單核細(xì)胞增生李斯特菌喹諾酮耐藥機(jī)制研究

姜曉冰于濤牛亞冰徐雅夢石磊王海磊

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；3. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；4. 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640）

單核細(xì)胞增生李斯特菌喹諾酮耐藥機(jī)制研究

姜曉冰1于濤2牛亞冰3徐雅夢1石磊4王海磊1

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；3. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；4. 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640）

以食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM）環(huán)丙沙星耐藥株為研究對象，旨在調(diào)查LM對喹諾酮產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。采用瓊脂二倍稀釋法測定菌株對環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度（MIC）；通過PCR檢測喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）基因突變以及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因的分布；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lde基因在LM菌株中的相對表達(dá)量；利用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建lde基因缺失突變株，調(diào)查外排泵Lde的作用。結(jié)果表明，15株LM耐藥菌株GyrA、GyrB、ParC和ParE亞基的氨基酸序列與敏感株100%相似；所有菌株中均未檢出PMQR基因。加入外排泵抑制劑利血平后，菌株L28和L47對環(huán)丙沙星的MIC值分別下降為原來的1/8和1/4。lde基因在耐藥株和敏感株中均有表達(dá)，且表達(dá)量相近；在環(huán)丙沙星的作用下，lde基因在耐藥株中的相對表達(dá)量增加顯著，而在敏感株中的表達(dá)量基本沒有變化；加入利血平后，lde在耐藥株中的表達(dá)明顯受到抑制。缺失lde基因后，菌株對環(huán)丙沙星由耐藥轉(zhuǎn)為敏感；利血平存在下突變株對環(huán)丙沙星的MIC值不受影響。本研究證明外排泵Lde介導(dǎo)LM對喹諾酮類藥物耐藥。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；喹諾酮；耐藥；外排泵

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種典型無芽孢細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌，是人畜共患傳染病李斯特菌?。↙isteriosis）的主要病原菌，常引起腦膜炎、敗血癥和單核細(xì)胞增多等癥狀。LM能在多種惡劣環(huán)境條件下生存和繁殖，導(dǎo)致食品在加工和運(yùn)輸過程中易受其污染，被世界衛(wèi)生組織列為僅次于大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌［1］。

喹諾酮類是由萘啶酸發(fā)展起來的全合成抗菌藥物，具有獨(dú)特的作用機(jī)制、優(yōu)秀的藥物動(dòng)力學(xué)性能和抗菌活性等特性，在臨床和獸醫(yī)上得到了廣泛的應(yīng)用。一直以來，喹諾酮類藥物并沒有被用于臨床治療李斯特菌病，但是由于此類藥物在臨床上的頻繁使用，間接的促進(jìn)了耐喹諾酮類LM的出現(xiàn)［2］。巢國祥等［3］對江蘇省8類食品中LM的調(diào)查結(jié)果顯示，菌株對諾氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為25.6%和9.3%。Yan等［4］對2005-2007年河北省食源性LM耐藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)17.8%的菌株對環(huán)丙沙星表現(xiàn)出耐藥性，耐藥率僅次于頭孢噻肟。

目前細(xì)菌對喹諾酮類的耐藥機(jī)制主要有3種：一是編碼DNA促旋酶（gyrA和gyrB編碼）和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV（parC和parE編碼）基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance-determining region，QRDR）發(fā)生突變，導(dǎo)致氨基酸置換使藥物不能與靶酶結(jié)合［5］。QRDR突變是細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的最主要原因［6］。Lampidis等［7］的研究表明，gyrA基因 QRDR的Ser84→Thr和Asp/Glu88→Phe突變可能導(dǎo)致LM對萘啶酸耐藥。二是主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)增強(qiáng)［8］。Godreuil等［2］研究發(fā)現(xiàn)LM菌株中主要易化子超家族（Major facilitator superfamily，MFS）外排泵Lde與LM對喹諾酮耐藥密切相關(guān)。三是質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥（Plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR）［9］。PMQR基因在腸桿菌科和弧菌科等革蘭氏陰性菌中分布廣泛，并且能夠通過基因水平轉(zhuǎn)移在不同種屬細(xì)菌間快速傳播［10］。

耐喹諾酮類LM菌株不斷檢出，但是目前關(guān)于LM對喹諾酮耐藥機(jī)制的研究卻很少。因此，本研究以分離自食品的15株環(huán)丙沙星耐藥株為研究對象，通過檢測QRDR基因突變、PMQR基因的分布以及外排泵Lde在LM喹諾酮耐藥中的作用，系統(tǒng)性調(diào)查LM對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，旨在為預(yù)防和控制LM耐藥菌株的出現(xiàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；穿梭質(zhì)粒pKSV7由中科院微生物研究所劉鋼教授和浙江大學(xué)方維煥教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；環(huán)丙沙星、氨芐西林和利血平購自Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶Xba I和Pst I均購自大連寶生物工程有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix（SYBR Green）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；T4連接酶購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 DH360型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器，金壇天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-16B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ETC811型基因擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；UNIVERSAL HOOD II凝膠成像分析系統(tǒng)、Chromo 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；Eporator電轉(zhuǎn)化儀，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂二倍稀釋法測定LM菌株對環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行判讀。

1.2.2 PCR擴(kuò)增QRDR及PMQR基因 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟提取LM菌株的基因組DNA作為擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增gyrA、gyrB、parC和parE基因所用引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)（表1）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后，采用DNAman軟件進(jìn)行序列拼接、核正和氨基酸序列的推導(dǎo)，并采用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，以確定QRDR靶基因突變情況。PMQR相關(guān)基因（qnrA、qnrB和qnrS）的引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

1.2.3 外排抑制實(shí)驗(yàn) 加入外排泵抑制劑利血平（終濃度為20 μg/mL，該濃度對細(xì)菌外排泵的抑制作用明顯同時(shí)又不影響細(xì)菌的正常生長［2，15，16］）后再檢測LM對環(huán)丙沙星的藥物敏感性，觀察MIC值的變化。加入利血平后MIC值下降4倍或4倍以上的菌株視為外排泵陽性菌株，初步判定這些菌株對環(huán)丙沙星的耐藥與外排泵有關(guān)。采用瓊脂二倍稀釋法檢測加入利血平前后LM突變株對環(huán)丙沙星的MIC值。

1.2.4 細(xì)菌總RNA提取 將LM菌株接種于BHI平板上37℃培養(yǎng)18 h，挑取生長良好的單個(gè)菌落至2 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。吸取該培養(yǎng)液0.2 mL至2 mL BHI培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)期。每個(gè)菌株分為3個(gè)試驗(yàn)組，第1組為不加任何抗生素（作為對照組），第2組為加入環(huán)丙沙星（濃度為0.4×MIC值）后再培養(yǎng)4 h，第3組是在第2組的培養(yǎng)物中加入利血平（20 μg/mL）后再培養(yǎng)4 h。細(xì)菌總RNA的提取按照細(xì)菌RNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行，測定RNA的濃度和純度后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用cDNA第一鏈合成試劑盒將mRNA合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank的基因序列設(shè)計(jì)靶基因lde和參照基因16S rRNA的引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中得到的第一鏈cDNA作為PCR反應(yīng)模板，使用RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸20 s，39個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCT法進(jìn)行目的基因表達(dá)量的分析。

1.2.6 lde基因缺失株的構(gòu)建與分子鑒定

1.2.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的lde基因及上下游同源臂序列，通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，選擇保守區(qū)域用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增上下游同源臂的特異性引物：上游同源臂的擴(kuò)增引物為LP1和LP2，全長525 bp；下游同源臂的擴(kuò)增引物為LP3和LP4，全長712 bp；重疊延伸PCR的引物為LP1和LP4，全長1 237 bp；檢測引物L(fēng)P5和LP6，全長1 852 bp。在LP1和LP4引物的5'端分別加酶切位點(diǎn)Xba I和Pst I及保護(hù)堿基，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.2.6.2 lde基因的缺失 以LM基因組DNA為模板，分別用LP1、LP2和LP3、LP4兩對引物擴(kuò)增lde基因的上下游同源臂，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后PCR產(chǎn)物純化回收。然后通過SOE-PCR技術(shù)融合上下游同源臂，采用25 μL反應(yīng)體系：純化的上下游同源臂各3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，水15.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸50 s，8個(gè)循環(huán)。再加入引物L(fēng)P1和LP4各1.5 μL及0.2 μL的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增融合片段的全長，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，采用10 μL反應(yīng)體系：pMD18-T載體1 μL，目的片段△lde 4 μL，Solution I 5 μL，4℃連接過夜；構(gòu)建缺失質(zhì)粒pMD18-T-Δlde，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含氨芐西林的LB培養(yǎng)基篩選，挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，用LP5和LP6引物對菌液PCR進(jìn)行鑒定，將陽性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.6.3 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlde的構(gòu)建 將測序正確的pMD18-T-Δlde質(zhì)粒與pKSV7用限制性內(nèi)切酶Xba I和Pst I同步雙酶切，采用20 μL反應(yīng)體系：Xba I和Pst I各1 μL，10×M buffer 2 μL，質(zhì)粒7 μL，水9 μL。37℃水浴鍋中放置4 h。將酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，用T4連接酶連接回收片段，采用10 μL反應(yīng)體系：pKSV7雙酶切產(chǎn)物3 μL，酶切后的lde基因缺失片段5 μL，T4連接酶1 μL，10× buffer 1 μL，16℃連接過夜［17］；構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlde，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證。

1.2.6.4 電轉(zhuǎn)化及L28-Δlde突變株的篩選與鑒定 采用青霉素G法制備LM感受態(tài)細(xì)胞［17］。取10 μL重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlde與100 μL LM感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴10 min后2.5 kV電擊5 ms，立刻加入900 μL BHI液體培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)2 h。將菌液均勻涂布于含氯霉素（15 μg/mL）的BHI平板上，30℃培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)菌落接種至含氯霉素（15 μg/mL）的BHI液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h，用LP5和LP6引物對進(jìn)行菌液PCR篩選鑒定陽性克隆。將鑒定得到的陽性克隆接種至含氯霉素（15 μg/mL）的BHI液體培養(yǎng)基中42℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)15代左右，再將重組菌接種至不含氯霉素的BHI液體培養(yǎng)基中42℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)15代左右，通過菌液PCR檢測缺失條帶穩(wěn)定存在，最終得到LM-Δlde突變株。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

LM菌株對環(huán)丙沙星的藥物敏感性結(jié)果，見表2。3株敏感菌株對環(huán)丙沙星的MIC值為0.5-1 μg/mL；15株耐藥菌株對環(huán)丙沙星的MIC值為4-16 μg/mL。

表2 加入利血平前后LM菌株對環(huán)丙沙星的MIC值

加入外排泵抑制劑利血平后，3株敏感菌株對環(huán)丙沙星的MIC值不變；15株耐藥菌株中，3株對環(huán)丙沙星的MIC值沒有變化，10株對環(huán)丙沙星的MIC值降為原來的1/2，1株降為原來的1/4，1株降為原來的1/8。

2.2 QRDR基因突變檢測結(jié)果

經(jīng)過DNA序列比對，11株環(huán)丙沙星耐藥菌株的gyrA、gyrB和parE基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列100%相似，沒有發(fā)生堿基變化。11株環(huán)丙沙星耐藥菌株中有2株（L28和L45）的parC基因序列在第351位發(fā)生堿基變化（T→A），但是該堿基突變并未引起氨基酸序列變化。

2.3 PMQR基因檢測結(jié)果

18株LM菌株中未檢出PMQR基因（圖1）。

圖1 PMQR基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lde基因的相對表達(dá)量

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測lde基因在LM菌株中的表達(dá)量，結(jié)果見表3。L28和L47代表外排泵陽性菌株；L31和L45代表環(huán)丙沙星MIC值沒有受到利血平影響的菌株；L69代表環(huán)丙沙星敏感菌株。結(jié)果顯示，lde基因在耐藥株和敏感株中均有表達(dá)，且表達(dá)量相近。在環(huán)丙沙星的作用下，lde基因在L28和L47中的相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），分別為4.17倍和3.93倍，表明該基因的表達(dá)可能受到環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)；lde基因在L31、L45和L69中的相對表達(dá)量沒有明顯變化（P＞0.05），分別為1.05倍、1.88倍和1.04倍。加入利血平后，lde基因在 L28和L47中的相對表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），分別為1.04倍和0.72倍，表明lde基因的表達(dá)受到利血平的抑制；lde基因在L31和L45中的相對表達(dá)量沒有明顯變化（P＞0.05）。

表3 lde基因在LM菌株中的相對表達(dá)量

圖2 SOE-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 lde基因缺失株的構(gòu)建與分子鑒定

2.5.1 SOE-PCR擴(kuò)增結(jié)果 以L28的基因組DNA為模板，分別用LP1、LP2和LP3、LP4兩對引物擴(kuò)增lde基因的上、下游同源臂，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到與預(yù)期相符的目的條帶（圖2）。通過SOE-PCR將上游同源臂和下游同源臂連接在一起，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到長為1 237 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。目的片段切膠回收后經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)缺失一段長為1 357 bp的序列，表明lde基因已成功缺失。

2.5.2 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlde的構(gòu)建及鑒定結(jié)果 將測序正確的pMD18-T-Δlde質(zhì)粒與pKSV7經(jīng)Xba I、Pst I同步雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到與預(yù)期值相符的目的條帶（圖3）?；厥漳康钠?，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，菌液PCR得到預(yù)期大小的目的條帶。雙酶切鑒定得到6 900 bp和1 237 bp兩個(gè)條帶，表明重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlde構(gòu)建成功。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

2.5.3 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及遺傳穩(wěn)定性鑒定 電轉(zhuǎn)后，用LP5和LP6引物進(jìn)行菌液PCR檢測，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子在含氯霉素的BHI培養(yǎng)基中42℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)15代左右得到單交換菌株，依然具有氯霉素抗性；在不含氯霉素的BH培養(yǎng)基中42℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)15代左右后得到雙交換缺失株，失去氯霉素抗性，菌液PCR擴(kuò)增只有一條495 bp的片段（圖3）。測序結(jié)果表明已成功缺失lde基因，獲得L28-Δlde突變株。無氯霉素37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)20代的過程中，每一代菌株均只能擴(kuò)增出一條495 bp的片段，表明L28-Δlde具有遺傳穩(wěn)定性。

2.6 L28-Δlde對環(huán)丙沙星的MIC值

LM野生株L28對環(huán)丙沙星的MIC值為16 μg/mL。突變株L28-Δlde對環(huán)丙沙星的MIC值為1 μg/mL；加入利血平后，L28-Δlde對環(huán)丙沙星的MIC值沒有發(fā)生變化，仍為1 μg/mL。

3 討論

本研究的試驗(yàn)菌株為15株食源性LM環(huán)丙沙星耐藥菌株，通過研究這些菌株中QRDR基因突變、PMQR基因的分布以及外排泵的作用，旨在闡明LM對喹諾酮產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。靶基因DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的突變是細(xì)菌對喹諾酮類藥物最重要的耐藥機(jī)制。已有報(bào)道顯示gyrA基因的 QRDR突變可能與LM對萘啶酸耐藥有關(guān)［7］。本研究中15株LM耐藥菌株GyrA、GyrB、ParC和ParE亞基的氨基酸序列與敏感株100%相似，表明在這些菌株中不存在靶酶基因突變。此外，PCR檢測結(jié)果顯示在LM耐藥菌株中未檢出PMQR基因。結(jié)合以上兩點(diǎn)可初步推斷，LM對喹諾酮耐藥可能由外排泵介導(dǎo)。

外排泵是細(xì)菌的一種自我保護(hù)機(jī)制，在細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在，能夠除去細(xì)菌細(xì)胞和胞膜中的有害物質(zhì)［18］。一些外排泵可以把抗生素、消毒劑、重金屬等作為底物排出菌體外使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。外排泵的失活能夠?qū)е录?xì)菌對藥物從耐藥轉(zhuǎn)為敏感；相反，由于外排泵表達(dá)調(diào)控蛋白的改變或是基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)能夠引起外排泵基因轉(zhuǎn)錄水平提高，導(dǎo)致外排泵表達(dá)量增加，繼而產(chǎn)生耐藥［19］。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.membranetransport.org/）的信息顯示，LM EGDe中可能存在超過200個(gè)外排系統(tǒng)。目前研究者已發(fā)現(xiàn)Lde外排泵可能與LM對喹諾酮耐藥有關(guān)［2，20］。由lde基因編碼的多重耐藥外排泵Lde屬于細(xì)菌外排系統(tǒng)中常見的MFS型，是一種自足型多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可利用質(zhì)子偶聯(lián)交換產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力外排多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的底物，從而降低細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)物質(zhì)的濃度。Lde蛋白由402個(gè)氨基酸分子組成，其結(jié)構(gòu)包含12個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)信號肽，與枯草芽孢桿菌的Bmr，金黃色葡萄球菌的NorA，肺炎鏈球菌的PmrA和糞腸球菌的EmeA分別具有25%、24%、29%和44%的相似性。

利血平是一種具有降血壓活性的小分子生物堿，對MFS類外排泵有較好的抑制作用。外排泵抑制試驗(yàn)表明，加入利血平后大多數(shù)LM耐藥菌株對環(huán)丙沙星的MIC值降低，其中L28和L47對環(huán)丙沙星的MIC值分別下降為原來的1/8和1/4，表明在這兩株菌中外排泵是介導(dǎo)菌株對環(huán)丙沙星耐藥的主要原因。在利血平的作用下，其余13株耐藥菌株對環(huán)丙沙星的MIC值下降不明顯甚至沒有發(fā)生變化，可能是由于在這些菌株中外排泵對環(huán)丙沙星耐藥貢獻(xiàn)不大或者沒有貢獻(xiàn)，也可能是外排泵的活性沒有受到利血平的抑制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lde基因在LM菌株中的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，該基因在耐藥株和敏感株中均有表達(dá)，且表達(dá)量相近；在環(huán)丙沙星的作用下，lde基因在耐藥株中的相對表達(dá)量增加顯著，而在敏感株中的表達(dá)量基本沒有變化；隨后加入利血平，可觀察到lde基因在耐藥株中的表達(dá)明顯受到抑制。根據(jù)這些結(jié)果可初步推斷外排泵Lde可能參與LM對環(huán)丙沙星耐藥。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的推斷，明確外排泵Lde在LM對喹諾酮耐藥中的作用，本研究利用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建lde基因缺失突變株。藥敏結(jié)果顯示，突變株對環(huán)丙沙星表現(xiàn)敏感；利血平存在下突變株對環(huán)丙沙星的MIC值不受影響。由此可進(jìn)一步證明外排泵Lde介導(dǎo)LM對喹諾酮類藥物耐藥。

4 結(jié)論

本研究以分離自食品的15株環(huán)丙沙星耐藥株為研究對象，系統(tǒng)性調(diào)查LM對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。結(jié)果表明，LM耐藥菌株的GyrA、GyrB、ParC和ParE亞基沒有發(fā)生氨基酸突變；在這些菌株中也沒有檢出PMQR基因。外排泵抑制試驗(yàn)表明，LM對環(huán)丙沙星耐藥可能與外排泵有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明外排泵Lde可能參與LM對環(huán)丙沙星耐藥。通過構(gòu)建lde基因缺失突變株，并檢測突變株對環(huán)丙沙星的MIC值，證明外排泵Lde介導(dǎo)LM對喹諾酮類藥物耐藥。

［1］羅勤, 張曉莉, 李兵, 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌PrfA蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控毒力基因表達(dá)的分子機(jī)制［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35（2）：275-280.

［2］Godreuil S, Galimand M, Gerbaud G, et al. Efflux pump Lde is associated with fluoroquinolone resistance in Listeria monocytogenes［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47（2）：704-708.

［3］巢國祥, 焦新安, 徐勤, 等. 8類食品單核細(xì)胞增生李斯特菌流行特征及耐藥性狀研究［J］. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15（5）：519-521.

［4］Yan H, Neogi SB, Mo Z, et al. Prevalence and characterization of antimicrobial resistance of foodborne Listeria monocytogenes isolates in Hebei province of Northern China, 2005-2007［J］. International Journal of Food Microbiology, 2010, 144（2）：310-316.

［5］Everett MJ, Jin YF, Ricci V, et al. Contributions of individual mechanisms to fluoroquinolone resistance in 36 Escherichia coli strains isolated from humans and animals［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1996, 40（10）：2380-2386

［6］Friedman SM, Lu T, Drlica K. Mutation in the DNA gyrase A gene of Escherichia coli that expands the quinolone resistance-determining region［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45（8）：2378-2380.

［7］Lampidis R, Kostrewa D, Hof H. Molecular characterization of the genes encoding DNA gyrase and topoisomerase IV of Listeria monocytogenes［J］. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 49（6）：917-924.

［8］Ruiz J. Mechanisms of resistance to quinolones：target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection［J］. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 51（5）：1109-1117

［9］Hernández A, Sánchez MB, Martínez JL. Quinolone resistance：much more than predicted［J］. Frontiers in Microbiology, 2011, 2：22.

［10］姜曉冰. 大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥機(jī)制研究［D］. 廣州：華南理工大學(xué), 2013.

［11］CLSI, 2012. Performance standards for antimicrobial susceptibility Testing CLSI Document M100-S21. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA

［12］Wang M, Tran JH, Jacoby GA, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai, China［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47（7）：2242-2248.

［13］Jacoby GA, Walsh KE, Mills DM, et al. qnrB, another plasmidmediated gene for quinolone resistance［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50（4）：1178-1182.

［14］Jiang Y, Zhou Z, Qian Y, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac（6’）-Ib-cr in extendedspectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in China［J］. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2008, 61（5）：1003-1006.

［15］Markham PN, Westhaus E, Klyachko K, et al. Multiple novel inhibitors of the NorA multidrug transporter of Staphylococcus aureus［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1999, 43（10）：2404-2408.

［16］鄺小佳, 蔡杏珊, 張宇青, 等. 利血平對耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床株的作用［J］. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 8（2）：128-129.

［17］彭葉龍, 喬軍, 孟慶玲, 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的構(gòu)建研究［J］. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 32（2）：148-152.

［18］Piddock LJV. Multidrug-resistance efflux pumps? not just for resistance［J］. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4：629-636.

［19］Poole K. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gramnegative bacteria［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44（9）：2233-2241.

［20］Jiang X, Zhou L, Gao D, et al. Expression of efflux pump gene lde in ciprofloxacin-resistant foodborne isolates of Listeria monocytogenes［J］. Microbiology and Immunology, 2012, 56（12）：843-846.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Study on the Quinolone-resistant Mechanisms of Listeria monocytogenes

JIANG Xiao-bing1YU Tao2NIU Ya-bing3XU Ya-meng1SHI Lei4WANG Hai-lei1
（1. College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007；2. College of Life Science and Technology，Xinxiang University，Xinxiang 453000；3. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；4. College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640）

Using ciprofloxacin-resistant strains of Listeria monocytogenes（LM）isolated from food as research object，this study aims to understand the quinolone-resistant mechanisms of LM. The minimum inhibitory concentration（MIC）of ciprofloxacin by the strain was determined by the agar dilution method. The mutations in the quinolone resistance-determining region（QRDR）and the presence of plasmidmediated quinolone resistance（PMQR）genes were investigated using PCR. Expression levels of lde gene under different conditions were detected by qRT-PCR. To address the role of efflux pump Lde in ciprofloxacin resistance，deletion mutant in lde was constructed using SOEPCR. Results showed that the amino acid sequences of GyrA，GyrB，ParC，and ParE in 15 resistant strains showed 100% similarity with the sequences of sensitive strains，and no PMQR genes were detected in any of the resistant strains. In the presence of reserpine，an efflux pump inhibitor，the MICs of ciprofloxacin by strain L28 and L47 reduced to the 1/8 and 1/4 of original one. The expression of lde was observed in all sensitive and resistant strains by similar values. After treatment with ciprofloxacin，the resistant strains showed significant increases in lde，however，no obvious changes in expression of lde were observed in the sensitive strains. In the presence of reserpine，the expression of lde significantly inhibited in resistant strains. The mutant lacking the lde gene was susceptible to ciprofloxacin and its MIC of ciprofloxacin did not change in the presence of reserpine. Our data demonstrated that efflux pump Lde mediated quinolone resistance in L. monocytogenes.

Listeria monocytogenes；quinolone；antimicrobial resistance；efflux pump

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.033

2015-10-08

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180006），河南師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)費(fèi)支持課題，河南師范大學(xué)青年科學(xué)基金資助

姜曉冰，女，講師，研究方向：食品微生物污染與控制；E-mail：jxb841001@163.com

于濤，男，講師，研究方向：食品微生物污染與控制；E-mail：yutao7777@hotmail.com