免疫膠體金滲透技術(shù)檢測(cè)抗卵巢抗體的試驗(yàn)研究*

李　凱，李相新，文海軍，韋僖雯，譚汝宏，江潤(rùn)昌

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科　528000)

·臨床研究·

免疫膠體金滲透技術(shù)檢測(cè)抗卵巢抗體的試驗(yàn)研究*

李凱，李相新，文海軍，韋僖雯，譚汝宏，江潤(rùn)昌

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科528000)

摘要:目的建立免疫膠體金滲透技術(shù)檢測(cè)抗卵巢抗體(AOAb)的新方法。方法采用人源卵巢抗原，以膠體金顆粒結(jié)合的羊抗人 IgG為標(biāo)記抗體，根據(jù)免疫膠體金技術(shù)原理，建立免疫膠體金滲透技術(shù)法檢測(cè)人血清抗卵巢抗體。分別檢測(cè)72份抗卵巢抗體陽(yáng)性血清和88份健康體檢女性血清，并與酶聯(lián)吸附試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比，其符合率為 88.75%，特異性為 90.91%，敏感度為86.11%。交叉試驗(yàn)與重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫膠體金滲透技術(shù)測(cè)定抗卵巢抗體具有穩(wěn)定性和特異性。結(jié)論免疫膠體金滲透技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定血清抗卵巢抗體，便于推廣普及。

關(guān)鍵詞:免疫膠體金滲透技術(shù)；抗卵巢抗體；免疫性不孕；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

抗卵巢抗體是由感染、手術(shù)、藥物、自身免疫疾病等原因引起的一種靶抗原在卵巢顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞、黃體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的自身多靶位多克隆抗體，能夠引起卵巢的病理?yè)p傷、功能衰竭，進(jìn)而導(dǎo)致不孕發(fā)生[1-2]。調(diào)查研究顯示，免疫性因素導(dǎo)致的不孕不育已成為困擾適齡生育人群的重要問題，其中10%～30%的不孕患者是由于抗卵巢抗體導(dǎo)致的[3]。因此，采用免疫膠體金滲透技術(shù)建立特異、敏感、快速的抗卵巢抗體檢測(cè)具有重要的意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年1～12月來佛山市婦女兒童醫(yī)院就診的門診和住院抗卵巢抗體陽(yáng)性的患者72份血清作為試驗(yàn)組，同時(shí)選取健康體檢女性88份血清作為對(duì)照組，共計(jì)160份，平均年齡(28.7±4.5)歲。

1.2材料

1.2.1卵巢抗原制備用生理鹽水將人卵巢組織清洗干凈，在pH7.4的0.04 mol/L的Tris-HCL緩沖液中勻漿，過濾，5 000 r/min離心15 min，棄去上清，將沉淀置于0.1 g/L的蔗糖溶液中，加入Trition X-100裂解，離心收集上清，通過抗人全血清的瓊脂糖交換樹脂sepharose 4B柱，收集清洗液即為人卵巢抗原[4]。

1.2.2試劑抗人卵巢IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.2.3免疫膠體金滲透技術(shù)方法的建立取1 μg/μL人卵巢抗原液噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜中央作為檢測(cè)線,其下方噴點(diǎn)健康人血清 IgG作為質(zhì)控線，4 ℃放置2 h,37 ℃恒溫箱內(nèi)烘干，冷藏備用。

1.3標(biāo)本采集與檢測(cè)所有研究對(duì)象抽取空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待檢。檢測(cè):在加樣孔上滴加封閉液 100 μL待滲入，滴加未稀釋血清標(biāo)本50 μL，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。質(zhì)控線與檢測(cè)線都顯色者為陽(yáng)性；質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色者為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1吸收試驗(yàn)將純化的人卵巢抗原與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢出的抗卵巢抗體陽(yáng)性血清20份等體積混合后用膠體金試紙條檢測(cè)抗卵巢抗體，結(jié)果均為陰性。

2.2干擾試驗(yàn)血清標(biāo)本中三酰甘油小于或等于25 mmol/L，總膽紅素小于或等于1 000 mmol/L，血紅蛋白小于或等于10 g/L時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響

2.3對(duì)比試驗(yàn)見表1。采用免疫膠體金滲透技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測(cè)72份抗卵巢抗體陽(yáng)性血清和88份健康體檢血清，結(jié)果對(duì)比其符合率為 88.75%，特異性為 90.91%，敏感度為86.11%，兩種方法存在正向一致性(P<0.05)，一致性程度較好(Kappa>0.75)。

表1　　免疫膠體金滲透技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.4重復(fù)試驗(yàn)及穩(wěn)定性檢測(cè)隨機(jī)取出不同批次和批間的試紙條進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，保存6個(gè)月之內(nèi)試紙條效果良好，無特異性產(chǎn)生。

3討論

近年來，隨著生殖免疫醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展，大量的研究數(shù)據(jù)證明，免疫因素是導(dǎo)致不孕和習(xí)慣性流產(chǎn)的重要原因，其中抗卵巢抗體是導(dǎo)致女性不孕較為常見的免疫因素[5]。抗卵巢抗體是自身免疫系統(tǒng)將卵巢組織作為抗原而引起的自身免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的抗體，其與卵巢組織抗原相互結(jié)合時(shí)，單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤(rùn)可以對(duì)卵巢造成不可逆的病理?yè)p傷，如卵母細(xì)胞數(shù)量減少、顆粒細(xì)胞變性壞死等，進(jìn)而影響卵巢的正常功能，阻礙卵母細(xì)胞成熟、雌孕激素的產(chǎn)生減少等，導(dǎo)致卵巢功能衰退，甚至不孕[6]。因此，抗卵巢抗體的檢測(cè)已作為不孕不育患者的重要檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)免疫性不孕的診斷具有重要意義。

免疫膠體金滲透技術(shù)是一種以膠體金為標(biāo)記物，利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性判斷的標(biāo)記技術(shù)。通過免疫膠體金滲透技術(shù)檢測(cè)抗卵巢抗體具有操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，結(jié)果清晰，易于觀察，試劑盒可長(zhǎng)期保存，費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)[7]。避免了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作步驟較多、易受反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、洗板是否徹底等諸多因素的影響。在本研究中，與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)比，免疫膠體金滲透技術(shù)的結(jié)果符合率為 88.75%，特異性為 90.91%，敏感度為86.11%，兩種方法存在正向一致性，而且一致性程度較好。

因此，免疫膠體金滲透技術(shù)檢測(cè)抗卵巢抗體的方法可滿足臨床快速檢測(cè)，特別適合于基層醫(yī)院不孕不育篩查的要求。

參考文獻(xiàn)

[1]林建華,嚴(yán)雋鴻,林其德，等.抗卵巢抗體對(duì)卵巢組織及其功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1998,33(1):20-22.

[2]陳永珍,朱旻,張?zhí)K.抗生殖免疫抗體和女性不孕的關(guān)系[J].解剖學(xué)雜志,2003，26(6):609-610.

[3]陳桂冰,黃紹坤,趙香生，等.免疫不孕患者自身抗體檢測(cè)結(jié)果分析[J].職業(yè)與健康，2008，24(16):1725-1726.

[4]陳金娣,黃邱朝,武建國(guó).血清中三種Ig類抗卵巢自身抗體的測(cè)定及其臨床意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志,1994，12(S1):12-14.

[5]王逢春.抗卵巢抗體檢測(cè)在不孕癥診斷中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2011，24(17):2098-2099.

[6]趙成元,王麗,王華，等.免疫性不孕抗體陽(yáng)性引發(fā)不孕癥的臨床診治分析[J].中國(guó)婦幼保健，2013，28(34):4681-4682.

[7]朱文釧,孔繁德,林祥梅，等.免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用及展望[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,26(4):81-87.

* 基金項(xiàng)目：廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(201208013)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.031

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)11-1528-02

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-27)