波棱瓜子中總木脂素含量測定方法研究

李春沁，劉美琳，董佳悅，王紫燕，張梅

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波棱瓜子中總木脂素含量測定方法研究

李春沁，劉美琳，董佳悅，王紫燕，張梅

［摘要］目的：建立一種波棱瓜子中總木脂素含量測定的方法。方法：以木脂素balanophonin為對照品，采用變色酸-硫酸顯色體系，于566 nm下測定波棱瓜子總木脂素含量。結(jié)果：木脂素balanophonin在5.01～17.535 μg.mL-1與吸光度呈良好線性關系（n=6，r=0.999 1），平均加樣回收率為98.36%，RSD=2.33%（n=6）。結(jié)論：該含量測定方法準確、簡便、經(jīng)濟，適用于波棱瓜子總木脂素的含量測定。

［關鍵詞］波棱瓜子；總木脂素；balanophonin；含量測定；分光光度法

［作者單位］成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

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波棱瓜子系葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜（又名“塞季美朵”）Herpetospermum caudigerum Wall.（H. pedunculosum（Ser.）Baill）的干燥成熟種子，是一種常用藏藥。具有清熱解毒、去火降熱、助消化之功效，治療肝熱、黃疸型傳染性肝炎等癥［1］?；瘜W研究表明，波棱瓜子中含有木脂素類、香豆素類、生物堿、多糖、鞣質(zhì)、氨基酸、油脂及微量元素等多種成分，其中又以木脂素類成分及脂肪油類成分研究最多。藥理研究表明，波棱瓜子中木脂素類成分為其抗肝損傷主要活性成分［2-3］。然而波棱瓜子中總木脂素類成分含量及測定方法尚未見報道，本研究基于其含有的特殊基團酚羥基（若選擇該法則考慮排除其他大類成分的干擾）及文獻報道的測定木脂素類成分的含量測定方法對波棱瓜子中總木脂素含量測定方法進行了研究，旨在建立一種快速、經(jīng)濟、簡便的測定波棱瓜子中總木脂素含量的方法。

1　材料

1.1 藥材

波棱瓜子，2014年3月購于四川甘孜，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院裴瑾教授鑒定為葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.的干燥成熟種子。

1.2 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；BT 125D型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 試劑

對照品balanophonin（實驗室自制）；蒸餾水（實驗室自制）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取波棱瓜子藥材粉末（過50目篩）約1.5 g，加60 mL石油醚加熱回流脫脂，重復兩次，每次1 h，將脫脂后殘渣揮干，加95%乙醇60 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾，濾液蒸干，用甲醇溶解定容至25 mL，備用。2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取對照品balanophonin適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為0.501 mg.mL-1的balanophonin對照品儲備液。

2.2 顯色方法和測定波長的選擇

福林酚顯色法［4］：精密吸取供試品溶液50 μL，加入福林酚試劑0.1 mL，搖勻后加入10%Na2CO35 mL，加水定容至10 mL。試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測定吸收光譜，見圖1。

普魯士藍顯色法［5］：精密吸取供試品溶液100 μL，依次加入0.1 mol.L-1三氯化鐵溶液0.1 mL、0.08 mol.L-1鐵氰化鉀溶液0.1 mL、0.1 mol.L-1鹽酸0.1 mL，加水定容至10 mL，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測定吸收光譜，見圖1。

磷鉬酸顯色法［6］：精密吸取供試品溶液50 μL，加入磷鉬酸顯色劑0.1 mL，搖勻后于70 ℃水浴揮干溶劑，然后沸水浴15 min，流水冷卻至室溫后加水定容至10 mL，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測定吸收光譜，見圖1。

沒食子酸-硫酸顯色法：精密吸取供試品溶液50 μL 置10 mL刻度試管中，于70℃水浴揮干溶劑后，依次加入沒食子酸0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測定吸收光譜，見圖1。

變色酸-硫酸顯色法［7］：精密吸取對照品溶液200 μL和供試品溶液50 μL分別置10 mL刻度試管中，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。400～800 nm掃描測定吸收光譜，見圖2。綜合比較上述5種顯色方法吸收光譜圖及專屬性，用變色酸-硫酸顯色后，balanophonin對照品、供試品吸收光譜圖基本一致，且均在566 nm處有最大吸收，專屬性良好。故選擇變色酸-硫酸反應顯色法，在566 nm波長處測定波棱瓜子總木脂素含量。

圖1 吸收光譜圖（“a”福林酚顯色法，“b”普魯士藍顯色法，“c”磷鉬酸顯色法，“d”沒食子酸-硫酸顯色法）

圖2 變色酸-硫酸顯色法吸收光譜圖（“e”對照品， “f”供試品）

2.3 顯色條件考察

2.3.1 濃硫酸用量考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70℃水浴揮干溶劑后，各加入10%變色酸水溶液0.5 mL，再分別加入濃硫酸3，4，5，6，7，8 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測定吸光度，結(jié)果表明濃硫酸用量為7 mL時，A最大（表1）。

2.3.2 變色酸用量考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70 ℃水浴揮干溶劑后，分別加入10%變色酸水溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，再依次加入濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測定吸光度，結(jié)果表明變色酸用量為1.5 mL時，A最大（表1）。

2.3.3 顯色時間考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液1.5 mL、濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，置沸水浴中分別加熱10，20，30，40，50，60 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測定吸光度，結(jié)果表示顯色時間為40 min時，A最大（表1）。

表1 顯色條件考察

2.4 線性關系考察

精密吸取對照品溶液100，150，200，250，300，350 μL于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液1.5 mL、濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱40 min后取出流水冷卻至室溫，于566 nm處測定吸光度。以balanophonin對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程Y=0.0464X-0.0202（n=6，r=0.999 1）。結(jié)果表明balanophonin在5.01～17.535 μg.mL-1的線性關系良好。

2.5 精密度考察

精密吸取對照品溶液200 μL，按照2.4項下操作，于566 nm處，連續(xù)測定6次吸光度，相對標準偏差RSD=1.15%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性考察

取波棱瓜子藥材粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，按2.1.1項下制備供試品溶液，分別精密吸取50 μL，按照2.4項下操作測定吸光度，RSD=2.52%，表明重現(xiàn)性較好。

2.7 穩(wěn)定性考察

精密吸取對照品溶液150 μL、供試品溶液50 μL，按照2.4項下操作顯色后放置0，0.5，1，2，4，12 h測定吸光度。結(jié)果表明balanophonin和供試品溶液顯色后12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD分別為0.91%，2.27%。

2.8 回收率試驗

取已知含量波棱瓜子藥材粉末6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別精密加入balanophonin對照品適量，按照2.1.1項下制備樣品溶液。精密吸取50 μL，按照2.4項下操作測定吸光度，并計算回收率為98.36%，RSD=2.33%，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗

2.9 樣品含量測定

分別取3批樣品，按照2.1.1項下制備供試品溶液，按照2.4項下操作測定吸光度，測定波棱瓜子中總木脂素的含量，結(jié)果見表3。

表3 波棱瓜子總木脂素含量測定

3　討論

據(jù)文獻報道，變色酸-硫酸反應顯色法可用于測定某藥材中總木脂素含量是因為該藥材中木脂素類化合物分子中均含有或大多數(shù)都含有亞甲二氧基基團［7，8］，該基團于強酸條件下水解生成甲醛，甲醛與變色酸（含酚羥基）反應產(chǎn)生紫紅色。查閱文獻，從波棱瓜子中分離得到的木脂素類化合物分子中基本不含亞甲二氧基，包括對照品balanophonin中也不含此基團，然而本文方法研究中波棱瓜子供試品溶液以及對照品balanophonin均能在變色酸-硫酸體系中顯色，且吸收光譜基本一致，并均在566 nm處有最大吸收，從對照品balanophonin結(jié)構(gòu)式推測其反應機理可能為：①分子中苯駢呋喃環(huán)遇強酸不穩(wěn)定，呋喃環(huán)中碳氧鍵斷裂，生成碳正離子，碳正離子進攻帶有酚羥基的芳環(huán)，生成共軛系統(tǒng)顯色。②分子中與苯環(huán)連接的不飽和醛基在反應中亦可生成碳正離子，再與一分子酚反應生成共軛系統(tǒng)顯色。

沒食子酸-硫酸反應顯色法原理類似于變色酸-硫酸反應顯色法，但對照品與供試品的吸收光譜圖中無明顯平坦的峰值作為測定總木脂素含量的波長。福林酚顯色法、磷鉬酸顯色法以及普魯士藍顯色法均是針對樣品中的酚類化合物而反應顯色，而中藥中含酚羥基的化學成分主要包括木脂素類、香豆素類、黃酮類、鞣質(zhì)類等成分，而這些成分在波棱瓜子藥材中均含有，此三種方法與變色酸-硫酸反應顯色法相比較，其用于測定波棱瓜子藥材中總木脂素含量存在較大干擾，故本研究中最終選擇變色酸-硫酸顯色法作為波棱瓜子總木脂素含量測定的方法。

波棱瓜子是藏藥中治療肝病的首選藥物之一，在用于治療肝病的藏藥成方制劑中，有一半以上入藥。研究表明，波棱瓜子治療肝病的主要活性成分為木脂素類化合物，然藏藥存在生產(chǎn)技術含量低、生產(chǎn)成本高、市場競爭力差等問題，本研究建立的波棱瓜子總木脂素含量測定方法可為波棱瓜子藥材總木脂素的提取純化工藝奠定基礎。

［參考文獻］

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（責任編輯：傅舒）

Research on determination method of total lignans from Bolengguazi

L
I Chun-qin， LIU Mei-lin， DONG Jia-yue，WANG Zi-yan， ZHANG Mei //（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education， State Key Laboratory Breeding Base of Systematic research， development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， China）

［Abstract］Objective: To establish a determination method for the extraction of total lignans from Bolengguazi. Method: Balanophonin was used as reference standard. The content of total lignans was determined by the chromotropic acid-H2SO4reaction colorimetry. Measurement wavelength was set at 566 nm. Result: Balanophonin calibration curve showed a good liner relationship in ranger of 5.01-17.535 μg.mL-1（n=6，r=0.999 1） and the average recovery was 98.36% with RSD of 2.33% （n=6）. Conclusion: The method established is reliable and accurate. It can be used to determine the content of total lignans in Bolengguazi.

［Key words］Bolengguazi； total lignans； balanophonin； content determination； spectrophotometry

［中圖分類號］R 284.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-014-03

［基金項目］四 川省科技支撐項目（2013SZ0114）

［作者簡介］李 春沁（1989-），女，碩士在讀，研究方向為中藥有效物質(zhì)基礎研究

［通訊作者］張 梅（1963-），女，教授，博士生導師，從事中藥及其復方物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制方法研究

［收稿日期］2016-02-21