漆酶Lac1338的酶學特性測定及定向突變對其酶解染料影響

張雪玲 陳小利 李荷

（廣東藥學院基礎學院生物化學與分子生物學系，廣州 510006）

漆酶Lac1338的酶學特性測定及定向突變對其酶解染料影響

張雪玲 陳小利 李荷

（廣東藥學院基礎學院生物化學與分子生物學系，廣州 510006）

為了獲得表達量高、熱穩(wěn)定性好的漆酶，通過密碼子優(yōu)化合成漆酶基因lac1338、連接到pET-32a（+）載體上并在Escherichia coli BL21（DE3）中表達，獲得HIS-Lac1338蛋白。酶學性質測定結果顯示，以ABTS為底物時，HIS-Lac1338的比活力高達22.8 U/mg，Km 和Vmax 分別為567 μmol/L 和2.8 mmol/ （L·min·g）；HIS-Lac1338的最適反應溫度為55℃，最適pH為6.0；在55℃以下保溫2 h能保留50%的酶活性，在pH 4-8范圍內孵育4 h仍保留50%以上的活性；HIS-Lac1338對Cu2+抗性強，Ca2+、Na+、K+對HIS-Lac1338有促進作用，而Co2+、Fe2+、Hg2+、Ag+等重金屬離子對HIS-Lac1338有抑制作用。易錯PCR方法得到的Lac1338的突變酶Lac16與HIS-Lac1338相比，對酸性紫7、溴酚藍、考馬斯亮藍的降解率分別由10.9%、20%和25%提高到90.5%、67.8%和85%。結果表明，HIS-Lac1338具有較好的溫度及pH穩(wěn)定性，而通過易錯PCR技術定向突變獲得的突變酶Lac16的染料降解率大大提高。

漆酶；克隆表達；酶學性質；定向進化；染料降解

漆酶最早是從日本的漆樹汁中發(fā)現的［1］，它是人類研究最早的酶之一，屬于多銅氧化酶家族中的一大類，可利用分子氧通過自由基催化反應來氧化各種芳香族和非芳香族化合物，在植物、真菌、細菌中廣泛存在，但至今人們對于這種酶的認識比較有限［2］。近年來隨著漆酶功能的逐步發(fā)現，漆酶的研究受到普遍重視，它在降解木質素方面的功能，使其在制漿造紙工業(yè)，特別是紙漿生物漂白方面得到深入的研究和開發(fā)［3，4］；在生物能源的開發(fā)利用方面應用也很廣泛，如利用漆酶降解木質纖維原料中的木質素，提高纖維素水解成單糖的效率及生產乙醇等新能源［5］；在環(huán)保方面亦具有較大的應用潛力，如可去除有毒的非酚類［6］、除草劑、殺蟲劑［7］及合成有機物［8，9］石油工業(yè)廢物等物質的毒性。

我們利用密碼子最優(yōu)化方法合成的漆酶基因lac1338，通過原核表達獲得了表達量高、熱穩(wěn)定性較好的漆酶HIS-Lac1338，并且該漆酶能夠降解多種染料，但是其比酶活相對較低，對染料的降解率也較低，這一定程度上限制了該漆酶的應用。因此，提高漆酶的酶活力及其降解環(huán)境污染物的能力具有重要的意義，不僅可擴寬漆酶的工業(yè)應用范圍，而且可進一步深入研究其結構與功能之間的關系。

本研究首先對漆酶HIS-Lac1338的酶學性質進行研究，并且擬通過易錯PCR（error-prone PCR）的定向進化策略對該漆酶基因lac1338進行改造，以酶活力為篩選指標，以獲得漆酶活性提高的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 重組質粒 pUC118-lac1338（GenBank，登錄號HM623889）為本實驗室構建并保存，pET-32a（+）及Escherichia coli BL2l（DE3）為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒購于Omega；蛋白純化試劑盒購于德國Novagen公司；170 kD Prestained Protein Ladder購自廣州賽哲生物科技有限公司；2，2’-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）購于Amresco公司；IPTG、氨芐青霉素購自 TaKaRa 公司。突變試劑盒Diversify? PCR Random Mutagenesis Kit購自Clontech公司。其他常規(guī)試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 漆酶基因lac1338的克隆及重組質粒構建

1.2.1.1 lac1338的PCR擴增 根據lac1338的基因序列，使用 Premier 5 軟件設計引物對。lac1338-F：5'-CCG GAA TTC ATG CGC AAA AGT CCC GGA GTC ACT TTT TCA -3'（下劃線部分為BamH I酶切位點）；lac1338-R：5'-AGC AAG CTT TCA GTC GGG CAT GTT GGG GAT TTC AGG -3'（下劃線部分為Hind III酶切位點）。以提取的質粒pUC118-lac1338為模板，進行PCR擴增，反應條件：94℃ 30 s；94℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 9 s，共30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產物經普通PCR試劑盒回收。

1.2.1.2 lac1338 基因重組表達菌株的構建 使用限制性內切酶Hind III和BamHⅠ雙酶切PCR 產物，并連接到表達載體pET-32a（+）的Hind III和BamHⅠ位點上，轉化到E. coli BL21（DE3）。篩選陽性克隆進行酶切驗證，并送樣測序。

1.2.2 漆酶Lac1338的表達純化

1.2.2.1 漆酶基因lac1338在E. coli BL21 中的誘導表達 將重組質粒 pET-32a-lac1338轉化入E. coli BL2l（DE3）感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，37℃ 培養(yǎng)過夜。按1%的接種量接種于100 mL（含100 mg/L 氨芐青霉素）的LB 培養(yǎng)基中，置于37℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.8左右。加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG及0.5 mmol/L的Cu2+，置于30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。4℃、4 500 r/min離心15 min 收集菌體。冰浴進行超聲波破碎細胞（振幅設為 300 W；超聲循環(huán)為：超聲 5 s，間隔 5 s，時間設為 4 min）；4℃、12 000 r/min 離心 10 min，分別取上清和沉淀煮沸 5-10 min；4℃、12 000 r/min離心 10 min，進行 SDS-PAGE 電泳檢測（濃縮膠為5%，分離膠為 10%）。

1.2.2.2 漆酶Lac1338的純化 參見His·Bind?Purification Kit（Novagen）試劑盒說明書。

1.2.3 HIS-Lac1338的酶學性質研究

1.2.3.1 溫度對酶活力的影響 （1）最適溫度：取10 μL 一定濃度的純化后酶液，在35-80℃范圍內，每隔5℃測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。（2）溫度穩(wěn)定性：取一定量的純化后的酶液，分別于上述溫度孵育120 min，當溫度恢復到室溫時于55℃下測定酶活力，并計算其相對酶活，以4℃保存的酶液酶活為100%。

1.2.3.2 pH對酶活力的影響 （1）最適pH：取10 μL一定濃度的純化后酶液，分別于不同pH 的Britton-Robinson緩沖液中，55℃測定其酶活力，并計算其相對酶活，以酶活力最高者為100%。（2）pH 穩(wěn)定性：將酶液置于不同pH 的Britton-Robinson緩沖液下于室溫中放置4 h，隨后在最適pH，最適溫度條件下測定其酶活，以未處理的酶樣酶活為100%，計算其相對酶活。

1.2.3.3 金屬離子及有機物對酶活力的影響 （1）Cu2+對漆酶酶活的影響：在不同濃度的Cu2+離子存在條件下，測定漆酶的活性，并以酶活力最高者為100%，計算相對酶活。（2）其他金屬離子對酶活性的影響：在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）及1 mmol/L和100 mmol/L的金屬離子存在條件下，測定漆酶的活性，計算相對酶活。對照樣品為不含金屬離子的酶反應液。（3）幾種化合物對酶活性的影響：在1 mmol/L或100 mmol/L的所研究化合物存在條件下，測定漆酶的活性，并計算相對酶活。對照樣品為不含所研究化合物的酶反應液。

1.2.4 酶活力測定及蛋白質濃度測定

1.2.4.1 酶活力測定 以ABTS為底物，使3 mL 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的反應體系中含 5 mmol/L ABTS、6 mmol/L Cu2+和一定濃度的酶液樣品，將其混合均勻后于55℃水浴反應3 min，測OD405值，同時做不加酶液的空白對照。該條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。U=（0.1844×OD405）×V1×N/V2×t。y=0.1844x為ABTS自由基濃度與吸光度值的關系曲線［10］；V1：反應總體積；V2：測定酶活時所取的酶液體積；N：酶液稀釋倍數；t：反應時間。

1.2.4.2 蛋白濃度測定 以牛血清白蛋白（BSA）為標準，采用BCA法測定［11］。

1.2.5 lac1338的定向突變 以lac1338為模板，按照Diversify? PCR Random Mutagenesis Kit說明書進行易錯PCR，選擇2.3 bp/kb的突變率，反應體系：PCR Grade Water 39 μL，10× TITANIUM Taq Buffer 5μL，MnSO4（8 mmol/L）1 μL l，dGTP（2 mmol/L）1 μL，50× Diversify dNTP Mix 1 μL，Primer mix各1 μL，Template DNA（～1 ng/μL）1 μL，TITANIUM Taq Polym 1 μL。反應條件：94℃ 30 s；94℃ 30 s，68℃ 90 s，25個循環(huán)；72℃ 5 min。將易錯PCR產物克隆并構建到表達菌株E. coli BL21（DE3）中表達，篩選產酶量更高，所產酶更耐高溫、更耐堿、染料降解率更高的突變酶［12］。

1.2.6 HIS-Lac1338與Lac16對染料的降解比較 本研究考察HIS-Lac1338及突變酶Lac16對多種工業(yè)染料（莧菜紅、靛紅、溴酚藍、酸性紫7、結晶紫、橙紅G、剛果紅、羅丹明B、亞甲基藍及考馬斯亮藍G250）的降解作用。以不加酶液為空白對照，37℃搖床過夜（16 h），并同時考察Ca2+與小分子介體ABTS對降解率的影響。

降解率I=（A0-A1）A0×100%，其中，I：降解率；A0：空白對照染料的光吸收值；A1：反應體系樣品染料的光吸收值。

1.2.7 突變株三維結構模擬 在PHYRE2（http:// www.sbg.bio.ic.ac.uk/）中輸入目的蛋白的氨基酸序列，預測的結構及PDB文件便輸入郵箱。用Pymol軟件打開PDB文件，并標注突變位點。根據預測的結構信息，結合突變酶酶學性質與野生型酶對比，分析其位點突變效應。

2 結果

2.1 漆酶基因lac1338的克隆及表達菌株的構建

(5)食用纖維:纖維素有助于加速食物通過腸道,抑制糖類食物在腸道吸收,能夠有效降低餐后血糖,同時能夠加速腸蠕動,有利于大便通暢;另外,進食纖維素能夠增加飽食感,對控制體重有一定作用。糖尿病患者每日食用纖維攝入量應≥40g。粗糧、含纖維高的蔬菜,大豆及豆制品都糖尿病患者的理想配餐。

通過PCR 方法擴增出1 338 bp的lac1338 基因（圖1），將其成功連接到pET-32a上，重組質粒被命名為pET-32a（+）-lac1338上。將重組質粒轉化入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。隨機挑取9個轉化子進行菌液PCR初步驗證轉化是否成功。從圖2可以看出轉化子1、2、4、8和9菌液PCR成功，擴增出了目的條帶，可以初步認為菌落1、2、4、8和9轉化成功，提質粒酶切進一步驗證，如圖3。雙酶切得到1 338 bp左右和5 900 bp左右的兩條帶，分別是目的基因與空線性質粒pET-32a（+），證明目的基因已成功連接到表達載體上。選取連接正確的轉化子做下一步研究。

圖1 lac1338的PCR擴增產物的電泳分析

圖2 轉化子菌液PCR電泳分析

圖3 重組質粒pET-32a-lac1338的酶切驗證

2.2 漆酶Lac1338的表達及粗酶純化

SDS-PAGE分析（圖4）表明，經過IPTG誘導后的重組菌在低于30℃條件下有明顯的可溶性重組蛋白表達。粗酶液經His·Bind Purification Kit（Novagen）純化，產物進行SDS-PAGE檢測，見圖5。純化后的重組漆酶HIS-Lac1338為單一的條帶，分子量約為68 kD （其中18 kD為表達載體上的融合蛋白標簽），與理論預測蛋白分子量相同。用BCA法測得純化后的蛋白濃度為0.25 mg/mL。

圖4 重組漆酶HIS-Lac1338的最佳誘導培養(yǎng)溫度

圖5 純化后重組漆酶HIS-Lac1338的SDS-PAGE電泳

2.3 HIS-Lac1338的酶學性質研究

通過在35-80℃范圍內的酶活測定，HISLac1338的最適反應溫度為55℃（圖6），在35-55℃經 2 h處理，酶活仍保持50%以上；HISLac1338的最適pH為6.0，且在pH4-8之間經4 h的處理仍然保存50%以上的酶活（圖7）?？傮w來看，HIS-Lac1338有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，能夠在高溫下發(fā)揮相對高的酶催化活力。如圖8所示，隨著Cu2+濃度增加，酶活性不斷提高，當Cu2+濃度達到6.0 mmol/L時，酶活力最高；而當Cu2+濃度大于6.0 mmol/L時，酶活性不斷降低，呈一種不對稱的鐘形結構。由表1 可以看出，100 mmol/L的Ca2+、Na+和K+對其活性有著一定程度的激活作用；100 mmol/L 的Mn2+對其活性有80%以上的抑制作用，Co+、Fe2+、Hg+和Ag+對其活性完全抑制；而Mg2+在低濃度與高濃度對其活性影響都不大。由表2可知，100 mmol/L的EDTA及SDS對其活性完全抑制，高濃度與低濃度的尿素和DMSO的對其活性抑制作用差別不大。根據Michaelis-Menten 方程v= Vmax·［s］/Km +［s］的變形方程1/v= Km/Vmax·1/［s］+1/Vmax，通過雙倒數作圖法，測得反應的Km 和Vmax 分別為567 μmol/L 和2.8 mmol/（L·min·g）。

圖6 溫度對HIS-Lac1338的酶活力和熱穩(wěn)定性的影響（以ABTS為底物）

圖7 pH對HIS-Lac1338的酶活力和穩(wěn)定性的影響（以ABTS為底物）

圖8 Cu2+對HIS-Lac1338酶活性的影響（以ABTS為底物）

表1 不同金屬離子對HIS-Lac1338酶活性的影響

表2 不同化合物對HIS-Lac1338酶活性的影響

2.4 酶活力測定蛋白質濃度測定

根據ABTS自由基吸光度與濃度關系曲線，測出吸光度并計算得酶活力為5.7 U/mL。由BCA 法測得純化后蛋白濃度為0.25 mg/mL，所以比酶活為22.8 U/mg。

2.5 lac1338的定向突變

用電轉化方法獲得突變文庫后，用功能篩選法［13，14］獲得一株比野生型酶活提高1.6倍的菌株，命名為lac16，表達蛋白命名為Lac16。測序表明菌株lac16的堿基與野生型相比有3個堿基發(fā)生了突變，相應的氨基酸變化為：72位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔║UA-CUA），75位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔║UA-CUA），290位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔–AA-CGA）。

2.6 Lac16與HIS-Lac1338對染料的降解比較

HIS-Lac1338對6種染料的降解效果（圖 9）顯示，ac16與野生型相比，突變后對酸性紫7的降解率大大提高，由10.9%升高到90.5%；對溴酚藍的降解率也由20%升高到67.8%；對考馬斯亮藍的降解率由25%提高到85%；對莧菜紅的降解率由13.7%提高到14.5%；對剛果紅和靛紅的降解率無明顯改善?？梢娡ㄟ^易錯PCR技術獲得功能增強的突變酶是可行的。

圖9 野生型酶HIS-Lac1338和突變型漆酶Lac16對不同染料的降解情況比較

2.7 突變株三維結構模擬

將突變酶和野生型漆酶的氨基酸序列提交到phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/）蛋白質在線分析服務器，模擬其三維結構并用軟件pymol標出結構中的銅原子及突變氨基酸。結果（圖10）顯示，該酶以單亞基蛋白的形式存在，整個單體分子由3個杯狀（Cupredoxin-like）結構域（Domain 1、2、3）組成，相應的分成3區(qū)，每區(qū)均具有β -圓桶狀（由β -繩帶排成β-折頁形成所謂的希臘圖狀）拓撲構型。對比突變酶和野生型漆酶Lac1338的氨基酸序列，突變位點（圖中紫色所示）V278A、P310L和S315G距離漆酶的活性中心較遠，位于漆酶蛋白的表面或環(huán)狀區(qū)域，相應的堿基變化為GAU→GCU、CCG→CUG、AGC→GGC。

圖10 突變酶Lac16的三維結構模擬圖

3 討論

本研究中的lac1338是通過密碼子最佳化方法合成的，這一方法的最大優(yōu)點是可以使蛋白得到高水平表達，同時我們優(yōu)化了表達條件，使得該蛋白表達量為目前報道的最高表達量。通過定向進化得突變的Lac16漆酶蛋白。研究表明，突變酶較野生型酶HIS-Lac1338在對染料的降解種類及降解率上都有所改進，表明通過定向進化的方法獲取更具工業(yè)應用價值的突變酶是可行。利用某種生物的偏愛密碼子，避免利用率低的或稀有密碼子合成基因，進行基因的重新設計叫密碼子最佳化。散在分布的稀有密碼子對翻譯效率有負面效應，消除稀有密碼子、去除去穩(wěn)定序列、重新設計合成基因，都可能增加蛋白產量，使得蛋白生產更有效和經濟。本研究中的lac1338即利用密碼子最佳化方法合成而來，研究表明其表達量為目前已知的最高表達量，對其酶學性質及染料降解作用還需作進一步探索，并通過定向進化方法獲得染料降解率更高的突變酶。

酶的定向進化是指不需事先了解酶的空間結構和催化機制，而是人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對酶基因進行改造，并定向篩選、獲得具有某些預期特征的進化酶［15］。利用易錯PCR（Error prone PCR）或 DNA 改組（DNA shuffling）對酶分子編碼基因進行定向進化，可獲得催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性質，如穩(wěn)定性［16，17］、底物特異性［18］等，是蛋白質工程的重要研究工具。易錯PCR是指通過改變PCR的反應條件，如調整反應體系中4種dNTP的濃度、增加Mg2+的濃度、加入Mn2+或使用低保真度的Taq酶等，使堿基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變，構建突變庫，篩選出所需的突變體。

ABTS 等小分子介體不僅能增強漆酶對染料的降解效率，而且能介導漆酶和非酶底物染料之間的氧化作用，使得漆酶能降解非漆酶底物的染料［19］，例如偶氮類染料不是漆酶的底物，大部分的漆酶則不能直接降解此類染料［20］，但HIS-Lac1338在ABTS及Ca2+協(xié)同作用下能完全降解偶氮類染料羅丹明；對酸性紫7及莧菜紅降解率很小，對橙黃G無降解作用；在靛系染料中，只能降解靛紅，而不能降解靛藍，其原因可能是基團結構的差異性影響了漆酶HIS-Lac1338對其降解效果［21］。突變酶Lac16的突變位點都是同類性質氨基酸的替換，如第72氨基酸位點，由非極性氨基酸苯丙氨酸突變成非極性氨基酸亮氨酸；第290氨基酸位點，由極性氨基酸谷氨酰胺突變成精氨酸，這些位點有可能參與維持漆酶催化氧化所需的蛋白空間構像，而同類氨基酸的替換可維持該空間構像［22］，在接下來的工作中我們將結合該漆酶蛋白的三維結構及其生物信息學進一步探索突變堿基對其性質改變的原因。Miele等［23］通過定向進化提高糙皮側耳（P. ostreatus）漆酶POXA1b的酶活性，進而提高了該漆酶對酸性黃49、酸性紅266及直接黃106染料的降解率；Koschorreck等［24］研究發(fā)現，通過提高地衣芽胞桿菌（B. licheniformis）的漆酶CotA的酶活性，可增強該漆酶對茜素紅S、亮藍R和靛紅等染料的降解效果。

4 結論

本研究中，與野生型漆酶HIS-Lac1338相比，酶活力提高的突變酶Lac16對酸性紫7、考馬斯亮藍、溴酚藍和莧菜紅等染料的降解率也得到一定的提高，結果表明通 過易錯PCR的定向進化技術獲得的酶活力提高的突變酶，其對環(huán)境污染物的降解能力也會得到提高，所以下一步我們希望通過篩選酶活力更高的突變菌株，得到降解染料能力更強的菌株。

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（責任編輯 狄艷紅）

Determination of Enzymatic Properties of a Laccase Lac1338，and Effects of Directed Mutants on the Degradations of Different Dyes

ZHANG Xue-ling CHEN Xiao-li LI He
（Department of Biochemistry & Molecular Biology，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutial University，Guangzhou 510006）

In order to obtain the laccase with high expression and high thermal stability，a laccase gene lac1338 synthesized was cloned by codon optimization，ligated to the vector pET-32a（+），then expressed in Escherichia coli BL21（DE3），and the recombinant protein HIS-Lac1338 was obtained. Its enzymatic properties showed that while using ABTS as a substrate，the specific activity of HIS-Lac1338 was up to 22.8 U/mg，Km and Vmax of HIS-Lac1338 was 567 μmol/L and 2.8 mmol/（min·g protein），respectively. The optimal temperature and pH of HIS-Lac1338 were 55℃ and 6.0 respectively. Its activity remained 50% at 55℃ for 2 h and in the pH range of 4-8. HIS-Lac1338 was strongly resistant to Cu2+，while its activity was promoted by Ca2+，Na+，K+and inhibited by heavy metal ions such as Co2+，Fe2+，Hg2+，Ag+，etc. Comparing with HIS-Lac1338，mutant enzyme Lac16 of Lac1338 by sequential error-prone PCR improved the degradation rates of Acidviolet 7，Bromophenol blue，and Coomssie brilliant blue from 10.9%，20%，and 25% to 90.5%，67.8%，and 85%，respectively. Above results reveal that HIS-Lac1338 is stable to temperature and pH，the degradation rate of dye increases greatly with the mutant enzyme Lac16 via directed evolution of sequential error-prone PCR.

laccase；cloning and expression；enzymatic properties；directed evolution；degradation to dyes

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.025

2015-09-24

廣東省科技廳項目（2012B010300021，2013B010404044），廣東省教育廳項目（2013KJCX0107）

張雪玲，女，碩士研究生，研究方向：利用宏基因組學的方法篩選新型纖維素酶；E-mail：1095199175@qq.com

李荷，女，博士研究生，教授，研究方向：微生物分子生物學；E-mail：lihe32@163.com