藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚內(nèi)參基因的克隆及表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

張家玲，薛良義，史鈞信

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚內(nèi)參基因的克隆及表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

張家玲，薛良義，史鈞信

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

摘 要合適內(nèi)參基因的選擇是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)準(zhǔn)確測定目的基因表達(dá)量的前提。首先克隆了藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚3個(gè)內(nèi)參基因β-actin、GAPDH和EF1-α的部分序列，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析β-actin、GAPDH、EF1-α和18S rRNA 4個(gè)內(nèi)參基因在藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚各組織中的Ct值，應(yīng)用3種內(nèi)參基因篩選軟件(geNorm，NormFinder和Bestkeeper)綜合分析這4個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EF1-α，其次是18S rRNA。研究結(jié)果為今后藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚合適內(nèi)參基因的選擇提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；內(nèi)參基因；geNorm軟件；表達(dá)穩(wěn)定性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技術(shù)比傳統(tǒng)的半定量及Northern雜交等方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢，可以更準(zhǔn)確分析基因表達(dá)差異，成為基因表達(dá)水平測定的最常用的方法[1, 2]。但是，這種方法的準(zhǔn)確性受到多種因素的影響，包括RNA的質(zhì)量、cDNA反轉(zhuǎn)錄酶的活性、PCR擴(kuò)增效率及合適的內(nèi)參基因等[3, 4]，其中內(nèi)參基因的選擇是一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。內(nèi)參基因在生物體不同組織、不同發(fā)育時(shí)期或不同實(shí)驗(yàn)條件下具有相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)特性[5-7]。但是，近年的研究表明，在不同實(shí)驗(yàn)體系中，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性是不一樣的。Olsvik等對(duì)大西洋鮭魚8種組織中6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在肌肉、肝臟、腮、頭腎、脾臟、胸腺中EF1AB是最穩(wěn)定的；在腦和腸中最穩(wěn)定的分別是EF1AA和β-actin。GAPDH在肝臟、頭腎、脾臟、腦和胸腺中穩(wěn)定性最差。建議EF1AA和EF1AB可作為大西洋鮭魚基因表達(dá)定量研究的內(nèi)參基因[8]。Ma等在許氏平鲉qPCR內(nèi)參基因篩選中，發(fā)現(xiàn)8種內(nèi)參基因在心、肝臟、腸、腮、肌肉、腦、腎臟、脾臟、卵巢和睪丸等組織中表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，RPL17和EF1A是最穩(wěn)定的，GAPDH是最不穩(wěn)定的[9]。所以對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)體系，必須進(jìn)行最適合內(nèi)參基因的篩選，以減少實(shí)驗(yàn)的誤差。藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚(Scomberomorusniphoius)隸屬于鱸形目、鲅科、馬鮫屬，是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類。近幾年人工養(yǎng)殖馬鮫魚已經(jīng)初步成功，但是藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚基因功能方面的研究非常少，NCBI數(shù)據(jù)庫只報(bào)道了18SrRNA序列，Zhang等在運(yùn)用分子生物學(xué)方法識(shí)別中國南海魚類時(shí)，藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚18SrRNA序列被用于DNA條形碼技術(shù)中的一種工具[10]。

本實(shí)驗(yàn)選取qPCR最常使用的β-actin，GAPDH，EF1-α和18SrRNA這4 個(gè)內(nèi)參基因作為篩選藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚qPCR最佳內(nèi)參基因的候選基因。利用geNorm軟件[11]、NormFinder軟件[12]和BestKeeper軟件[13]分析這4個(gè)候選內(nèi)參基因在各組織中表達(dá)的穩(wěn)定性，篩選出最合適的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚全部捕自浙江象山港，平均體重(0.6±0.15)kg。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA第一鏈合成

藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚活體解剖后取樣(每組樣品分別取自3條魚)，取腦、眼、腮、腎、脾、肝臟、腸、性腺、胃、心和肌肉等11個(gè)組織，每個(gè)組織約100 mg于1.5 mL RNasefree管中，加入1 mL Trizol(Invitrogen，USA)試劑，參照Trizol說明書抽提RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性，超微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度。每份組織取2 μg RNA，按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，大連寶生物)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。得到的cDNA 樣本-20 ℃保存。

1.2.2基因組DNA的提取

采用SQ Tissue DNA Kit(Omega，USA)從肌肉組織提取藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚基因組DNA。具體步驟參照說明書。

1.2.3藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚內(nèi)參基因的克隆

采用同源克隆的方法克隆β-actin、GAPDH和EF1-α這3個(gè)內(nèi)參基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索已登錄的鱸形目的大黃魚(Larimichthyscrocea，GenBank number：GU584189.1)；重牙鯛(Diplodussargus，GenBank：JN210581.1)；點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioiaes，GenBank: AY510710.2)等的β-actin基因序列，利用Primer5.0和DNAstar軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增保守區(qū)的兼并引物，命名為β-actin-f和β-actin-r。

EF1-α和GAPDH的克隆步驟參照上述β-actin。引物EF-f/EF-r克隆EF1-α；GAPDH-f/GAPDH-r克隆GAPDH。分別以藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚肌肉組織DNA和cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送上海華大生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果用DNAstar和blast等軟件進(jìn)行分析比較。

1.3 定量引物的設(shè)計(jì)

在β-actin、GAPDH和EF1-α內(nèi)部設(shè)計(jì)1對(duì)跨內(nèi)含子的特異性引物作為定量引物，分別命名：β-ref-f/β-ref-r；GAPDH-ref-f/GAPDH-ref-r和EF-ref-f /EF-ref-r。根據(jù)GenBank上已報(bào)道的藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚18SrRNA(Scomberomorusniphonius，GenBank number：JN211933.1)序列設(shè)計(jì)特異性的定量引物：18S-ref-f和18S-ref -r。引物相關(guān)信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)引物

1.4 qPCR分析

采用Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox)(羅氏，上海)和Eppendorf Mastercycler ep Realplex2PCR儀(Eppendorf，德國)進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。具體步驟參照說明書。在延伸階段檢測熒光強(qiáng)度，收集信號(hào)。之后進(jìn)行55℃～95℃熔解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚β-actin、GAPDH和EF1-α的克隆與鑒定

引物β-actin-f/β-actin-r分別以藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚肌肉cDNA和DNA為模板，克隆得到藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚β-actin的cDNA序列1 128 bp，DNA序列2 114 bp(圖1)。cDNA和DNA的序列比對(duì)顯示藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚β-actin含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，外顯子和內(nèi)含子的邊界符合GT-AG規(guī)律。其中第1個(gè)內(nèi)含子長度363 bp，第2個(gè)內(nèi)含子長度415 bp，第3個(gè)內(nèi)含子長度112 bp，第4個(gè)內(nèi)含子長度96 bp。序列處理在線工具包(SMS)分析發(fā)現(xiàn)其cDNA編碼375個(gè)氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為41.733 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為5.28。序列已提交GeneBank(GeneBank number：KT009015)。

引物GAPDH-f/GAPDH-r和EF-f/EF-r以藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚肌肉DNA為模板，克隆得到藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚GAPDH和EF1-α部分DNA序列，片段大小分別為：272 bp和383 bp(圖1)，GAPDH和EF1-α序列已提交GeneBank(GeneBank number：KT009013；KT009014)。

圖1 β-actin、GAPDH和EF1-α PCR產(chǎn)物

M：2000 bp Marker；1、2：GAPDH和EF1-α的DNA片段；A：2000 bp Marker；B、C：β-actin的DNA片段

2.2 內(nèi)參基因定量引物的檢測

qPCR預(yù)試驗(yàn)檢測引物特異性(圖2)。從熔解曲線中可以看出，引物擴(kuò)增片段的特異性很好，并且無引物二聚體。

圖2 4對(duì)引物的溶解曲線

2.3 不同組織中各內(nèi)參基因的Ct值

4個(gè)內(nèi)參基因在各組織中的Ct值對(duì)比顯示如圖3?？傮w來說，18SrRNA在11種組織中的表達(dá)量最高(CtMean=13.04±0.105)；腦、眼、腮、腎、性腺、心和胃組織中EF1-α次之(CtMean=20.52±0.09)，脾和肝中β-actin次之，肌肉和腸中GAPDH次之；GAPDH在腦、眼、脾、肝、性腺、腮和腎臟中的表達(dá)量最低(CtMean=25.27±0.15)，但是在心、肌肉、胃和腸中β-actin的表達(dá)量是最低的。

圖3 4個(gè)內(nèi)參基因在藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚11種不同組織中

1：心；2：肌肉；3：腦；4：眼；5：脾臟；6：胃；7：肝臟；8：性腺；9：腮；10：腎臟；11：腸

2.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

運(yùn)用geNorm軟件對(duì)4個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定值進(jìn)行計(jì)算，內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、GAPDH和EF1-α的穩(wěn)定值M依次為：0.440、0.406、0.630及0.393，基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1-α>18SrRNA>β-actin>GAPDH。

經(jīng)過NormFinder程序計(jì)算，本試驗(yàn)中藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序：EF1-α>β-actin>18SrRNA>GAPDH(表2)。

表 2 NormFinder 軟件計(jì)算出的內(nèi)參基因穩(wěn)定值

BestKeeper程序根據(jù)所有被研究的基因的Ct值計(jì)算基因表達(dá)變化量。從表3中可以看出，EF1-α基因有最高的相關(guān)系數(shù)(r=0.84)，它自身的變異系數(shù)(CV)最低；標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)較低。所以BestKeeper分析結(jié)果與GeNorm軟件基本一致，基因穩(wěn)定性排序?yàn)椋篍F1-α>18SrRNA>β-actin>GAPDH。所以，綜合這3種軟件分析得出：最適內(nèi)參基因?yàn)镋F1-α，其次為18SrRNA。

表3 BestKeeper分析4個(gè)內(nèi)參基因在藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性

3 討論

本試驗(yàn)首先從藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚中克隆了β-actin、GAPDH和EF1-α這3個(gè)常用內(nèi)參基因，其核苷酸序列分別為2 114 bp、272 bp和383 bp。blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)與鱸形目的條石鯛、尖吻鱸和南方黑鮪的β-Actin、GAPDH和EF1-α核苷酸序列的相似性分別為98%、99%和96%，物種間高度保守。這些基因片段補(bǔ)充了NCBI上藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚基因數(shù)據(jù)，為今后研究藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

熒光定量PCR技術(shù)中，Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。比較藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚各組織中4個(gè)內(nèi)參基因的Ct值發(fā)現(xiàn)，18SrRNA的Ct值最低，表明藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚中18SrRNA表達(dá)量最高，其次是EF1-α。

在qPCR分析過程中，評(píng)價(jià)作為校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因有多種分析方法。目前，已開發(fā)的用于內(nèi)參基因篩選的軟件包括：GeNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件。分別使用這三個(gè)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選出穩(wěn)定度最高的內(nèi)參基因，最后綜合這三個(gè)軟件得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[14]。geNorm軟件將某一看家基因與其他看家基因表達(dá)水平的兩兩比值經(jīng)對(duì)數(shù)變換后，計(jì)算其平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M，M值越小，說明候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越好，反之穩(wěn)定性越差[15]。geNorm用于qPCR內(nèi)參基因穩(wěn)定性以及最適數(shù)目的判定，已經(jīng)在動(dòng)物、微生物和植物等物種的基因表達(dá)研究中得到廣泛應(yīng)用[16]。Eileen等通過geNorm軟件分析蠑螈各組織中11 個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)ACTB是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[17]。BestKeeper數(shù)據(jù)的初步分析是根據(jù)原始Ct值計(jì)算所有樣本中的所有內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD(±Ct)和變異系數(shù)CV (%CT)，SD值和CV值越小，穩(wěn)定性越好。NormFinder 程序則是通過對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)分析得出基因的表達(dá)穩(wěn)定值，根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，具有最小穩(wěn)定值的基因是最為穩(wěn)定的基因。Deloffre綜合GeNorm、NormFinder和BestKeeper這3 種軟件分析硬骨魚類卵子發(fā)生過程中定量內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)盡管這3種軟件對(duì)6個(gè)內(nèi)參基因(β-actin、CTSD、CTSZ、EF1A、TBP和TUBA1A)的穩(wěn)定性排序不同，但是都選擇相同最佳內(nèi)參基因CTSD和ACTB[18]。因此比較不同算法，對(duì)內(nèi)參基因選擇可以提供更精確地評(píng)估。

本實(shí)驗(yàn)通過這3種軟件分析候選內(nèi)參基因在藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)EF-1α在各組織中表達(dá)最穩(wěn)定，18SrRNA次之。GAPDH是最不穩(wěn)定的，證實(shí)了這個(gè)基因作為內(nèi)參基因的普遍懷疑論[19]。EF-1α和18SrRNA都可以作為藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚qPCR的內(nèi)參基因。但是，一般我們不選擇18SrRNA，主要是因?yàn)閞RNA占總RNA量的80%左右，呈高豐度表達(dá)，可能會(huì)比目的基因的表達(dá)豐度高很多，容易造成試驗(yàn)過程中和數(shù)據(jù)分析時(shí)易放大誤差。且有研究表明18SrRNA的轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響，Spanakis等發(fā)現(xiàn)28SrRNA、18SrRNA在有絲分裂期間表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化[20]。因此建議在藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)選取EF1-α基因作為內(nèi)參基因，而不是18SrRNA。本研究為今后藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚基因定量表達(dá)研究中合適內(nèi)參基因的選擇提供了依據(jù)。

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Cloning and expression stability evaluation of reference genes in Spanish Mackerel (Scomberomorus niphonius)

ZHANG Jia-ling, XUE Liang-yi, SHI Jun-xing

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

AbstractSelection of a suitable reference gene is an important prerequisite for precise analysis of target gene expression by Real-time quantitative PCR(qPCR). In this paper, the partial sequence of three reference genes, β-actin and GAPDH, EF1-α, from spanish mackerel Scomberomorus niphonius were firstly cloned, and then the Ct values of the four reference genes in various tissues were measured by qPCR. Three different statistical algorithms including geNorm, NormFinder and BestKeeper were used to analyze the expression stability of the four reference genes in different tissues. The result showed that the most stable reference gene was EF1-a, followed by 18S ribosomal RNA. It provides a useful basis for selecting of the appropriate reference gene in Spanish Mackerel.

Key wordsScomberomorus niphonius; qPCR; reference gene; geNorm; expression stability

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2015-10-27

基金項(xiàng)目：寧波市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：2012C10035)

作者簡介：張家玲，碩士研究生，主要從事海洋生物基因資源，E-mail：xin.jialing@163.com； 通信作者：薛良義，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事魚類分子生物學(xué)研究，E-mail：xueliangyi@nbu.edu.cn。

中圖分類號(hào)Q344+.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0020-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.020