紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及表達(dá)分析

韓怡來崔琪武云云顧天瑤滕孝花胡人閣吳貫達(dá)官麗莉，李海燕，李校堃

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；3. 通化市第一中學(xué)，通化 134000）

紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及表達(dá)分析

韓怡來1崔琪1武云云1顧天瑤1滕孝花3胡人閣1吳貫達(dá)1官麗莉1，2李海燕1，2李校堃2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；3. 通化市第一中學(xué)，通化 134000）

克隆紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（Lipid transfer protein，LTP），并進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)分析，旨為研究LTP在紅花抵抗逆境脅迫中的作用提供依據(jù)。通過RT-PCR方法從紅花種子中克隆LTP基因序列，通過生物信息學(xué)對該基因蛋白的特征進(jìn)行分析，構(gòu)建LTP與相關(guān)物種LTP的系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用Real-time PCR方法分析在紅花不同號組織中LTP基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，LTP基因ORF全長294 bp，編碼97個(gè)氨基酸，相對分子量為7.46 kD，等電點(diǎn)為8.91。紅花LTP蛋白包含一個(gè)長為29個(gè)氨基酸殘基的信號肽序列；該蛋白含有一個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白是由3個(gè)α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角簡單的纏繞在無規(guī)則卷曲上的簡單結(jié)構(gòu)。分子進(jìn)化表明，紅花LTP基因與十字花科的甘藍(lán)型油菜進(jìn)化關(guān)系最近。通過熒光定量PCR對紅花LTP基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明CtLTP在不同組織的表達(dá)水平具有顯著差異，在種子和花中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)。

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；紅花；熒光定量PCR；生物信息學(xué)分析

植物非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Non-specific lipid transfer protein，nsLTP）是一類胞外分泌性蛋白，分子量約為9 kD的堿性小分子蛋白［1］。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同物種之間的同源性較低，但均存在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的明顯特征。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)多基因家族蛋白，如在擬南芥中已分離到100多個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在辣椒中已經(jīng)分離出6個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，而在水稻全基因組測序后發(fā)現(xiàn)了53個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，同時(shí)同一物種中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)具有較強(qiáng)的發(fā)育和組織特異性［2，3］。

LTP 蛋白主要存在于植物地上器官的表皮組織中，許多研究表明，不同的nsLTP基因表達(dá)對生物脅迫及非生物脅迫產(chǎn)生不同響應(yīng)［4］。國內(nèi)外對水稻、菠菜、玉米、花椰菜、綠豆和擬南芥等多種植物的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已有較深入的研究，具備多種復(fù)雜的生物學(xué)功能，主要包括脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、角質(zhì)層蠟質(zhì)合成［5，6］，低溫［7-10］、高溫［9，11］或重金屬［12］和病原菌侵害［13］，另外，在花藥和花粉發(fā)育［14，15］、干旱和鹽［16-19］的脅迫過程中也發(fā)揮重要作用。例如，小麥TaLTP1的表達(dá)受PEG、NaCl、H2O2、傷害脅迫誘導(dǎo)［20］，芝麻SiLTP2與SiLTP4受NaCl、甘露醇誘導(dǎo)［16］，臘梅nsLTP基因響應(yīng)低溫脅迫其表達(dá)增高［21］，這些結(jié)果表明，nsLTP在植物對非生物脅迫和生物脅迫的反應(yīng)過程中可能起著重要作用，但關(guān)于這些基因的具體生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科、紅花屬植物，對高溫干旱逆境具有較強(qiáng)的耐性，種子耐儲藏，是一種藥食兩用的經(jīng)濟(jì)作物。本課題前期已開展紅花種子、花、葉的轉(zhuǎn)錄組測序分析（SRA0472-79.2）及紅花功能基因的研究［22］，在此基礎(chǔ)上本研究克隆1個(gè)紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和不同器官中的表達(dá)特性檢測，旨在為深入研究CtLTP基因的功能，揭示脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在紅花抵抗逆境脅迫中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種植基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)胡全德教授鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）。取紅花種子、花、莖、葉、根、胚軸和子葉迅速放于液氮，錫箔紙包好于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 取紅花各組織置于液氮中研碎，總RNA提取方法按照Trizol試劑說明書進(jìn)行，提取后進(jìn)行純度及濃度測定；于-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成根據(jù)Biotek公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分離純化后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅花LTP基因ORF片段的克隆 根據(jù)Solexa測序獲得的紅花轉(zhuǎn)錄組序列中功能注釋為植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Unigene23752，利用NCBI 網(wǎng)站（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的ORF finder 軟件對開放閱讀框進(jìn)行分析，確定起始密碼子及終止密碼子。按照引物設(shè)計(jì)原則，采用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer5.0，對紅花轉(zhuǎn)錄組序列中的1個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物（LPT-F和LPT-R）（表1）。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min，4℃終止反應(yīng)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pEASY-T1載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選后，挑取白色菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR、雙酶切（EcoRⅤ和Hind Ⅲ）鑒定重組子，然后測序（由生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 ORF Finder在線軟件分析紅花LTP基因相應(yīng)的氨基酸序列。將獲得的紅花LTP基因ORF序列通過BLAST搜索NCBI的蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫，并通過DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對來源于各種植物的LTP的相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行同源比對。相對分子質(zhì)量與理論等電點(diǎn)（pI）預(yù)測采用ExPASy在線服務(wù)器的Compute Pi/Mw 工具，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用 Dublin大學(xué)的Porter 服務(wù)器，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用Swiss-Model服務(wù)器，結(jié)構(gòu)功能域分析采用ExPASy在線務(wù)器Prosite Scanprosite。利用 SignalP4.1Server（http:// www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對紅花LTP進(jìn)行信號肽預(yù)測。利用TMHMM Server v. 2.0在線軟件進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測。利用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等。

1.2.4 紅花LTP基因的組織表達(dá)差異分析 取紅花種子、花、莖、葉、根提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于Real-time PCR分析。定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游引物（表1）各0.4 μL；ROX Reference Dye II（50×）；DNA模板2 μL；ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 擴(kuò)增紅花LTP基因及qRT-PCR所用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 紅花總RNA的提取及檢測

從吉紅1號種子中提取總RNA，凝膠電泳檢測結(jié)果（圖 1）顯示，28S rRNA和18S rRNA 條帶清晰，說明所提取的RNA完整性較好；經(jīng)核酸蛋白檢測儀測得A260/A280=1.93，A260/A230=1.98，表明RNA純度較高，可用于RT-PCR 擴(kuò)增。

圖1 紅花種子總RNA電泳圖

2.2 紅花LTP基因ORF片段的克隆

根據(jù)CtLTP 基因編碼區(qū)序列特異引物（LTP-F，LTP-R），以紅花種子cDNA為模板擴(kuò)增出一條294 bp的條帶（圖2-A）。經(jīng)回收純化后，PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，通過菌液PCR驗(yàn)證（圖2-B）和質(zhì)粒的 EcoRⅤ和Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證（圖2-C），測序結(jié)果正確，命名該基因?yàn)镃tLTP（GenBank 登錄號為KT692604）。

圖2 紅花LTP基因的克隆

2.3 紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列分析

將推導(dǎo)出的紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP氨基酸序列利用SignalP4.1軟件進(jìn)行信號肽分析，發(fā)現(xiàn)CtLTP1蛋白氨基端的前29個(gè)氨基酸為信號肽序列，屬于分泌蛋白。用推測的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比較，發(fā)現(xiàn)CtLTP屬于LTP蛋白家族（lipid-transfer protein family）。TMHMM Server v. 2.0軟件分析結(jié)果表明CtLTP1蛋白是一個(gè)跨膜蛋白，位于7-29處存在一個(gè)跨膜區(qū)，N端位于膜內(nèi)，C端位于膜外。

利用ProtParam 軟件對去除信號肽的紅花LTP成熟蛋白進(jìn)行基本特性分析，結(jié)果顯示CtLTP1含有原子總數(shù)為1 029，分子式為C316H513N97O94S9，其分子量為7 463.6 Da，理論等電點(diǎn)為8.91。

用DictyOGlyc在線工具對蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)P值大于0.5即為存在糖基化位點(diǎn)為評分標(biāo)準(zhǔn)，LTP蛋白僅存在1個(gè)糖基化位點(diǎn)，是位于第46位的絲氨酸（Ser）。這些修飾可能與LTP蛋白的生物學(xué)功能密切相關(guān)。

采用 SWISS-MODELSOPMA 進(jìn)行LTP的編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明LTP蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（Alpha helix，39.18）、延伸鏈（Extended strand，10.31）、無規(guī)則卷曲（Random coil，40.21）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，10.31）組成。

在SWISS-MODEL依據(jù)保守結(jié)構(gòu)域作圖工具中，對CtLTP編碼蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果（圖3）顯示，CtLTP編碼蛋白是由3個(gè)α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角簡單的纏繞在無規(guī)則卷曲上的簡單結(jié)構(gòu)。

圖3 LTP蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.4 同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

紅花LTP蛋白氨基酸序列與其他植物L(fēng)TP蛋白進(jìn)行比對，結(jié)果顯示在植物L(fēng)TP中一些保守的氨基酸在紅花中同樣存在，但只有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基。利用DNAMAN軟件對紅花LTP進(jìn)行同源性分析顯示，與其他物種比較CtLTP蛋白與甘藍(lán)型油菜一致性最高，為47.42%。結(jié)果表明，CtLTP是一個(gè)新的紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

為了進(jìn)一步了解CtLTP蛋白與其他物種LTP蛋白間的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA5.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。通過與14種植物的LTP氨基酸聚類分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在煙草、野生大豆、甘藍(lán)型油菜、擬南芥等植物中均以多種形式存在，且序列差異較大，在系統(tǒng)進(jìn)化樹分散在遺傳距離較遠(yuǎn)的分支上。紅花LTP蛋白與擬南芥、野生大豆、油橄欖、千里光以及苜蓿同屬于一個(gè)分支。

圖4 紅花LTP與其他物種LTP的聚類分析

2.5 紅花LTP基因的組織差異表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測CtLTP基因在不同組織中的相對表達(dá)量。組織差異表達(dá)可為研究基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)選取紅花的種子、花、莖、葉、根、胚軸和子葉7個(gè)組織對紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了組織差異表達(dá)分析。圖5顯示，CtLTP在不同組織的表達(dá)水平具有顯著差異，在種子和花中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)。

3 討論

紅花在食品、藥品領(lǐng)域起著重要作用，是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。紅花病害的發(fā)生和流行一直是影響紅花黃色素及紅花油產(chǎn)量的重要因素，特別是根腐病、銹病等病害嚴(yán)重影響了紅花的產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，通過生物技術(shù)手段提高紅花品種的抗性，確保紅花食品、藥品的安全是十分必要的。

圖5 紅花LTP基因的組織表達(dá)分析

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中普遍存在，目前已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物的很多器官和組織中發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中以在擬南芥、水稻、玉米、小麥、棉花、辣椒、以及番茄等作物中研究較為深入。本研究根據(jù)紅花轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆到1個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CtLTP，其編碼的蛋白屬于Nonspecific lipid-transfer proteinⅡ（nsLTP2） 亞 家 族，其具有 LTP蛋白的理化性質(zhì)，包括8個(gè)保守的半胱氨酸殘基、堿性等電點(diǎn)、低分子量以及N端典型信號肽結(jié)構(gòu)等［24］。通過對13種植物與克隆得到的紅花LTP氨基酸序列進(jìn)行多重比對發(fā)現(xiàn)，他們的同源性差異較大，說明LTP蛋白的一級結(jié)構(gòu)在不同物種間存在差異，具有多態(tài)性。LTP能被病原菌誘導(dǎo)而高水平表達(dá)，并能抑制病原菌的生長和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生［25］。擬南芥LTP3作為一個(gè)新的負(fù)調(diào)控因子，通過調(diào)控ABA-SA的平衡參與植物免疫［26］。過量表達(dá)LTPs基因也能提高轉(zhuǎn)基因作物對病原菌的抗性，能夠增強(qiáng)作物的抗病和適應(yīng)不良環(huán)境的能力；小麥TdLTP4基因在擬南芥中過表達(dá)能夠提高其抗旱和抗鹽能力，同時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片表現(xiàn)出增強(qiáng)對交鏈孢菌和灰葡萄孢真菌性［27］；小麥TdLTP3能夠增強(qiáng)擬南芥抗旱性及氧化應(yīng)激能力［28］；超表達(dá)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AZI能夠增強(qiáng)植物對鹽的耐受性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明其通過與有絲分裂原活化的蛋白激酶MPK3相互結(jié)合發(fā)揮作用［29］；轉(zhuǎn)LTP基因甘藍(lán)型油菜對菌核病的抗病性增強(qiáng)［30］。因此，通過基因工程的手段過量表達(dá)LTPs基因培育作物抗逆新品種，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究克隆到1個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CtLTP基因，并主要在紅花種子及花瓣中表達(dá)，具有顯著的組織表達(dá)特異性，為進(jìn)一步利用紅花的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP提高紅花的抗性研究奠定基礎(chǔ)，以推動(dòng)紅花轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程。下一步實(shí)驗(yàn)會將CtLTP基因構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到植物中進(jìn)行表達(dá)及功能驗(yàn)證，期望獲得抗病抗逆能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物；同時(shí)，亦可構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得純化的LTP蛋白，在體外驗(yàn)證該蛋白的功能。

4 結(jié)論

本研究成功克隆1個(gè)紅花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP基因cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果表明，紅花LTP基因在不同組織的表達(dá)水平具有顯著性差異，在種子和花瓣中較高，而在其他組織中表達(dá)量較低。

［1］田愛梅, 曹家樹. 植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白［J］. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008, 30（4）：483-488.

［2］李長生, 趙傳志, 李愛芹, 等. 植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009（8）：13-17.

［3］Guo L, Yang HB, Zhang XY, et al. Lipid transfer protein 3 as a target of MYB96 mediates freezing and drought stress in Arabidopsis［J］. J Exp Bot, 2013, 64（6）：1755-1767.

［4］Jang CS, Kim DS, Bu SY, et al. Isolation and characterization of lipid transfer protein（LTP）genes from a wheat-rye trans-location line［J］. Plant Cell Rep, 2002, 20（10）：961-966.

［5］Debono A, Yeats TH, Rose J K, et al. Arabidopsis LTPG is aglycosyl phosphatidylinositol-anchored lipid transfer protein required for export of lipids to the plant surface［J］. Plant Cell, 2009, 21：1230-1238.

［6］Cameron KD, Teece MA, Smart LB. Increased accumulation of cuticular wax and expression of lipid transfer protein in response to periodic drying events in leaves of tree tobacco［J］. Plant Physiol, 2006, 140：176-183.

［7］Gaudet DA, Laroche A, Frick M, et al. Cold induced expression of plant defensin and lipid transfer protein transcripts in winterwheat［J］. Physiol Plantarum, 2003, 117（2）：195-205.

［8］Yubero SEM, Moyano E, Medina EN, et al. Identification of a straw- berry gene encoding a non-specific lipid transfer protein that responds to ABA, wounding and cold stress［J］. J Exp Bot, 2003, 54（389）：1865-1877.

［9］Wu GH, Robertson AJ, Liu XJ, et al. A lipid transfer protein gene BG-14 is differentially regulated by abiotic stress, ABA, anisomycin, and sphingosine in bromegrass（Bromus inermis）［J］. J Plant Physiol, 2004, 161（4）：449-458.

［10］Hwang EW, Kim KA, Park SC, et al. Expression profiles of hot pepper（Capsicum annuum）genes under cold stress conditions［J］. J Biosci, 2005, 30（5）：657-667.

［11］Oshino T, Abiko M, Saito R, et al. Premature progression of anther early developmental programs accompanied by comprehensive alterations in transcription during high- temperature injury in barley plants［J］. Mol Genet Genomics, 2007, 278（1）：31-42.

［12］Gorjanovi? S, Su?njevi? D, Beljanski M, et al. Barley lipid-transfer protein as heavy metal scavenger［J］. Environ Chem Lett, 2004, 2（3）：113-116.

［13］Maldonado AM, Doerner P, Dixon RA, et al. A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis［J］. Nature, 2002, 419：399-403.

［14］Zhang D, Liang W, Yin C, et al. OsC6, encoding a lipid transfer protein, is required for postmeiotic anther development in ricer［J］. Plant Physiol, 2010, 154：149-162.

［15］Liu X, Shangguan Y, Zhu J, et al. The rice OsLTP6 gene promoter directs anther-specific expression by a combination of positive and negative regulatory elements［J］. Planta, 2013, 238：845-857.

［16］Choi AM, Lee SB, Cho SH, et al. Isolation and characterization of multiple abundant lipid transfer protein isoforms in developing sesame（Sesamum indicum L. ）seeds［J］. Plant Physiol Biochem, 2008, 46（2）：127-139.

［17］Liu KH, Lin TY. Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate［J］. DNA Seq, 2003, 14（6）：420-426.

［18］Jung HW, Kim KD, Hwang BK. Identification of pathogenresponsive regions in the promoter of a pepper lipid transfer protein gene（CALTPI）and the enhanced resistance of the CALTPI transgenic Arabidopsis against pathogen and environmental stresses［J］. Planta, 2005, 221（1）：361-373.

［19］Gonorazky AG, Regente MC, de la Canal L. Stress induction and antimicrobial properties of a lipid transfer protein in germinating sunflower seeds［J］. J Plant Physiol, 2005, 162（6）：618-624.

［20］Jang CS, Lee HJ, Chang SJ, et al. Expression and promoter analysis of the TaLTP1 gene induced by drought and salt stress in wheat（Triticum aestivum L. ）［J］. Plant Sci, 2004, 167：995-1001.

［21］鄭明. 植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的多抗性功能初步研究［D］. 長春：吉林大學(xué), 2009.

［22］Li HY, Dong YY, Yang J, et al. De novo transcriptome of safflower and and the identification of putative genes for oleosin and the biosynthesis of flavonoids［J］. PLoS One, 2012, 7：1-10.

［23］Van Loon LC, Van Strien EA. The families of pathogens is related proteins, their activities and comparative analysis of PR/L1 type proteins［J］. Physiol Mol Plant Pathol, 1999, 55：85-97.

［24］Chae K, Gonong BJ, Kim SC, et al. A multifaceted study of stigma/ style cysteine-rich adhesin（SCA）-like Arabidopsis lipid transfer protein（LTPs）suggests diversified roles for these LTPs in plant growth and reproduction［J］. J Exp Bot, 2010, 61：4277-4290.

［25］Kirubakaran SI, Begum SM, Ulaganathan K, et al. Characterization of a new antifungul lipid transfer protein from wheat［J］. Plant Physiol Biochem, 2008, 46：918-927.

［26］Gao S, Guo W, Feng W, et al. LTP3 contributes to disease susceptibility in Arabidopsis by enhancing abscisic acid（ABA）biosynthesis［J］. Mol Plant Pathol, 2015, 29. doi：10. 1111/mpp. 12290.

［27］Safi H, Saibi W, Alaoui MM, et al. A wheat lipid transfer protein （TdLTP4）promotes tolerance to abiotic and biotic stress in Arabidopsis thalianas［J］. Plant Physiol Biochem, 2015, 89：64-75.

［28］Wang F, Zang XS, Kabir MR, et al. A wheat lipid transfer protein 3 could enhance the basal thermotolerance and oxidative stress resistance of Arabidopsis［J］. Gene, 2014, 550（1）：18-26.

［29］Pitzschke A, Datta S, Persak H. Salt stress in Arabidopsis： lipid transfer protein AZI1 and its control by mitogen-activated protein kinase MPK3［J］. Mol Plant, 2014, 7（4）：722-738.

［30］Fan Y, Du K, Gao Y, et al. Transformation of LTP gene into Brassica napus to enhance its resistance to Sclerotinia sclerotiorum［J］. Genetika, 2013, 49（4）：439-447.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Lipid Transfer Protein LTP Gene in Carthamus tinctorius

HAN Yi-lai1CUI Qi1WU Yun-yun1GU Tian-yao1TENG Xiao-hua3HU Ren-ge1WU Guan-da1GUAN Li-li1，2LI Hai-yan1，2LI Xiao-kun2
（1. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2. Ministry of Education Bioreactor and Drug Development Research Center，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；3. Tonghua No.1 Senior High School，Tonghua 134000）

LTP（Lipid transfer protein）gene was cloned，its bioinformatics and expression were analyzed，providing the basis for the study the role of LTP gene in safflower resisting stresses. The sequence of LTP gene was cloned by RT-PCR technique，the protein characteristics were analyzed using bioinformatics，and the phylogenetic tree of LTP for safflower and other species was constructed. The expressions of LTP gene in the different tissues were analyzed using Real time-PCR. Sequence analysis showed that ORF of LTP was 294 bp，encoding a protein of 97 amino acids with a molecular weight of 7.46 kD，isoelectric point of 8.91. Safflower LTP protein contained a long signal peptide sequence of 29 amino acid residues，and the protein contained a serine phosphorylation site. Tertiary structure prediction indicated that the protein was a simple structure of 3 α-helix and 1 β-turn twining in random coils. Molecular evolution showed that the evolutionary relationship of LTP between Brassica of cruciferous and safflower was the most similar. Tissue-specific expression analysis of safflower LTP by fluorescence quantitative PCR showed that the gene expression levels in different tissues presented a significant difference，while high expression in seeds and flowers，and low expression in other tissues.

lipid transfer protein；safflower；Real-time PCR；bioinformatics analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.022

2015-07-22

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”）項(xiàng)目（2011AA100606），吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（吉教科合字［2016］179號） ，國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31201237），吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201610193046，201410193045），吉林省科技廳中青年領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20111815），教育部博士點(diǎn)基金-青年教師基金項(xiàng)目（20122223120002）

韓怡來，男，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：994435840@qq.com

官麗莉，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：藥用植物與生物技術(shù)；E-mail：guanll2004@163.com