免疫刺激誘導(dǎo)草魚腫瘤壞死因子TNF-α的體外表達特征研究

盧翠玉李 炎劉慶慧呂利群（.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，上海 0306； .中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 6607）

免疫刺激誘導(dǎo)草魚腫瘤壞死因子TNF-α的體外表達特征研究

盧翠玉1，2李 炎1劉慶慧2呂利群1
（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071）

摘要：為了闡明免疫刺激誘導(dǎo)草魚腫瘤壞死因子TNF-α的體外表達特征，克隆了草魚TNF-α的cDNA，構(gòu)建了原核表達載體pET-32-TNF-α，并在大腸桿菌DH5α中表達了His6-TNF-α。利用親和層析鎳柱純化表達重組蛋白后將其作為免疫原免疫小鼠制備了抗草魚TNF-α多克隆抗體。免疫印跡實驗顯示，制備的抗體能特異性識別細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α。在此基礎(chǔ)上，分別研究了GCRV（草魚呼腸孤病毒）感染、免疫刺激物Poly（I:C）及LPS處理下不同時間點草魚腎細(xì)胞CIK中TNF-α的表達情況，結(jié)果表明，TNF-α在草魚腎細(xì)胞內(nèi)翻譯水平的表達量基本保持穩(wěn)定。研究顯示經(jīng)典的TNF信號通路激活因子不能引起CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的顯著變化。

關(guān)鍵詞：草魚呼腸孤病毒； 腫瘤壞死因子TNF-α； 原核表達； 多克隆抗體

草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是草魚病毒性出血病的致病病原。由GCRV引起的草魚出血病在中國、朝鮮、越南等亞洲國家危害嚴(yán)重［1—3］。在分類學(xué)上，草魚呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae），水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus），完整的病毒粒子含11條分節(jié)段雙鏈RNA基因組和雙層蛋白質(zhì)衣殼。迄今，我國水產(chǎn)科學(xué)工作者已從發(fā)病草魚中分離出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型草魚呼腸孤病毒［1—4］。由于Ⅰ型呼腸孤病毒被確定并研究的時間較長，特別是其感染草魚腎細(xì)胞（CIK）能出現(xiàn)快速且顯著的細(xì)胞病變現(xiàn)象，Ⅰ型GCRV和CIK細(xì)胞成為了為體外研究魚類抗病毒先天免疫的良好細(xì)胞模型，Ⅰ型GCRV也逐漸成為了國際公認(rèn)的研究水生動物呼腸孤病毒的模式毒株［5］。有研究表明，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）介導(dǎo)的信號通路可能與草魚呼腸孤病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)［6］。

TNF由Carswell等發(fā)現(xiàn)于1975年，因其能抑制和殺傷某些腫瘤細(xì)胞，并使體內(nèi)腫瘤發(fā)生出血壞死而得名。TNF按其結(jié)構(gòu)分兩型:TNF-α和TNF-β，Shalaby等把由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子命名為TNF-α［7］。目前國際上對TNF-a的研究比較深入。TNF不僅對多種腫瘤具有細(xì)胞毒作用，并參與機體炎癥與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進細(xì)胞生長、分化、凋亡等重要作用，與休克、發(fā)熱、多器官功能衰竭及惡病質(zhì)等均有密切關(guān)系。在分子生物學(xué)研究進展突出，先后完成了基因定位、cDNA克隆、mRNA 表達以及分子水平的檢測，科學(xué)界對TNF作用的了解正不斷深入［7］。

目前，多種魚類的TNF-α基因已經(jīng)被克隆，如牙鲆［8］、鯉、斑馬魚、虹鱒和草魚等。草魚經(jīng)免疫刺激物L(fēng)PS體外刺激后的早期，特別是在12h之內(nèi)TNF-α轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào)［9，10］，但LPS對金頭鯛巨噬細(xì)胞的TNF-α基因的表達卻沒有刺激作用［11］。Ⅰ型GCRV感染和免疫刺激物poly（I:C）刺激CIK也能引起TNF-α轉(zhuǎn)錄水平瞬時上調(diào)?，F(xiàn)有的魚類TNF-α應(yīng)激表達研究均停留在轉(zhuǎn)錄水平上。由于TNF-α的表達不但在轉(zhuǎn)錄水平受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［12］，也存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制［13］，因此轉(zhuǎn)錄水平表達量變化的研究結(jié)果不足以說明TNF-α信號通路的應(yīng)激反應(yīng)。不同細(xì)胞中TNF-α信號通路的反應(yīng)性也不盡相同，目前也沒有足夠生物學(xué)證據(jù)表明CIK細(xì)胞適合用于研究草魚所有細(xì)胞水平的抗病毒先天免疫反應(yīng)。本研究通過制備TNF-α多克隆抗體，從翻譯水平檢測在病毒感染過程中或不同免疫刺激劑作用下草魚CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白表達量的變化，旨在厘清CIK細(xì)胞是否適合于研究TNF-α信號通路的應(yīng)激反應(yīng)，并為下一步探索在草魚免疫應(yīng)答中特定免疫細(xì)胞類型或器官介導(dǎo)的TNF-α免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

I型草魚呼腸孤病毒JX-01株（由本實驗室保存）；草魚腎細(xì)胞CIK（購自武漢大學(xué)國家組織培養(yǎng)物保藏中心），在添加10%牛胚胎血清的M199 Medium培養(yǎng)基（購自上海吉諾生物科技有限公司）中培養(yǎng)；ICR小白鼠（購自上海實驗動物研究中心），4周齡雌性小鼠； 聚肌胞甘酸，炎性刺激物脂多糖（LPS）（購自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。

1.2 GCRV感染草魚腎細(xì)胞

在75 cm2培養(yǎng)瓶中于28℃恒溫培養(yǎng)CIK細(xì)胞，48h后將培養(yǎng)至80%—90%且處于對數(shù)生長期的CIK細(xì)胞用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基稀釋使細(xì)胞濃度達到1×107/mL。按每孔0.5 mL細(xì)胞懸液將CIK細(xì)胞傳至含完全培養(yǎng)基（2 mL/孔）的6孔板。細(xì)胞貼壁完成后吸除培養(yǎng)液并用感染復(fù)數(shù)為1的GCRV感染細(xì)胞，1h后吸出病毒液，用無血清培養(yǎng)基清洗一次，然后添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

1.3 聚肌胞甘酸和細(xì)菌脂多糖分別刺激CIK細(xì)胞

Poly（I:C）用無菌PBS溶解，配制成1 mg/mL儲備液，0.22 μm濾膜過濾，取適量用PBS稀釋后（終濃度5 μg/mL）刺激CIK細(xì)胞，對照組用等量PBS處理，分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

LPS用無菌雙蒸水溶解，配制成600 μg/mL儲備液，取適量稀釋后（終濃度30 μg/mL）刺激CIK細(xì)胞，分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

1.4 pET32a（+）-TNF-α重組質(zhì)粒構(gòu)建

Trizol法提取草魚草魚腎細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中同源比對出保守序列設(shè)計一對引物，分別為sTNF-P32-F1 5′-CGCGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAA AAGC-3′（下劃線序列為BamH Ⅰ酶切位點），sTNFP32-R1 5′-CCGCTCGAGGCAGAGCAAACAC CCCAAAAAAG-3′（下劃線序列為XhoⅠ酶切位點），用上述引物通過溫度梯度PCR擴增TNF-α片段。凝膠電泳獲得目的條帶后用膠回收試劑盒回收目的片段，分別用BamH Ⅰ、XhoⅠ酶切后用T4 DNA連接酶連接TNF-α目的片段和pET-32a（+），將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，提取的重組質(zhì)粒通過雙酶切驗證和測序（由上海生工生物工程股份有限公司完成）鑒定都正確后，命名為pET-32a（+）-TNF-α（圖 1）?；罨木阂?∶100接種于200 mL含氨芐青霉素培養(yǎng)液中，37℃，180 r/min搖床5h，進行擴大培養(yǎng)。

1.5 pET32a（+）-TNF-α蛋白誘導(dǎo)表達

pET32a（+）-TNF-α蛋白誘導(dǎo)表達。向菌液中加入0.1 mmol/L（終濃度）IPTG，37℃，90 r/min搖床誘導(dǎo)6h。

1.6 pET32a（+）-TNF-α蛋白純化

收集誘導(dǎo)表達后的菌體，菌液離心后棄上清，每克菌體約加10 mL Wash Buffer進行懸浮。加入0.2 mg/mL溶菌酶處理，同時加入1 mmol/L（終濃度）PMSF、蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，防止蛋白降解，冰浴30min后超聲破碎100次，之后12000 r/min，4℃離心20min，棄上清，沉淀用2 mol/L尿素（用PBS溶解）溶解，8500 r/min，4℃，離心15min，棄上清，繼續(xù)用4和6 mol/L尿素各洗一次，沉淀用8 mol/L的尿素溶解，8500 r/min離心25min后取上清用0.45 μm濾膜過濾，加入10 mmol/L（終濃度）DTT和1% Triton，按1∶50比例在上清中加入Resin（使用前用Wash Buffer平衡），采用親和層析柱鎳低溫結(jié)合6—12h。Wash Buffer清洗過后用Eluting Buffer洗脫。洗脫樣品分別取適量樣品，加入蛋白裂解液，SDS-PAGE檢測。

蛋白濃度檢測。用改良型Brandford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定純化后的蛋白濃度。

1.7 TNF-α多克隆抗體制備

將純化好的pET32-TNF-α蛋白調(diào)至1 mg/mL，并且分裝至1.5 mL EP管于-80℃保存。然后將其免疫4周齡雌性ICR小鼠，抗原注射量約200 μg/只/次，共免疫4只小鼠。第1次免疫為腹腔注射，將抗原蛋白與等體積FCA（弗氏完全佐劑）（Sigma公司）用1 mL無菌注射器反復(fù)吹打，充分混和均勻，直至滴入水中呈乳白色液滴且不會擴散時方可進行免疫； 14d后進行第2次腹腔注射，將抗原蛋白與等體積弗氏不完全佐劑用1 mL無菌注射器反復(fù)吹打混勻，注射； 一周之后進行第3次免疫，將純抗原pET32a（+）-TNF-α蛋白采用小鼠背部皮下多點注射的方法進行免疫，3d后斷尾取血，做Western Blot檢測； 4d后第4次加強免疫后3d，采用摘眼球取血的方式取血，將采集到的血液傾斜放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中1h，4℃過夜，3000 r/min離心20min，取上清分裝多個EP管-80℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.8 體外檢測草魚TNF-α蛋白表達特征

利用已制備抗pET32a（+）-TNF-α抗體作為一抗，Western Blot檢測病原或免疫刺激劑刺激條件下草魚腎細(xì)胞TNF-α蛋白表達量變化。同時采用抗GAPDH多抗作為一抗檢測GAPDH表達量作為對照。

提前將轉(zhuǎn)膜所用兩層海綿與六層濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min，并準(zhǔn)備好割膠板，剪刀，鑷子和玻璃棒。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將凝膠切下來，并浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，同時用無水甲醇中活化PVDF膜（0.45 μm）15s，再浸泡在ddH2O中2min，之后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡1min左右，在半干轉(zhuǎn)膜設(shè)備上制作轉(zhuǎn)膜三明治，從負(fù)極到正極依次是海綿，三層濾紙，膠，PVDF膜，三層濾紙，海綿。100 V，45min轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂牛奶的PBST封閉3h，用相應(yīng)一抗4℃過夜孵育，PBST清洗8次，每次5min，用1∶5000相應(yīng)二抗37℃孵育2h后用DAB顯色試劑顯色，膜晾干后在凝膠成像儀下拍照保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建草魚TNF-α基因編碼區(qū)序列的原核表達質(zhì)粒及His6- TNF-α的原核表達

pET32a（+）質(zhì)粒是一種常用的大腸桿菌表達載體，被用于表達攜帶6個His接頭的重組蛋白。利用RT-PCR擴增技術(shù)從草魚總RNA序列中擴增得到草魚TNF-α基因的全長cDNA（圖 1），瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果顯示該片段與預(yù)計片段大小接近。利用膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物后進行雙酶切，并選接到經(jīng)相同雙酶切的載體上。連接后的DNA轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α，獲得的菌落經(jīng)菌落PCR初篩后，陽性單克隆菌落送生工生物工程公司進行測序。測序結(jié)來顯示該片段為草魚TNF-α，通過NCBI BLAST比對分析，該核苷酸序列與已報道的草魚TNF-α序列一致，說明原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組表達質(zhì)粒pET32a（+）-TNF-α轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以表達出目的蛋白。本研究對His6-TNF-α在細(xì)菌中的表達條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，使用0.1 mmol/L濃度IPTG在37℃誘導(dǎo)6h即可實現(xiàn)目的蛋白高表達（圖 1）。

2.2 His6-TNF-α的純化及其His6-TNF-α多克隆抗體制備

將His6-TNF-α重組蛋白表達后，超聲波破碎分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白主要以包涵體的形式存在，所以將其用尿素，His-link purification resin及結(jié)合液Buffer C、漂洗液Buffer D、洗脫Buffer E溶液純化蛋白，Buffer E溶液可以添加不同濃度的咪唑。為了驗證上述純化的His6-TNF-α重組蛋白是否含有組氨酸標(biāo)簽，利用商品化的抗組氨酸單抗檢測，結(jié)果顯示，所純化的蛋白即為His6-TNF-α（圖 2A）。利用所純化的His6-TNF-α蛋白做免疫原，免疫小鼠制備多克隆抗體。利用純化的His6-TNF-α和草魚腎細(xì)胞樣品，檢測該多克隆抗體的特異性。免疫學(xué)檢測方法顯示，所制備的多克隆抗體既能識別原核表達的His6-TNF-α，也能識別細(xì)胞內(nèi)源性的TNF-α（圖2B）。

圖 1 IPTG濃度的優(yōu)化

2.3 GCRV感染過程中CIK細(xì)胞TNF-α蛋白表達量的Western Blot檢測

為了闡明GCRV感染過程中細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達特征表達，利用制備的抗體對細(xì)胞總蛋白進行免疫學(xué)檢測。利用所制備的抗TNF-α抗體檢測GCRV感染后不同時間點細(xì)胞TNF-α的表達水平。Western blot結(jié)果顯示，病毒感染過程中TNF-α表達水平維持穩(wěn)定（圖 3）。

2.4 Poly（I:C）刺激CIK細(xì)胞后TNF-α的應(yīng)激表達

Poly（I:C）是雙鏈RNA結(jié)構(gòu)類似物，是常用的免疫刺激劑，常用于誘導(dǎo)抗病毒先天免疫基因。為了闡明Poly（I:C）刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達變化，本文利用制備的抗TNF-α多克隆抗體對poly（I:C）刺激后不同時間點的CIK細(xì)胞進行免疫學(xué)檢測。Western blot 結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞內(nèi)的TNF-α表達量基本保持穩(wěn)定（圖 4）。

圖 2 純化His6- TNF-α及His6-TNF-α多克隆抗體在CIK細(xì)胞內(nèi)的免疫學(xué)檢測

圖 3 草魚呼腸孤病毒GCRV感染過程中細(xì)胞TNF-α表達的免疫學(xué)檢測

2.5 LPS刺激CIK細(xì)胞后TNF-α的應(yīng)激表達

LPS是細(xì)菌外膜成分，是常用的免疫刺激劑，常用于誘導(dǎo)抗細(xì)菌先天免疫基因。為了闡明LPS刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達變化，本文利用制備的抗TNF-α多克隆抗體對LPS刺激后不同時間點的CIK細(xì)胞進行免疫學(xué)檢測。Western blot 結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞內(nèi)的TNF-α表達量基本保持穩(wěn)定（圖 5）。

3 討論

哺乳動物TNF-α作為一個在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮多種功能的炎性細(xì)胞因子，通常在免疫刺激下由巨噬/單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種細(xì)胞表達［14］。關(guān)于多種魚類TNF-α的初步研究表明其可能具有與哺乳動物同源蛋白相似的功能［15—17］。然而，限于魚類免疫細(xì)胞研究的滯后，很多相關(guān)研究只局限于魚體免疫組織［18］； 在細(xì)胞水平闡明草魚TNF-α的應(yīng)激表達水平的研究迄今為止只局限于草魚CIK細(xì)胞［10］或原代頭腎總白細(xì)胞［9］。而且，在草魚TNF的研究中尚無蛋白質(zhì)表達水平的研究結(jié)果。為了闡明轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)是否意味著TNF-α在翻譯水平的表達也會發(fā)生上調(diào)，本文制備了高特異性的抗草魚TNF-α抗體。選取PET32載體在細(xì)菌中表達TNF-α作為免疫原制備抗體是因為該載體表達真核蛋白成功的概率比較高。本文發(fā)現(xiàn)該載體表達的TNF-α在細(xì)菌中主要以包涵體存在。雖然在變形條件下可以利用鎳柱純化包涵體蛋白，并成功用于免疫小鼠制備抗體，本文的實驗結(jié)果只是表明原核表達的TNF-α具有免疫原性。由于變性后的TNF-α?xí)适锘钚裕疚牟]有進一步利用純化的重組TNF-α蛋白作為細(xì)胞因子研究其對細(xì)胞表面TNF-α受體蛋白的激活效應(yīng)。

圖 4 Poly（I:C）刺激后細(xì)胞TNF-α表達的免疫學(xué)檢測

圖 5 LPS刺激后細(xì)胞TNF-α表達的免疫學(xué)檢測

本文研究了GCRV病毒感染、Poly（I:C）處理及LPS處理等3種免疫刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α表達的變化情況。結(jié)果顯示，草魚腎細(xì)胞CIK細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α的表達量在刺激前后基本保持穩(wěn)定。本文的研究結(jié)果表明CIK細(xì)胞可能不適合于研究草魚TNF-α信號通路，未來應(yīng)該選取魚體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α免疫應(yīng)答的特定組織和細(xì)胞來開展研究。

盡管GCRV感染或Poly（I:C）刺激均能在CIK細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)TNF-α基因在轉(zhuǎn)錄水平瞬時顯著上升［10］；本研究表明轉(zhuǎn)錄水平的瞬時上升并沒有表現(xiàn)為翻譯水平的表達量上調(diào)。其原因可能與TNF-α的分泌表達性相關(guān)，另外也不排除草魚TNF-α基因存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α的轉(zhuǎn)錄受多種因子調(diào)控，包括:LITAFSTAT6、NF-kB、Ets、NF-AT、AP-1和C/EBPβ等［19］； 在轉(zhuǎn)錄后水平，TNF-α的調(diào)控因子包括Mk2/ MK3［20］、Tpl2/ERK［21］等。因此，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控可能保證了TNF-α蛋白水平的穩(wěn)定。未來，我們計劃利用本文制備的特異性抗體建立ELISA檢測方法鑒定分泌表達的草魚TNF-α，利用免疫組化技術(shù)在魚體水平鑒定應(yīng)激表達TNF-α的免疫組織和細(xì)胞類型。

本文發(fā)現(xiàn)已有的草魚腎細(xì)胞系CIK中TNF-α表達水平在病毒等免疫刺激條件下仍然保持穩(wěn)定，顯示TNF-α介導(dǎo)的抗病毒信號通路有可能沒有激活，這可能與該細(xì)胞對病毒的敏感性相關(guān)［5］。鑒定合適的TNF-α誘導(dǎo)反應(yīng)性好的免疫類型細(xì)胞將有助于闡明TNF-α在蛋白水平的表達特征將有助于理解TNF-α信號通路與病原感染的相互關(guān)系，厘清TNF-α信號通路在抗病方面的作用機制。

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IN VITRO EXPRESSION PATTERN OF GRASS CARP TUMOR NECROSIS FACTOR（TNF-α）IN RESPONSE TO IMMUNE STIMULATION

LU Cui-Yu1，2，LI Yan1，LIU Qing-Hui2and Lü Li-Qun1
（1.Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China； 2.Yellow Sea Aquatic Research Institute of China Aquatic Institute，Qingdao 266071，China）

Abstract:Tumor necrosis factor alpha（TNF-α）is a multi-functional cytokine that plays important role in immune response，the homeostasis of the immune system，apoptosis，cell proliferation，and differentiation.Whether pathogen and immune stimulation can enhance the protein level of TNF-α is unclear.In this study，the cDNA of grass carp TNF-α was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32 for expression of His6-tagged TNF-α.After purification through Ni2+-affinity chromotopraphy column，purified His6- TNF-α was subjected to immunize mouse to get polyclonal antibody，anti- TNF-α.Western blot analysis showed that the anti- TNF-α could specifically recognize endogenic grass carp TNF-α as well as His6- TNF-α.Furthermore，our results indicated that the CIK TNF-α level remain constant when challenged with GCRV or treated with immune stimulators in vitro.Since CIK cells seemed to be not a good cell line in investigating the response of TNF alpha signal pathway to stress，an in vivo experiment might be required to monitor the protein expression of TNF-α in specific immune organs or cells.

Key words:Grass carp reovirus； Tumor necrosis factor（TNF alpha）； Prokaryotic expression； Polyclonal antibody

中圖分類號：S941.4

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0481-07

doi:10.7541/2016.64

收稿日期：2015-06-11；

修訂日期：2015-12-04

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-46-12）； 國家自然科學(xué)基金（31372561）資助［Supported by the Earmarked Fund for China Agriculture Research System（No.CARS-46-12）； the National Natural Science Foundation of China（No.31372561）］

作者簡介：盧翠玉（1991—），女，山西運城人； 碩士； 主要從事水產(chǎn)動物病原學(xué)研究。E-mail:JADE20100000@163.com

通信作者：呂利群，男，教授； 博士； 主要從事水產(chǎn)動物病原學(xué)研究。E-mail:lqlv@shou.edu.cn