決明不同組織莽草酸激酶基因的表達(dá)模式與蒽醌含量分析

李洋洋, 李卓彬, 俞繼華, 李娟娟, 王萬軍, 周嘉裕, 廖 海

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 成都 610031)

決明不同組織莽草酸激酶基因的表達(dá)模式與蒽醌含量分析

李洋洋, 李卓彬, 俞繼華, 李娟娟, 王萬軍, 周嘉裕, 廖 海

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 成都 610031)

摘要分析莽草酸激酶基因在決明(Cassia obtusifolia L.)不同組織中的表達(dá)模式，同時(shí)測定不同組織中總蒽醌的含量，為研究莽草酸激酶在決明蒽醌生物合成中的作用提供理論依據(jù)。提取決明種子、愈傷組織與成熟葉等10個(gè)不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用熒光定量PCR檢測莽草酸激酶基因在不同組織的表達(dá)情況。同時(shí)，采用超聲波強(qiáng)化法提取決明不同組織的總蒽醌，通過分光光度法測定其含量。莽草酸激酶基因在決明的根、愈傷組織與子葉中的表達(dá)量較高，在種子、果莢與莖中表達(dá)量較低。決明的種子、果莢、花及根中蒽醌類化合物含量較高，而成熟葉和胚軸則不含。決明中蒽醌的生物合成涉及多個(gè)組織，其生物合成的早期階段(包括莽草酸激酶催化的反應(yīng))主要發(fā)生在根與子葉等組織，形成的中間產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)椒N子等組織中，完成生物合成的后期階段并積累蒽醌終產(chǎn)物，為合理利用決明不同藥用部位提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞決明;莽草酸激酶;組織差異表達(dá);總蒽醌;含量測定

決明(CassiaobtusifoliaL.)屬豆科云實(shí)亞科決明屬植物，其主要活性成分為蒽醌類化合物，有降血脂、降血壓、保肝、明目、通便和抑菌等功效，是國家衛(wèi)生部公布的69種藥食同源的物質(zhì)之一，其主要有效成分為蒽醌類化合物[1， 2]。高等植物中蒽醌類物質(zhì)主要通過莽草酸途徑和MEP途徑，經(jīng)由莽草酸、異分支酸、α-酮戊二酸與異戊烯二磷酸，再經(jīng)一系列代謝形成[3]。莽草酸激酶(Shikimate kinase, SK)是莽草酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，能夠催化莽草酸的3位-OH發(fā)生磷酸化，生成莽草酸-3-磷酸[4]。SK與植物的生長發(fā)育、抗逆性及次生代謝等過程存在密切聯(lián)系，其不僅參與蒽醌類物質(zhì)的合成，也參與芳香族氨基酸、類黃酮與生物堿等物質(zhì)的合成[5，6]。然而，有關(guān)SK在植物不同組織中的表達(dá)模式及其蒽醌生物合成途徑中的作用還未見報(bào)道。本課題組在決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到一個(gè)SK的unigene 片段(NO.BMK_unigene_25947)，命名為CoSK(Cassiaobtusifoliashikimate kinase), 通過RACE方法從決明種子中克隆了決明莽草酸激酶基因的全長cDNA序列(GenBank Accession：KM190078)。本文進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測決明種子、愈傷組織與成熟葉等不同組織中莽草酸激酶基因的表達(dá)水平，并測定不同組織中的總蒽醌含量，進(jìn)而分析CoSK的組織差異性表達(dá)與總蒽醌含量的相關(guān)性，這對(duì)于研究決明中蒽醌類化合物的生物合成及認(rèn)識(shí)CoSK在蒽醌合成中的作用具有指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1材料

Plant RNA Kit(Omega, America)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, Japan)，LightCycler?96 system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)，UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)TGL-16K(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司)，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀(Synergy H1/H1)，elx-800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

決明(CassiaobtusifoliaL.)的成熟種子購自成都市中藥公司，經(jīng)鑒定為決明(CassiaobtusifoliaL.)的種子；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ?yàn)門aKaRa(日本)公司產(chǎn)品；1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，批號(hào)CDCT-C11961000；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：0.5 mg/mL IAA+1.5 mg/mL NAA+0.2 mg/mL 2-4-D+1.0 mg/mL 6-BA+0.2 mg/mL KT+MS培養(yǎng)基；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1.0 mg/mL NAA+1.0 mg/mL 2-4-D+0.1 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL KT+MS培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1材料的獲取

決明種子播種于沙石、蛭石、泥碳(質(zhì)量比為1.5∶1∶1)混合的培養(yǎng)基質(zhì)中自然生長，分別收集成熟種子(開花后60 d)及開花后30 d的未成熟種子、花、莖、根、成熟葉及果莢等不同部位。

決明種子用無菌水浸泡24 h，解除休眠，然后用0.1 % 的氯化汞浸泡8 min，最后用事先滅過菌的ddH20潤洗4～5次[7]，于無菌操作臺(tái)將種子接于MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)8 h，黑暗培養(yǎng)16 h，20 d后萌發(fā)獲取子葉，胚軸，并將部分子葉切成0.5cm×0.5cm的小塊植于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得愈傷組織，部分愈傷組織轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，獲得不定芽。

1.2.2CoSK表達(dá)模式分析

使用Plant RNA Kit (Omega, America)提取決明不同組織的總RNA，做3次生物學(xué)重復(fù)。采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，再用酶標(biāo)儀測定各組織的RNA濃度并做調(diào)整，使每個(gè)組織反轉(zhuǎn)錄體系中RNA總量相同，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈作為模板。以決明18S RNA為內(nèi)參，再次調(diào)整cDNA的用量及循環(huán)次數(shù)，使內(nèi)參基因與目的基因表達(dá)效率一致。根據(jù)CoSK的全長，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(SKqFP和SKqRP，表1), 同時(shí)設(shè)計(jì)18S rRNA的引物 (18SqFP 和18SqRP，表1)，使用LightCycler?96 system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) Real-Time PCR 儀進(jìn)行分析，為了減小加樣過程產(chǎn)生的誤差，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為15 μL：7.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTMII、1 μL cDNA、引物(10 μM)各0.6 μL，ddH2O補(bǔ)足到15 μL。反應(yīng)條件依次為95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。采用 LightCycler?96 軟件內(nèi)置的2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 定量PCR引物

1.2.3決明各組織總蒽醌含量的測定

1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取5.0 mg 1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品，置于50 mL容量瓶中，加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，配制0.1 mg/mL的1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品貯備液，再用0.5%醋酸鎂-甲醇稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液。以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白對(duì)照，于510 nm處測定光吸收值(表2)。以光吸收值Y為縱坐標(biāo)，1，8-二羥基蒽醌量X(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸[8]。

2)決明總蒽醌提取液的制備及含量的測定。分別稱取決明成熟種子、子葉、成熟葉、不定芽、莖、花、果莢、愈傷組織、胚軸及根的干燥粉末4 g，浸泡于80%的乙醇(料液比為0.005 g/mL)中，50℃水浴加熱3 h；然后超聲波提取80 min(300 W)，待冷卻后，2 000 r/min，離心20 min，取上清液，即得決明不同部位的總蒽醌提取液。分別精密吸取1.0 mL總蒽醌提取液于60 mL錐形瓶中，沸水浴蒸干，待冷卻后加入3 mL蒸餾水溶解殘?jiān)?0%三氯化鐵加熱30 min(沸水浴)，再加冰醋酸25%鹽酸2 mL加熱水解30 min(沸水浴)，水解過程不斷搖振，流水冷卻至室溫，倒入60 mL分液漏斗中，用5～10 mL氯仿萃取3次，合并萃取液，加少量蒸餾水洗滌，收集氯仿液，水浴蒸干，用5 mL 0.5%醋酸鎂-甲醇液溶解殘?jiān)?10 nm處測定光吸收值，計(jì)算不同部位總蒽醌提取液中總蒽醌的含量[8]。

3)精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率的測定。精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取相同量0.1 mg/mL的1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品溶液，測定510 nm處的光吸收值，重復(fù)5次，測定1，8-二羥基蒽醌的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，relative standard deviation)的值。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取0.1 mg/L的1, 8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)液，分別于0、2、4、8、12、24和48 h時(shí)測定510 nm處的光吸收值，測定總蒽醌的RSD值。

加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的決明成熟種子粉末200 mg，加入2 mL 0.5 mg/mL的1，8-二羥基蒽醌溶液，按決明不同器官總蒽醌提取液的制備方法制備，并按上述光譜條件測定，計(jì)算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1CoSK表達(dá)模式分析

為了更深入地研究莽草酸激酶催化莽草酸磷酸化對(duì)總蒽醌含量的影響，我們通過CoSK的組織表達(dá)模式分析，來確定莽草酸在各個(gè)不同的組織中的表達(dá)量。以決明根、莖、成熟葉、花、果莢、不定芽、種子、胚軸、子葉以及愈傷組織為材料提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行定量PCR 檢測(圖1)。不同組織中的CoSK相對(duì)表達(dá)水平由高到低依次為：根>愈傷組織>子葉 >成熟葉>不定芽>胚軸>花>種子>果莢>莖。表明CoSK在根、愈傷組織與子葉中優(yōu)勢表達(dá)，而在莖、種子與果莢中表達(dá)量較低。

圖1　熒光定量PCR分析決明CoSK的組織表達(dá)模式

Root：根；pod:果莢；Flower：花；Bud:不定芽；Stem:莖；Hypocotyl:胚軸；Leaf:成熟葉；Callus:愈傷組織；Nonage seed:未成熟種子；Cotyledon:子葉

2.2決明不同組織總蒽醌含量測定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品及空白對(duì)照在510 nm處的光吸收值Y(表2)為縱坐標(biāo)，1，8-二羥基蒽醌量X(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.061X-0.001，r=0.9995，線性范圍為：2～25 μg/mL。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2決明總蒽醌含量的測定

根據(jù)決明不同部位的總蒽醌抽提液在510 nm處的光吸收值計(jì)算總蒽醌的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示：種子中總蒽醌含量最高，為0.441%，其余總蒽醌含量依次為果莢>花、根>愈傷組織>不定芽>莖>子葉，而成熟葉和胚軸中未檢測到蒽醌類化合物。

表3 總蒽醌含量測定結(jié)果

2.2.3精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率的測定

對(duì)1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品溶液在510 nm處的光吸收值(表4)重復(fù)測定5次，計(jì)算得1，8-二羥基蒽醌的RSD=0.16%，表明該方法的精密度良好。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)照品溶液分別于0、2、4、8、12、24、48 h測其在510 nm處的光吸收值(表5)，計(jì)算得總蒽醌的RSD=0.17%，表明該溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.3中的方法測定，計(jì)算得總蒽醌的平均回收率為103.50%，RSD=0.36%，表明采用該方法測定蒽醌總含量較合理，回收率較高。

3討論與結(jié)論

高等植物中蒽醌類物質(zhì)的合成涉及反應(yīng)步驟較多，其中莽草酸激酶催化莽草酸途徑的第5步反應(yīng)，位于蒽醌合成途徑的早期階段。本文首先通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測CoSK在決明不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明CoSK在決明愈傷組織、根與子葉中的表達(dá)水平較高，而在決明莖、種子與果莢中的表達(dá)水平較低。同時(shí)，還測定了決明不同組織中的總蒽醌含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子中的總蒽醌含量最高，成熟葉和胚軸中幾乎不含蒽醌類化合物。結(jié)果顯示，CoSK的表達(dá)水平與總蒽醌的含量并沒有一定的相關(guān)性。這表明蒽醌在決明中的生物合成可能涉及多個(gè)組織，推測其合成途徑的早期階段主要發(fā)生在根與子葉等組織，合成的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到種子等組織中，并在種子等組織中合成蒽醌終產(chǎn)物。通過對(duì)決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，決明中含有大量轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括ATP-binding cassette轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，multidrug and toxin extrusion轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠直接參與轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物[3, 9，10]。由于愈傷組織是一團(tuán)獨(dú)立的細(xì)胞，不涉及代謝物在不同組織間的轉(zhuǎn)運(yùn)，CoSK在決明愈傷組織中的表達(dá)水平較高，導(dǎo)致愈傷組織中含有較高含量的蒽醌類化合物。

決明成熟種子中的總蒽醌含量最高，表明該部位的藥用價(jià)值最高，因此選擇決明種子作為入藥部位是科學(xué)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)決明成熟種子中的蒽醌含量超過未成熟種子中蒽醌的含量，推測是由于蒽醌從非入藥部位(花、莖和根等器官)轉(zhuǎn)運(yùn)到入藥部位(種子)，并在種子中不斷積累，當(dāng)種子完全成熟時(shí)，蒽醌含量也達(dá)到最高。此推測也符合Han等[11]提出的理論，他們認(rèn)為大多數(shù)藥用植物在生長發(fā)育過程中，其有效成分會(huì)通過植物維管系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)饺胨幉课?，隨著入藥部位的成熟，有效成分在入藥部位逐漸貯藏和積累。緱慧君等[12]也發(fā)現(xiàn)，何首烏莖的韌皮部中含有蒽醌類物質(zhì)，有可能是蒽醌類物質(zhì)的運(yùn)輸通道，當(dāng)然其機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。目前，本課題組已正在進(jìn)行CoSK基因的功能研究。

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Tissue-specific expression pattern and total anthraquione contents analysis of shikimate kinase from Cassia obtusifolia

LI Yang-yang, LI Zhuo-bin, YU Ji-hua, LI Juan-juan, WANG Wan-jun, ZHOU Jia-yu, LIAO Hai

(College of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

AbstractTissue-specific expression pattern of shikimate kinase from Cassia obtusifolia L. was analyzed and then the total anthraquione content in different organs was determined, which aimed at providing a theoretical basis for the study of the role of shikimate kinase from Cassia obtusifolia in anthraquinone biosynthesis. The total RNA of nonage seed, callus and mature leaves and so on of C. obtusifolia were extracted and subjected for cDNA synthesis. The expression quantitative analysis of CoSK in different tissues was estimated by real-time PCR. At the same time the anthraquione was extracted by ultrasonic extracting method, and the total anthraquione contents were determined by UV. Shikimate kinase showed a significantly high expression level in the root, callus and cotyledon of C. obtusifolia and a relatively low expression level in stem, pod and nonage seed. Anthraquione illustrated high content in seeds, pod, flowers and roots of C. obtusifolia, whereas mature leaves and hypocotyls did not find anthraquinone. The biosynthesis of C. obtusifolia in anthraquinone involved multiple organizations and in early stages (including shikimate kinase-catalyzed reaction) occured mainly in roots and mature leaves and other tissues. The intermediate products were transported to seeds and other tissues and completed the later stages of the biosynthesis and accumulation of anthraquinone final product, which was supposed to provide a guideline for the rational utilization of different medicinal parts of C. obtusifolia.

Key wordsCassia obtusifolia L.; shikimate kinase; tissue-specific expression; total anthraquione; content determination

收稿日期：2015-09-15；修回日期：2015-09-21

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NAC特異基因調(diào)控鐵皮石斛原球莖原分生組織形成的分子機(jī)理研究；No. 31271302)；西南交通大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(2014065)

作者簡介：李洋洋，碩士，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù), E-mail：liyangyang9110@163.com； 通信作者：廖 海，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)，E-mail：hliao2012@163.com。

中圖分類號(hào)Q344+.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0030-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.030