HPLC同時(shí)測(cè)定地榆升白片中沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的含量

胡佳，王澤宇，廣兵，康敏，李鴻翔，鄧赟

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HPLC同時(shí)測(cè)定地榆升白片中沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的含量

胡佳1，王澤宇1，廣兵2，康敏1，李鴻翔1，鄧赟1

［摘要］目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定地榆升白片制劑中沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的含量方法。方法：采用Inertsil ODS-3色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.），以甲醇-0.05%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；體積流量1 mL.min-1；柱溫30 ℃。結(jié)果：沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的線性范圍分別為20.82～187.38 μg.mL-1（r=0.9996）、20.90～188.10 μg.mL-1（r=0.9998），平均加樣回收率分別為98.99%（RSD=1.88%）和101.09%（RSD =0.58%）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可作為地榆升白片的質(zhì)量控制方法。

［關(guān)鍵詞］地榆升白片；沒(méi)食子酸；（+）-兒茶素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

［作者單位］1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2.成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，成都 610041

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赟，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究

Tel:（028）61800232 Email:dengyun2000@hotmail.com

地榆升白片是由地榆單味藥加工制成的片劑，具有升高白細(xì)胞的作用，用于白細(xì)胞減少癥［1］。臨床上常作為化療期間的輔助用藥［2］，也可用于治療精神病藥所致的白細(xì)胞減少癥［3］、干擾素治療乙型肝炎所致的白細(xì)胞減少癥［4］。處方中地榆是薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長(zhǎng)葉地榆Sanguisorba officinalis L.Var. longifolia（Bert.）Yü et Li的干燥根，具有涼血止血，解毒斂瘡的功效［5］。地榆中主要含有多酚類、皂苷類和黃酮等化學(xué)成分，多酚類成分主要有沒(méi)食子酸、（+）-兒茶素、鞣花酸、沒(méi)食子兒茶素等［6-8］。2010版《中華人民共和國(guó)藥典》中地榆藥材含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)沒(méi)食子酸含量進(jìn)行了測(cè)定。地榆升白片未收錄于2010版《中華人民共和國(guó)藥典》；地榆升白片現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)收錄于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》，在含量測(cè)定項(xiàng)下為采用高效液相色譜法對(duì)沒(méi)食子酸進(jìn)行含量測(cè)定［1］。

現(xiàn)代藥理學(xué)表明，地榆中所含的沒(méi)食子酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射和抗病原微生物等廣泛的藥理作用［9］；此外地榆中所含另一主要活性成分兒茶素也具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等作用［10］，Takano等［11］研究表明兒茶素對(duì)5-氟二氧嘧啶引起的小鼠骨髓抑制所造成的血液毒性有極強(qiáng)的藥理作用，能促進(jìn)其白細(xì)胞和血小板數(shù)量的恢復(fù)和增長(zhǎng)，同時(shí)提高脾臟指數(shù)，具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖的作用。石衛(wèi)民等［12］研究證明兒茶素具有降低輻射對(duì)造血組織的損傷，促進(jìn)造血功能恢復(fù)的作用。兒茶素是升高白細(xì)胞的確切活性成分，而現(xiàn)有的地榆升白片的含量測(cè)定指標(biāo)僅對(duì)沒(méi)食子酸進(jìn)行測(cè)定。為有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)首次建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定地榆升白片中沒(méi)食子酸和兒茶素的含量，該法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，為進(jìn)一步完善地榆升白片的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了科學(xué)方法和依據(jù)。

1　儀器、試藥與藥品

SSI series 1500高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器、CSChrom Plus色譜工作站、美國(guó)SSI公司）；色譜柱Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.）； KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（40 KHz，600 W，昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士奧豪斯DV-215-CD）；優(yōu)普UPT系列超純水器（成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）。

地榆升白片（批號(hào)141215、141111、140811、141208，由成都地奧制藥集團(tuán)有限公司提供）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：11083-201204，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所），（+）-兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：110877-201203，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。液相用甲醇為色譜級(jí)（美國(guó)J.T.Baker），水為超純水，其余試劑為市售分析級(jí)。

2　方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；GL Sciences Inc.）；流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸，梯度洗脫（0～18 min，5%～14%；18～50 min，14%～21%；50～53 min，21%～55%；53～55 min，55%～5%；55～65 min，5%）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；體積流量1 mL.min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)分別按沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素峰計(jì)算均應(yīng)不低于20000。在此色譜條件下，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素均與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取沒(méi)食子酸、（+）-兒茶素對(duì)照品適量，置同一量瓶中，5%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別為沒(méi)食子酸1.041 mg.mL-1、（+）-兒茶素1.045 mg.mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

取地榆升白片（批號(hào)：141215）40片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約3.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖1 對(duì)照品及制劑的HPLC圖（1.沒(méi)食子酸；2. （+）-兒茶素）

2.4 線性關(guān)系

檢測(cè)限和定量限 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品貯備溶液適量，加5%甲醇稀釋，分別配制成含沒(méi)食子酸對(duì)照品20.82、41.64、83.28、104.10、166.56、187.38 μg.mL-1，含（+）-兒茶素對(duì)照品20.90、41.80、83.60、104.50、167.20、188.10 μg .mL-1的混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下平行3次測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg.mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得混合對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和各對(duì)照品回歸方程。將對(duì)照品溶液用甲醇不斷進(jìn)行稀釋后分析，分別得到?jīng)]食子酸和（+）-兒茶素的檢測(cè)限LOD值（S/N≈3）和定量限LOQ值（S/N≈10）。目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、線性范圍、檢測(cè)限和定量限見(jiàn)表1。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素在線性范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好，方法靈敏度高。

表1 地榆升白片中沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的線性關(guān)系（n=3）

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的峰面積RSD值分別為1.19%、1.44%，說(shuō)明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12、24、48 h照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，由峰面積計(jì)算穩(wěn)定性，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的RSD分別為1.36%、1.64%。結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批地榆升白片（批號(hào)：141215）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將測(cè)定沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的峰面積代人“2.5”項(xiàng)下的回歸方程，計(jì)算。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素的RSD分別為1.06%、1.21%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：141215）共6份各約1.8 g，加入1.2 mL的含沒(méi)食子酸對(duì)照品1.046 mg.mL-1、含（+）-兒茶素對(duì)照品1.045 mg.mL-1的對(duì)照品溶液，照2.3項(xiàng)下制備，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸平均回收率98.99%，RSD為1.88%；（+）-兒茶素平均回收率為101.09%，RSD為0.58%。

表2 沒(méi)食子酸、（+）-兒茶素的加樣回收率（n=6）

2.9 含量測(cè)定

取4批地榆升白片制劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值計(jì)算每片地榆升白片的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 地榆升白片含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3　討論

由于本制劑僅含一味藥材，且為原粉入藥，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制劑賦形劑不影響測(cè)定，所以供試品溶液的制備考慮采用中成藥標(biāo)準(zhǔn)中地榆升白片供試品溶液的制備工藝［1］。

本研究經(jīng)DAD全波長(zhǎng)掃描，（+）-兒茶素除末端吸收外，還有一強(qiáng)吸收帶，對(duì)應(yīng)的λ值為280 nm+，與此同時(shí)，沒(méi)食子酸在此條件下也有較好的吸收，故選擇280 nm作為同時(shí)測(cè)定兩種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPLC采用等度洗脫的分離效果不理想，故采用梯度洗脫。沒(méi)食子酸、（+）-兒茶素峰計(jì)算理論塔板數(shù)均大于20000，沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素與其它雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，可滿足定量要求；按此色譜條件選三根不同色譜柱（Inertsil ODS-3，250 mm×4.6 mm；Alltima C18，4.6 mm×250 mm；Kromasil C18，200 mm×4.6 mm）分別測(cè)定理論塔板數(shù)，結(jié)果表明Inertsil ODS-3色譜柱的分離效果較好。分別對(duì)2個(gè)對(duì)照品的檢測(cè)限和定量限進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示沒(méi)食子酸和（+）-兒茶素線性范圍的下限和測(cè)定樣品中的量均遠(yuǎn)高于此定量限，說(shuō)明此分析方法合理，具有靈敏的定量檢測(cè)能力。

本文采用高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，能有效控制質(zhì)量，可作為地榆升白片內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法。

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（責(zé)任編輯：李蕓霞）

·藥理毒理·

Simultaneous determination of the contents of gallic acid and （+）-catechin in Diyu Shengbai tablet by HPLC

HUJia1， WANG Ze-yu1， GUANG Bing2， KANG Min1， LI Hong-xiang1， DENG Yun1//（1. School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan； 2. Chengdu Di'ao Pharmaceutical Group Co. Ltd. Chengdu 610041， Sichuan）

［Abstract］Objective: To establish a method for the simultaneous determination of gallic acid and （+）-catechin in Diyu Shengbai tablet by HPLC. Method: Determination was carried out on Inertsil ODS-3 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm， GL Sciences lnc.） with methanol- 0.05 phosphoric acid as mobile phase. The flow rate maintained at 1 mL.min-1. The column temperature was set at 30 ℃. Result: The calibration curve for gallic acid was linear in the range of 20.82～187.38 μg.mL-1， and for （+）-catechin was linear in the range of 20.90～188.10 μg.mL-1. The average recovery of gallic acid was 98.99% （RSD=1.88%），and （+）-catechin was 101.09% （RSD=0.58%）. Conclusion: This method is simple， sensitive and accurate which can be used for the quality control of Diyu Shengbai tablet.

［Key words］Diyu Shengbai tablet； gallic acid； （+）-catechin； HPLC； content determination

［中圖分類號(hào)］R 284.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-016-03

［基金項(xiàng)目］國(guó) 家科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)（2014ZX0920102-008）；國(guó)家自然基金國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)項(xiàng)目（J13100340-12）；四川省科技廳中藥種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)關(guān)鍵技術(shù)研究及示范 2014SZ0156

［作者簡(jiǎn)介］胡 佳（1991-），女，在讀碩士，主要從事中藥活性成分方向研究

［通訊作者］李 鴻翔，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥化學(xué)成分物質(zhì)基質(zhì)研究

［收稿日期］2015-08-31