鹿科6屬M(fèi)HC-DRA第二外顯子變異特點(diǎn)及與Cytb系統(tǒng)進(jìn)化比較

由玉巖， 張成林， 張金國(guó)， 阮向東， 張林源， 鐘震宇， 鄭常明， 劉學(xué)鋒， 王偉， 曹長(zhǎng)雷

(1. 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京動(dòng)物園， 北京 100044； 2. 國(guó)家林業(yè)局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100714； 3. 北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100076； 4. 長(zhǎng)江師范學(xué)院， 重慶 408100)

鹿科6屬M(fèi)HC-DRA第二外顯子變異特點(diǎn)及與Cytb系統(tǒng)進(jìn)化比較

由玉巖1， 張成林1， 張金國(guó)1， 阮向東2， 張林源3， 鐘震宇3， 鄭常明1， 劉學(xué)鋒1， 王偉1， 曹長(zhǎng)雷4

(1. 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京動(dòng)物園， 北京 100044； 2. 國(guó)家林業(yè)局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100714； 3. 北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100076； 4. 長(zhǎng)江師范學(xué)院， 重慶 408100)

摘 要探討了鹿科6屬動(dòng)物主要組織相容性復(fù)合體dra(mhc-dra)第二外顯子的變異特點(diǎn)，揭示其分子水平上的進(jìn)化選擇模式，并與cyt b進(jìn)行了比較。采用測(cè)序法，獲得鹿科6屬動(dòng)物dra第二外顯子246 bp的序列。研究結(jié)果表明，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)18個(gè)，獨(dú)立變異位點(diǎn)13個(gè)。mhc-dra第二外顯子顯示出較低的核苷酸變異，且6屬有各自獨(dú)特的變異位點(diǎn)。氨基酸序列中抗原結(jié)合位點(diǎn)共計(jì)20個(gè)。其中，鹿科6屬動(dòng)物的氨基酸位點(diǎn)63，駝鹿屬氨基酸位點(diǎn)18，是不同于馬屬和人屬的抗原結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)鹿科動(dòng)物可能有著不同的抗原結(jié)合模式。根據(jù)非同義替代率(Ka)和同義替代率(Ks)比值的計(jì)算結(jié)果，表明鹿屬mhc-dra第二外顯子為正向選擇，其余5屬均為純化選擇。對(duì)mhc-dra第二外顯子及cyt b分別運(yùn)用鄰接法(NJ)，最大似然法(ML)和貝葉斯推論(BI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建得到相似結(jié)果，形成了舊世界鹿類與新世界鹿類的姐妹類群。麂亞科cyt b和mhc-dra第二外顯子的基因型可能是鹿亞科與其它亞科之間的過(guò)渡型，而氣候變化和環(huán)境變遷可能是推動(dòng)mhc-dra第二外顯子分化的潛在原因。

關(guān)鍵詞mhc-dra；分子進(jìn)化；系統(tǒng)進(jìn)化；選擇壓力

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，mhc)位于動(dòng)物染色體的特定區(qū)域，是編碼主要組織相容性抗原的一組緊密連鎖的基因群。在脊椎動(dòng)物中，mhc是最具多態(tài)性的基因區(qū)域，其核苷酸多樣性水平是基因組平均水平的2倍，是探討遺傳多樣性變化模式較為理想的基因[1,2]。同時(shí)，mhc在動(dòng)物免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著非常重要的作用[3,4]。當(dāng)動(dòng)物暴露于病原體或寄生蟲(chóng)等的環(huán)境中時(shí)，可驅(qū)動(dòng)并保持其天然種群mhc等位基因的多樣性，并隨時(shí)間的累積，等位基因多樣性逐步升高，以此來(lái)增加免疫基因應(yīng)對(duì)外環(huán)境中多樣病原體的能力[5]。而mhc等位基因的跨物種多樣性已經(jīng)在很多中性選擇系統(tǒng)中被證實(shí)，其中包括魚(yú)類[6]、嚙齒動(dòng)物[7]、有蹄動(dòng)物[8]、食肉動(dòng)物[9]和靈長(zhǎng)類動(dòng)物[10]等。mhc家族里大部分基因都呈高度多態(tài)，而mhc-dra相對(duì)來(lái)說(shuō)則很保守[11]。dra屬于mhc-Ⅱ，編碼Ⅱ類抗原分子的a鏈，在抗原識(shí)別和呈遞、免疫應(yīng)答與調(diào)控等方面起著重要的作用，是疾病抗性與易感性的候選標(biāo)記基因[12]。目前已證實(shí)mhc-dra分子的變異與家畜的一些疾病存在著相關(guān)性[13]。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)為核外遺傳物質(zhì)，是共價(jià)閉合的雙鏈，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，呈母性遺傳，進(jìn)化速度快且不發(fā)生重組，是一種應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記[14]。其中，細(xì)胞色素b(Cytochromeb，cytb)是構(gòu)成線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合體III的蛋白質(zhì)之一，也是其中唯一由線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)?；蛟诰€粒體基因組中進(jìn)化速度適中，能包含從種、屬水平的系統(tǒng)發(fā)育信息[15]。而且在一定的進(jìn)化尺度內(nèi)，基因不受飽和效應(yīng)的影響[16]，目前已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物種內(nèi)或近緣種間系統(tǒng)發(fā)育[17-20]、遺傳多樣性[21]、系統(tǒng)進(jìn)化和分類等方面的研究[22, 23]。

鹿科動(dòng)物多為野生種群，它們分布于世界各地，在維持自然界生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性中占有重要地位[24]。早在21世紀(jì)90年代初，已應(yīng)用不同遺傳標(biāo)記對(duì)鹿科動(dòng)物開(kāi)展了研究，闡明物種間的現(xiàn)行關(guān)系和歷史淵源，如通過(guò)12S rRNA、16S rRNA和D-Loop區(qū)來(lái)探討鹿亞科、麂亞科、獐亞科以及空齒鹿亞科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等方面的研究[25-27]，但針對(duì)鹿科動(dòng)物mhc的進(jìn)化機(jī)制還有待深入研究。鹿科(Cervidae)mhc與人類mhc相類似，均由多個(gè)高度多態(tài)性的基因座組成I類、Ⅱ類和Ⅲ類基因組成，且結(jié)構(gòu)和功能皆較保守[28]。隨著對(duì)野生動(dòng)物mhc研究的不斷深入，針對(duì)鹿科動(dòng)物mhc的研究也逐步開(kāi)展，如對(duì)白尾鹿(Odocoileusvirginianus)mhc-drb等位基因多樣性的研究[29]，白尾鹿、馬鹿(Cervuselaphus)、狍(Capreoluscapreolus)及駝鹿(Alcesalces)間mhc-drb系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究[29]，馴鹿、馬鹿與圈養(yǎng)羊、牛等跨物種mhc-dra系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究[30]，以及對(duì)林麝(Moschusmoschus)dra和drb特點(diǎn)的研究[31]。由于mhc作為抗病研究的主要候選基因，研究其基因家族具有較好的應(yīng)用價(jià)值[12]。因此，本研究以mhc-dra這一疾病抗性與易感性的候選基因?yàn)檫z傳標(biāo)記，對(duì)鹿科中的獐屬(Hydropotes)、駝鹿屬(Alces)、馴鹿屬(Rangifer)、麂屬(Muntiacus)、麋鹿屬(Elaphurus)和鹿屬(Cervus)mhc-dra的變異特點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及分子水平上的進(jìn)化選擇模式進(jìn)行探討，為我國(guó)鹿科6屬動(dòng)物的疾病預(yù)防，遺傳保護(hù)等提供分子生物學(xué)依據(jù)。同時(shí)，通過(guò)與進(jìn)化速度適中且能包含種、屬水平系統(tǒng)發(fā)育信息的cytb的進(jìn)化情況進(jìn)行比較，進(jìn)一步揭示mhc-dra的進(jìn)化歷程，探討其起源與分化關(guān)系。

1材料與方法

1.1 樣本采集與基因數(shù)據(jù)的獲得

本研究中的鹿科4屬5種的組織樣本來(lái)自于北京動(dòng)物園的歷史存留的樣本，另外2屬3種的mhc-dra第二外顯子序列來(lái)自Genbank；cytb序列均來(lái)源于GenBank(表1)。待測(cè)樣本保存于-80℃超低溫冰箱。

表1 鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra第二外顯子及cyt b序列來(lái)源

括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示個(gè)體數(shù)量

1.2基因組提取及目的基因獲得

全基因組使用組織與血液基因組提取試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)進(jìn)行提取。使用引物對(duì)dra(F：5′-CAACTCATCCCTACTCTCCATCAC-3′；R：5′-AGGCGAAAGTCTCAGTAACAAAAA-3′)對(duì)mhc-dra片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，模板濃度30～50 ng，75 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，20 mmol/L (NH4)2SO4，0.01% (v/v) Tween-20，0.2 mmol/L dNTP，引物各10 μmol/L，1 U 的TaKaRaTaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，56.5°C退火30 s, 72°C延伸30 s，40個(gè)循環(huán); 72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)分析

結(jié)合從GenBank中下載的序列，使用軟件BioEdit 7.0.5.3 和Clustal X 1.81對(duì)所得序列進(jìn)行序列編輯、比對(duì)和剪切。使用MEGA4.1軟件計(jì)算核苷酸和氨基酸的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(polymorphic sites)，獨(dú)立變異位點(diǎn)數(shù)(singleton variable sites)，平均堿基組成(average nucleotide composition)，屬間遺傳距離(基于Kimura 2-parameter替換模型)進(jìn)行計(jì)算。使用軟件DNAsp4.0對(duì)Ka(非同義替代率)和Ks(同義替代率)的值進(jìn)行計(jì)算[32]。目前，Ka/Ks被廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)基因的選擇壓力，當(dāng)二者比值大于1時(shí)表明突變導(dǎo)致了氨基酸的改變，即為正向選擇(positive selection)，若小于1則表明選擇為純化選擇(purifying selection)。

利用Modeltest3.06[33]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化重建模型選擇，計(jì)算相關(guān)參數(shù)。本研究針對(duì)鹿科7屬DRA和cytb序列分別運(yùn)用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)，最大似然法(Maximum likelihood method， ML)和貝葉斯法(Bayesion inference，BI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建。運(yùn)用PAUP4.0b10軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)NJ和ML的重建。ML樹(shù)的節(jié)點(diǎn)支持率通過(guò)100次重抽樣的方式進(jìn)行估計(jì)。BI樹(shù)通過(guò)使用軟件MrBayes 3.1進(jìn)行重建；對(duì)兩個(gè)并行的馬爾科夫鏈(Monte carlo markov chains)運(yùn)行1 000 000代，每100代抽樣1次，直至兩個(gè)并行的馬爾科夫鏈平均標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.01。放棄前10%的抽樣樹(shù)，其余的保留用以構(gòu)建BI樹(shù)。所有構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)均以亞洲野牛(Bosgaurus)dra第二外顯子和cytb序列作為外群(基因庫(kù)登錄號(hào)分別為AF385486和AB077316)。

通過(guò)MDIV軟件對(duì)屬間分歧時(shí)間進(jìn)行計(jì)算。MDIV軟件使用HKY模型，馬爾科夫鏈 (Markov chain) 運(yùn)行2 000 000次，放棄前10%的分析結(jié)果。Mmax和Tmax分別設(shè)定為10，并以最高的后驗(yàn)概率值對(duì)T和θ似然值進(jìn)行計(jì)算[34]。MDIV計(jì)算分歧時(shí)間t= Tpop*(θ/2μk)。其中，Tpop是種群分歧時(shí)間，θ是種群核苷酸突變率，μ是每個(gè)核苷酸的進(jìn)化速率，k是核苷酸序列的堿基數(shù)。種群分歧時(shí)間根據(jù)鹿科動(dòng)物線粒體cytb的進(jìn)化速率約為每百萬(wàn)年5.14%[35]和哺乳動(dòng)物mhc進(jìn)化速率為每百萬(wàn)年1.56%[36]進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)果

2.1鹿科6屬mhc-dra序列組成及變異

通過(guò)對(duì)所得鹿科6屬動(dòng)物dra第二外顯子序列的比對(duì)和剪切，獲得246 bp的序列。其中，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)18個(gè)，獨(dú)立變異位點(diǎn)13個(gè)。其中，多態(tài)性位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的3.252%。屬間平均遺傳距離為0.018(表2)。鹿科6屬dra序列比對(duì)后顯示出較低的核苷酸變異(圖1)。在所有6屬中，dra序列的屬間遺傳距離范圍在0.004 ～ 0.041(表2)。鹿科6屬動(dòng)物核苷酸A、T、C、G所占比例分別為 0.261，0.246，0.214和0.279(表3)。

圖1 鹿科6屬mhc-dra核苷酸組成比較

黑色和灰色*共同表示多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)；灰色*表示獨(dú)立變異位點(diǎn)；屬的單倍型以序號(hào)表示

表2 鹿科6屬動(dòng)物間mhc-dra第二外顯子序列的遺傳距離

下三角數(shù)據(jù)為配對(duì)遺傳距離；上三角數(shù)據(jù)為配對(duì)遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn)誤

鹿科6屬的分析均以各屬的單倍型進(jìn)行分析。在鹿科動(dòng)物中，除麋鹿屬外，其它5屬的mhc-dra序列均有各自獨(dú)特的變異位點(diǎn)。如，獐屬位點(diǎn)68、236，麂屬位點(diǎn)33、179、245，鹿屬位點(diǎn)5、80、131、140、160、244，駝鹿屬位點(diǎn)3、20、58、228，以及馴鹿屬位點(diǎn)31、51均為其各自的特有變異位點(diǎn)。

表3 鹿科6屬的平均堿基組成

2.2鹿科6屬mhc-dra氨基酸序列組成及變異

研究結(jié)果表明，鹿科6屬mhc-dra氨基酸序列的多態(tài)位點(diǎn)共計(jì)7個(gè)，占分析總氨基酸數(shù)的8.536%。鹿科6屬氨基酸的抗原結(jié)合位點(diǎn)是基于人屬[24]和馬屬動(dòng)物[25]進(jìn)行推測(cè)得出(圖2)。獐屬的氨基酸位點(diǎn)63，以及駝鹿屬氨基酸位點(diǎn)19，是完全不同于馬屬和人屬的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在與多肽側(cè)翼區(qū)域相互作用的殘基中，氨基酸位點(diǎn)47、76在鹿屬與馬屬中均出現(xiàn)了變異。除上述3個(gè)氨基酸位點(diǎn)外，其余鹿科5屬動(dòng)物的變異位點(diǎn)均在多肽結(jié)合位點(diǎn)及其相互作用殘基區(qū)域之外(圖2)。根據(jù)人屬和馬屬動(dòng)物的氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推測(cè)黑色倒三角標(biāo)記的位點(diǎn)為初級(jí)的抗原結(jié)合位點(diǎn)；白色倒三角處是與多肽側(cè)翼區(qū)域相互作用的殘基；藍(lán)色字體標(biāo)注的氨基酸表示鹿科6屬、馬屬與人屬間的氨基酸變異，紅色字體標(biāo)注的氨基酸表示鹿科動(dòng)物獨(dú)有氨基酸變異，綠色標(biāo)注的氨基酸表示鹿科6屬、馬屬和人屬共有的氨基酸位點(diǎn)(圖2)。

圖2 鹿科mhc-dra與其它物種的氨基酸差異

“.”表示與獐屬序列比對(duì)相一致；“*”為多態(tài)性位點(diǎn)，屬的單倍型以序號(hào)表示

2.3鹿科6屬mhc-dra序列的進(jìn)化選擇

mhc-dra核苷酸共編碼82個(gè)氨基酸(圖2)。通過(guò)對(duì)氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)同義位點(diǎn)變異和15個(gè)非同義位點(diǎn)變異。整個(gè)dra編碼區(qū)的Ka/Ks值表明鹿屬為正向選擇(Ka/Ks>1，表4)，其余5屬均為純化選擇(Ka/Ks<1，表4)。

表4 鹿科6屬mhc-dra第二外顯子進(jìn)化選擇

NsynDif為非同義替換變異數(shù)；NSynPos為非同義位點(diǎn)數(shù)；SynDif為同義替換變異數(shù)；SynPos為同義位點(diǎn)數(shù)；Ka為非同義替代率；Ks為每個(gè)同義位點(diǎn)的同義替代率；SilentPos為沉默位點(diǎn)數(shù)

2.4mhc-dra第二外顯子和cytb系統(tǒng)發(fā)育重建

通過(guò)Modeltest 3.7軟件確定mhc-dra第二外顯子序列系統(tǒng)發(fā)育重建模型為F81+G+I。單倍型的堿基頻率A、T、C、G頻率分別為 0.261、0.246、0.214和0.279；轉(zhuǎn)換顛換比(transition/transversion，R)為3.476；不變位點(diǎn)比率(Pinvar)為0.09，γ分布型參數(shù)為2.42，shape=0.50，-lnL=573.78。

確定cytb的系統(tǒng)發(fā)育重建模型為GTR+G+I。單倍型的堿基頻率A、C、G和T分別為0.311、0.288、0.131和0.292；轉(zhuǎn)換顛換比為12.03；不變位點(diǎn)比率為0.39，γ分布型參數(shù)為25.03，shape=0.49，-lnL=4 807.46。

基于mhc-dra第二外顯子以及cytb序列構(gòu)建的NJ、ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)具有相似的結(jié)構(gòu)。因此，本研究?jī)H列出了ML樹(shù)(圖3)，而ML、NJ和BI樹(shù)的節(jié)點(diǎn)支持率以及各分支的分歧年代詳見(jiàn)表5。基于cytb的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，舊世界鹿的種間分化時(shí)間大約發(fā)生在上新世早期至上新世晚期，新世界鹿的種間分歧大約發(fā)生在上新世的中、晚期(表5)。然而，基于mhc-dra第二外顯子構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，該基因在進(jìn)化歷史中的分歧時(shí)間更晚，且最早的分歧發(fā)生在上新世晚期(表5)。

圖3 鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra第二外顯子(A)和cyt b(B)的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖中依次標(biāo)注了種名、屬名和亞科名；灰色粗體實(shí)線表示屬，黑色粗體實(shí)線表示科，黑色虛線表示新世界鹿類和舊世界鹿類；黑色線段表示單位分支長(zhǎng)度；各分支序號(hào)代表各結(jié)點(diǎn)支持率和分歧年代，詳見(jiàn)表5

表5 mhc-dra第二外顯子和cyt b系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各結(jié)點(diǎn)支持率及分歧年代

3討論

3.1鹿科6屬mhc-dra第二外顯子核苷酸及氨基酸序列變異

mhc的多樣性和選擇模式對(duì)于理解免疫功能適應(yīng)性意義是必不可少的[37]。mhc處于機(jī)體特異免疫反應(yīng)的中心地位，各類生物mhc的生物學(xué)功能相同[38]。它們參與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)，并與某些病理狀態(tài)有著密切的關(guān)系。經(jīng)典的mhc分子的主要功能是通過(guò)外源和自身肽呈遞給T-細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答[39]。mhcII則控制著體液免疫應(yīng)答中的T、B及巨噬細(xì)胞間的相互作用，同時(shí)也參與細(xì)胞免疫[40]。mhc-dra組成了mhcⅡ類分子復(fù)合體的a肽鏈，對(duì)于mhcⅡ在細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)和抗原肽的有效呈遞起到了重要的作用[38]。mhcII遺傳背景的差異和多樣性水平的高低都會(huì)導(dǎo)致個(gè)體或不同物種對(duì)疾病抗性和易感性的差異[41]。而等位基因多樣性是通過(guò)物種分化事件中的平衡選擇來(lái)維持[42]。鹿科動(dòng)物mhc-dra氨基酸和核苷酸序列的變異遠(yuǎn)較非人靈長(zhǎng)類和馬科動(dòng)物少(圖2)，卻高于犬、牛、羊、豬等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[37]；鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra編碼的氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)比例則要高于核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)比率。通過(guò)對(duì)鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra多態(tài)性的研究，還促進(jìn)了鹿科動(dòng)物中新的dra等位基因和抗原結(jié)合位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。鹿科動(dòng)物的核苷酸和氨基酸組成均表現(xiàn)出與馬屬、人屬不同的變異特點(diǎn)，其中很多位點(diǎn)均表現(xiàn)出鹿科特有的核苷酸和氨基酸變異(圖1和圖2)。氨基酸中有一些氨基酸位點(diǎn)是特殊的，如鹿科動(dòng)物氨基酸位點(diǎn)14、15、33、42、60、63、68完全不同于馬屬和人屬。其中鹿科的抗原結(jié)合位點(diǎn)63(N)，是完全不同于馬屬或人屬的抗原結(jié)合位點(diǎn)(D/E)[37, 39]。有研究表明，mhcII類分子與許多疾病有著很強(qiáng)的相關(guān)性[43]，例如，現(xiàn)已證實(shí)暴發(fā)過(guò)惡性卡他熱的美洲野牛mhc個(gè)體變異的存在，使其對(duì)惡性卡他熱病毒的抗性存在差異[44]。因此，該研究也可能暗示了鹿科動(dòng)物有著不同的抗原結(jié)合模式，而抗原結(jié)合位點(diǎn)的變異則有可能導(dǎo)致氨基酸功能、疾病易感性或抗性的差異，這一推測(cè)尚有待今后的進(jìn)一步深入研究。此外，有研究結(jié)果表明，維持mhc多樣性的主要機(jī)制在于潛在病原體的驅(qū)動(dòng)[45]，而在鹿屬mhc-dra中抗原結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)保守，即非同義突變相對(duì)較少。因此，本研究進(jìn)一步推測(cè)mhc-dra可識(shí)別外界病原體的范圍也相對(duì)較小[46]。

3.2鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra第二外顯子的進(jìn)化選擇模式

鹿科動(dòng)物常處于比較強(qiáng)的病原體的選擇壓力之下[47, 48]，因此，進(jìn)一步研究mhc-dra第二外顯子的適應(yīng)性進(jìn)化將促進(jìn)我們對(duì)鹿科動(dòng)物免疫基因的了解。通常，選擇壓力是外界施于生物體進(jìn)化過(guò)程的壓力，以改變進(jìn)化過(guò)程的前進(jìn)方向，從而給予能夠適應(yīng)自然環(huán)境者得以存活和繁衍的力量；而正向選擇則可以維持物種特定的等位基因跨越很長(zhǎng)的時(shí)間尺度[42]。目前，科學(xué)家所公認(rèn)的是mhc的多態(tài)性最可能通過(guò)正向選擇來(lái)維持，而該選擇是密碼子的非同義突變高于同義突變所形成[49]。相對(duì)而言，dra在鹿科6屬動(dòng)物中非同義突變并不多，基于mhc-dra第二外顯子序列Ka/Ks的研究結(jié)果，揭示了鹿科6屬動(dòng)物是以純化選擇為主導(dǎo)，以正選擇為輔。其中，鹿屬為正向選擇，暗示其進(jìn)化處于更高的選擇壓力之下，而使其更趨向于更多的異義突變。然而，同屬于鹿亞科的麋鹿屬則為純化選擇，暗示其被選擇的壓力相對(duì)較小。其它4屬也同樣處于純化選擇之下，該結(jié)果暗示了在進(jìn)化過(guò)程中鹿科動(dòng)物mhc-dra相對(duì)保守，也暗示了該基因可能具有比較重要的生物學(xué)功能[50]。

3.3鹿科動(dòng)物mhc-dra第二外顯子cytb系統(tǒng)進(jìn)化比較

曾有學(xué)者利用線粒體12S rRNA、16S rRNA和cytb序列探討了鹿亞科、麂亞科、獐亞科以及空齒鹿亞科的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，暗示了鹿亞科為其它三個(gè)亞科的姐妹群[25]，認(rèn)為現(xiàn)行分類系統(tǒng)中，麋鹿屬與鹿屬有較近的進(jìn)化關(guān)系，中國(guó)馬鹿在系統(tǒng)發(fā)生上是一單系群[27]。而本研究通過(guò)對(duì)鹿科6屬mhc-dra第二外顯子序列和cytb序列的進(jìn)一步研究，也得到了相一致的結(jié)果。與馬屬動(dòng)物的dra第二外顯子基因不同[37]，鹿科6屬動(dòng)物dra第二外顯子和cytb的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相似，均具有較明顯的系統(tǒng)進(jìn)化分支結(jié)構(gòu)。mhc-dra第二外顯子與cytb的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果均形成了舊世界鹿類(麂屬、麋鹿屬、鹿屬)與新世界鹿類(獐屬、駝鹿屬、馴鹿屬)的兩大姐妹類群，且分化時(shí)間分別處于上新世晚期和上新世早期。根據(jù)cytb全序列的分析結(jié)果，暗示麂亞科是由上新世中期向上新世晚期的過(guò)渡時(shí)期分化的類群，而麂亞科的mhc-dra第二外顯子的分化則是上新世晚期向更新世過(guò)渡時(shí)期出現(xiàn)的。因此，本研究推測(cè)麂亞科cytb和mhc-dra第二外顯子的基因型可能是鹿亞科與其它亞科之間的過(guò)渡型。

根據(jù)已知最古老有角鹿類化石的資料可以將出現(xiàn)時(shí)間追溯到19 ～ 21百萬(wàn)年以前[25]。然而，鹿亞科和麂亞科最早發(fā)現(xiàn)其化石的時(shí)間大約在6 ～ 8百萬(wàn)年前晚中新世時(shí)期的亞洲或歐洲[51]，而空齒鹿亞科的祖先可能會(huì)被追溯到更早的時(shí)間[52]。然而，本研究中根據(jù)現(xiàn)有序列推算得到的歷史分歧時(shí)間較化石出現(xiàn)時(shí)間更晚，鹿亞科和麂亞科cytb序列的分歧時(shí)間大約在4.28百萬(wàn)年前的上新世早期，而mhc-dra序列的分歧時(shí)間約在1.74百萬(wàn)年前的更新世時(shí)期?？正X鹿亞科和獐亞科的cytb和mhc-dra第二外顯子序列的分歧時(shí)間分別約在5.11百萬(wàn)年前的上新世早期和2.05百萬(wàn)年前的上新世晚期。根據(jù)已有對(duì)鹿科cytb序列進(jìn)化歷史的研究結(jié)果，麇鹿屬與鹿屬的分化時(shí)間在2.15 ～ 2.50百萬(wàn)年前[35]。然而，本研究得到的麇鹿屬與鹿屬分歧時(shí)間大約在3.62百萬(wàn)年前，這可能是由于研究所涉及的鹿屬動(dòng)物物種差異和地域性差異所致。雖然有研究表明，哺乳動(dòng)物mhc等位基因的分歧時(shí)間往往早于物種的分歧時(shí)間[53]，但本研究中所涉及的鹿科6屬動(dòng)物mhc-dra分化時(shí)間卻晚于物種分化的時(shí)間，這可能與樣本數(shù)較小有一定關(guān)系。鹿科6屬動(dòng)物的mhc-dra第二外顯子的分化時(shí)間大約在2.05 ～ 1.68百萬(wàn)年前的上新世晚期至更新世時(shí)期。兩百萬(wàn)年前，恰逢第四紀(jì)大冰期，第四紀(jì)氣候變化引起整個(gè)自然環(huán)境的變化，脊椎動(dòng)物也表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性進(jìn)化[54]。而mhc-dra第二外顯子的分化正處于第四紀(jì)大冰期氣候變化最為劇烈的時(shí)期，這可能也是推動(dòng)mhc-dra第二外顯子的分化的原因之一。

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Variation characteristic of MHC-DRA exon 2 in six deer genera of family Cervidae and phylogenetic evolution compared with Cyt b

YOU Yu-yan1, ZHANG Cheng-lin1, ZHANGJin-guo1, RUAN Xiang-dong2, ZHANG Lin-yuan3,ZHONG Zhen-yu3, ZHENG Chang-ming1, LIU Xue-feng1, WANG Wei1, CAO Chang-lei4

(1. Beijing Key Laboratory of Captive Wildlife Technologies, Beijing Zoo, Beijing 100044; 2. National Forest Inventory and Design Institute, Beijing 100714; 3. Beijing Milu Ecological Research Center, Beijing 100076;4. Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China)

AbstractIn this study, the variation characteristics and revealed evolutionary selection mode at the molecular level of the major histocompatibility complex dra (mhc-dra) exon 2 in the six deer genera of family Cervidae were investigated and compared with cyt b gene. 246 bp of mhc-dra exon 2 sequences of six deer genera in family Cervidae were obtained based on sequencing method. The results showed that there were 18 polymorphic sites and 13 singleton variable sites. The nucleotide variations of mhc-dra exon 2 were low and each genus had its own unique variation loci. There were 20 putative antigen-binding sites in this region, in which position 63 and 18 were different from genus Equus and Homo, which suggested the six deer genera might have different antigen-binding model. According to the ratio of non-synonymous substitution rates (Ka) and synonymous substitution rates (Ks), the mhc-dra exon 2 is positive selection for Cervus, and is purifying selection for the other five genera. The Neighbor-joining method (NJ)，Maximum likelihood method (ML) and Bayesion inference (BI) of the mhc-dra exon 2 and cyt b were in a similar result, and all formed sister groups between the old world deer and the new one. The gene type of cyt b and mhc-dra exon 2 clearly showed subfamily Muntiacinae is a transition group between subfamily Cervinae and other subfamilies. Climate and environmental changes might be potential reasons to promote the differentiation of mhc-dra exon 2.

Key wordsmhc-dra; molecular evolution; phylogenetic evolution; selective pressure

收稿日期：2015-09-16；修回日期：2015-09-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31200145)資助

作者簡(jiǎn)介：由玉巖，博士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楸Ｗo(hù)生物學(xué)，E-mail: youyy351@163.com。

中圖分類號(hào)Q953

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0034-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.034