

[3]王素云，劉志妙，郝洪嶺，等. 青蒿琥酯引起骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226 G2/M期阻滯[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 34(7):794-796.

[4]Hou J, Wang D, Zhang R, et al. Experimental therapy of hepatoma with artemisinin and its derivatives:invitroandinvivoactivity, chemosensitization, and mechanisms of action[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(17):5519-5530.

[5]成志勇，梁文同，王素云，等. PTEN/NF-κB/caspase信號(hào)通路對(duì)K562/ADM細(xì)胞阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2013, 34(2):142-147.

[6]Wang SY, Hao HL, Deng K, et al. Expression levels of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN) and focal adhesion kinase in patients with multiple myeloma and their relationship to clinical stage and extramedullary infiltration[J]. Leuk Lymphoma, 2012, 53(6):1162-1168.

[7]成志勇，顏曉燕，李琳，等. 青蒿琥酯經(jīng)10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因通路誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2015, 31(11):44-48.

[8]Thanaketpaisarn O, Waiwut P, Sakurai H, et al. Artesunate enhances TRAIL-induced apoptosis in human cervical carcinoma cells through inhibition of the NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways[J]. Int J Oncol, 2011, 39(1):279-285.

[9]Martelli AM, Evangelisti C, Chappell W, et al. Targeting the translational apparatus to improve leukemia therapy: roles of the PI3K/PTEN/Akt /mTOR pathway[J]. Leukemia, 2011, 25(7):1064-1079.

[10]Sieber S, Gdynia G, Roth W, et al. Combination treatment of malignant B cells using the anti-CD20 antibody rituximab and the anti-malarial artesunate[J]. Int J Oncol, 2009, 35(1):149-158.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Wild-type PTEN gene enhances the inhibitory effect of artesunate on K562 cell growth

CHENG Zhi-yong1, XU Qian1, 2, ZHAO Ya-ling1, 2, FU Jian-zhu1, 2, GU Lei1, LI Mi1，LIANG Li-qing1,LIU Fang1

(1DepartmentofHematology,TheNo.1HospitalofBaoding,Baoding071000,China；2ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:dzczy@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of wild-type PTEN transfection on the sensitivity of human leukemia K562 cells to artesunate (ART) and its molecular mechanism. METHODS: The adenovirus containing wild-type PTEN (Ad-WT-PTEN) or empty vectors (Ad) were transfected into K562 cells [with multiplicity of infection (MOI)=200]. The untransfected cells served as normal control. The effect of wild-type PTEN on the inhibition of K562 cell growth by ART was observed. The sensitizing ratio of PTEN combined with ART based on IC50was calculated. The viability of K562 cells was detected by MTT assay. The apoptosis was analyzed by flow cytometry. The mRNA level of PTEN was assessed by real-time PCR. The protein expression of PTEN, p-Akt and Akt was detected by Western blot. The activity of caspase-3/7 was measured by caspase activity kits. RESULTS: The sensitivity of K562 cells to ART was significantly increased by 2.25 folds after transfected with PTEN based on the IC50. The cell viability in Ad-WT-PTEN+ART group was significantly lower than that in Ad+ART group after transfection for 3 d (P<0.01). The apoptotic rate in Ad-WT-PTEN+ART group was significantly higher than that in Ad+ART group (P<0.01). The expression of PTEN at mRNA and protein levels in the K562 cells after transfection with PTEN was significantly increased, and the protein level of p-Akt and caspase-3/7 activity were down-regulated, particularly in PTEN combined with ART group. CONCLUSION: The wild-type PTEN gene enhances the sensitivity of the K562 cells to ART by down-regulating the level of p-Akt and up-regulating the caspase-3/7 activity.

[KEY WORDS]PTEN gene; Artesunate; Akt; Caspase-3/7

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0112- 06

[收稿日期]2015- 05- 28[修回日期] 2015- 11- 05

通訊作者△Tel： 0312-2096685; E-mail: dzczy@sohu.com

[中圖分類號(hào)]R730.23; R733

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.019