迷迭香提取物對高脂膳食雌性果蠅致氧化應激的調(diào)控作用及機制

王 紅，陳 純，王軼菲，程立芳，蔡佳蓉，王 浩

（1. 天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

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迷迭香提取物對高脂膳食雌性果蠅致氧化應激的調(diào)控作用及機制

王 紅1， 2，陳 純1，王軼菲1， 2，程立芳1， 2，蔡佳蓉1，王 浩1

（1. 天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

摘 要：以雌性果蠅為動物模型研究迷迭香提取物（ROE）對高脂膳食致氧化應激的調(diào)控作用及機制.收集2，d齡雌性果蠅，隨機分為空白組、高脂組及分別飼喂高脂飼料添加迷迭香提取物0.2、0.5、1.5，mg/mL的劑量組，每3，d更換新鮮培養(yǎng)基，記錄果蠅死亡數(shù)目，并計算其平均壽命和最高壽命；45，d后測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活力和丙二醛（MDA）含量；實時熒光定量PCR（Real-time PCR）法測定相關基因mRNA表達水平.結(jié)果表明：飼喂迷迭香提取物的果蠅平均壽命與最高壽命明顯延長；0.2，mg/mL ROE顯著升高Mn-SOD活力（P＜0.05），1.5，mg/mL ROE顯著升高Cu-Zn-SOD、CAT活力（P＜0.05），極顯著升高Mn-SOD活力，降低MDA含量（P＜0.01）；0.5，mg/mL ROE 顯著上調(diào)Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達水平（P＜0.05），極顯著上調(diào)Nrf2，mRNA表達水平，1.5，mg/mL ROE極顯著上調(diào)Mn-SOD及Nrf2，mRNA表達水平（P＜0.01）.因此，ROE能有效延緩高脂導致的氧化損傷，這可能與上調(diào)抗氧化基因表達水平有關.

關鍵詞：迷迭香提取物；高脂膳食；黑腹果蠅；抗氧化；酶活力；基因表達

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.），為唇形科灌木，因其具有優(yōu)良的抗氧化活性，廣泛用于醫(yī)藥、食品及油脂保鮮等.迷迭香中含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚、迷迭香醌、咖啡酸、迷迭香二酚、熊果酸等多種活性成分.方曉璞等［1］研究了迷迭香天然抗氧化劑在核桃油中的應用，結(jié)果表明迷迭香具有較佳的抗氧化效果.Aruoma等［2］研究顯示，鼠尾草酚、鼠尾草酸能有效阻止羥自由基的形成，抑制肝細胞微粒體脂質(zhì)氧化［3］.

高脂飲食可引起脂質(zhì)過氧化損傷.抗氧化劑可以有效清除體內(nèi)多余的自由基，延緩高脂導致的氧化損傷.研究顯示［4］，高脂膳食中分別添加0.5%，和5%，的迷迭香干粉，可以顯著抑制C57BL/6J小鼠因高脂膳食引起的動脈血栓的形成.

果蠅常被作為研究衰老因素的模式生物［5］.具有生命周期短，飼養(yǎng)簡單的特點，且其衰老基因與人類具有很大的相似性［6］.本文以Oregon K 野生型雌性黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）為研究對象，探究迷迭香提取物對高脂導致氧化損傷的果蠅體內(nèi)抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物含量的影響，并采用定時熒光定量PCR（Real-time PCR）法測定其對抗氧化相關基因表達水平的影響.

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Oregon K野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）由天津科技大學食品添加劑與營養(yǎng)調(diào)控研究室提供，迷迭香提取物（ROE）由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供.

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA 合成試劑盒、SYBR green，寶生物工程（大連）有限公司.

UVmini-1240型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；HWS-850型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；Real-time PCR儀，美國 Bio-Rad公司.

1.2方法

1.2.1果蠅培養(yǎng)

選用2，d齡雌性果蠅，于溫度為（25±1）℃，濕度為50%～60%，的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3，d更換新鮮培養(yǎng)基并記錄果蠅生存狀況.

基礎培養(yǎng)基：蒸餾水1，000，mL，葡萄糖96，g，玉米粉96，g，酵母粉13.3，g，瓊脂粉8，g，防腐劑（含1%，對羥基苯甲酸乙酯的75%，酒精）53.3，mL.

高脂培養(yǎng)基為普通培養(yǎng)基中添加10%，豬油，實驗培養(yǎng)基在高脂培養(yǎng)基中分別添加0.2、0.5、1.5，mg/mL的迷迭香提取物.

1.2.2果蠅壽命實驗

收集2，d齡雌性果蠅1，000只，分為5組，即正常組、高脂組和3個劑量組（迷迭香提取物質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.5，mg/mL），每組200只，分別飼喂基礎培養(yǎng)基、高脂培養(yǎng)基及添加不同質(zhì)量濃度（0.2、0.5、1.5，mg/mL）迷迭香提取物的高脂培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每3，d更換新鮮培養(yǎng)基，同時記錄果蠅生存狀況，直至果蠅全部死亡，統(tǒng)計其平均壽命與最高壽命.

1.2.3果蠅抗氧化酶活力及MDA含量測定

收集2，d齡的雌性果蠅2，000只，每組400只，飼喂方法同壽命實驗，45，d后，CO2麻醉后稱質(zhì)量，-80，℃?zhèn)溆?果蠅用生理鹽水冰浴勻漿，4，℃、2，500 r/min離心10，min，取上清液測定蛋白質(zhì)量濃度、Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活力及MDA含量.

1.2.4果蠅Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、MTH、Nrf2基因mRNA表達水平的測定

取45，d果蠅，Trizol法提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，Real-time PCR法測定Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、MTH和Nrf2，mRNA表達水平.果蠅抗氧化基因Real-time PCR引物［7］見表1.

表1　果蠅抗氧化基因PCR引物Tab.1　PCR primers used to measure Drosophila melanogaster antioxidant genes

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS statistics17.0軟件進行統(tǒng)計分析，以“平均值±標準差”形式表示，組間差異采用方差檢驗分析.#與##分別表示與正常組相比P＜0.05、P＜0.01；*與**分別表示與高脂組相比 P＜0.05、P＜0.01.

2　結(jié)果與分析

2.1迷迭香提取物主要活性成分分析

經(jīng)HPLC-MS/MS檢測，迷迭香提取物中主要活性成分分別為迷迭香酸1.5%、迷迭香酚7.2%、鼠尾草酚33.2%、鼠尾草酸30.3%、鼠尾草酸甲酯27.8%，具體結(jié)果見圖1和表2.

圖1　 HPLC 分析迷迭香提取物及主要活性成分Fig.1　HPLC analysis of rosemary extract and its main active ingredients

表2　迷迭香提取物主要活性成分及相對含量Tab.2　The main active ingredients of rosemary extract and its percentage compositions

2.2迷迭香提取物對雌性高脂果蠅壽命的影響

迷迭香提取物對雌性高脂果蠅壽命的影響，結(jié)果如圖2所示.高脂膳食飼喂果蠅的平均壽命與最高壽命均明顯低于正常組果蠅（P＜0.05），而其體重間并無顯著性差異（P＞0.05）.與高脂對照組比，飼喂迷迭香提取物的果蠅壽命顯著延長（P＜0.05），其中0.5、1.5，mg/mL劑量組果蠅的平均壽命與最高壽命分別延長了15.77%，、20.23%，和9.75%，、13.26%，呈現(xiàn)劑量依賴關系.具體結(jié)果見圖2和表3.

圖2　 果蠅壽命曲線Fig.2　Lifespan curve of male Drosophila melanogasters

2.3迷迭香提取物對果蠅體內(nèi)Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、CAT酶活力及MDA含量的影響

飼喂迷迭香提取物后，果蠅體內(nèi)相關抗氧化酶活力較正常組均有提高，過氧化產(chǎn)物含量均有下降，且呈現(xiàn)劑量依賴關系（表4）.與對照組相比，0.2，mg/mL 組Cu-Zn-SOD、CAT活力升高，Mn-SOD活力顯著升高（P＜0.05），0.5，mg/mL組Mn-SOD活力顯著升高（P＜0.05），1.5，mg/mL組果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、CAT活力顯著升高（P＜0.05），CAT活力極顯著升高（P＜ 0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）.

表3　迷迭香提取物對果蠅壽命的影響Tab.3　Effect of rosemary extract on the lifespan of Drosophila melanogasters

表4　迷迭香提取物對果蠅抗氧化酶活力及MDA含量的影響Tab.4　Effect of rosemary extract on the anti-oxidation enzyme activity and MDA content in Drosophila melanogasters

2.4Real-time PCR檢測抗氧化基因Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、MTH及Nrf2，mRNA表達水平

與高脂對照組相比，0.5，mg/mL組果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），1.5，mg/mL Mn-SOD mRNA表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），0.5和1.5，mg/mL組果蠅體內(nèi)Nrf2，mRNA表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），同時，MTH，mRNA表達水平呈下調(diào)趨勢.具體結(jié)果見圖3.

圖3　迷迭香提取物對果蠅Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、MTH、Nrf2，mRNA表達的影響Fig.3　Effect of rosemary extract on Cu-Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，MTH and Nrf2，mRNA expression in Drosophila melanogasters

3　討 論

Denham Harman提出的“衰老自由基學說”，認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害損傷造成的.低濃度自由基是機體執(zhí)行正常生理功能所必需，但過量的自由基會對機體造成損傷［8］.迷迭香是傳統(tǒng)的天然香料，從中提取得到的迷迭香提取物，具有良好的抗氧化性能，F(xiàn)rankel等［9］研究了迷迭香提取物及其主要成分鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸等對不含VE的玉米油和玉米油-水乳狀液氧化的抑制作用，發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物、鼠尾草酚、鼠尾草酸具有顯著的抗氧化活性.Richheimer等［10］研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物中鼠尾草酸能夠有效抑制大豆油的氧化，其抗氧化能力數(shù)倍于BHA和BHT.

SOD、CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi).抗氧化酶活力的升高可顯著減少自由基氧化損傷，延緩機體衰老［11］.MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，具有細胞毒性，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷.本實驗發(fā)現(xiàn)飼喂迷迭香提取物組果蠅較高脂模型組果蠅體內(nèi)SOD、CAT活力顯著升高，MDA含量顯著下降，說明迷迭香提取物在體內(nèi)發(fā)揮了抗氧化作用，使果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力升高，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量下降.研究發(fā)現(xiàn)［12］，迷迭香乙醇提取物能抑制四氧嘧啶導致的兔子血糖水平和血清MDA含量升高，并顯著增強血清中抗氧化酶SOD和CAT活性.王虹等［13］也曾報道，迷迭香提取物能夠升高D-半乳糖致衰老小鼠血清和腦中SOD活力，降低MDA含量并能延長小鼠耐缺氧時間.Sotelo-Felix等［14］研究了迷迭香甲醇提取物對CCl4氧化應激所致SD大鼠急性肝損傷的保護作用，結(jié)果顯示迷迭香提取物在CCl4損傷發(fā)生24，h后能完全抑制CCl4氧化應激所導致的肝脂質(zhì)體氧化和膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性升高.同樣，Botsoglou等［15］以Wistar大鼠為研究動物，飼料中添加1%，的迷迭香干粉，6周末注射CCl4，結(jié)果顯示，迷迭香能夠抑制·CCl3自由基引發(fā)的氧化應激損傷.

Real-time PCR結(jié)果顯示，飼喂迷迭香提取物后，果蠅體內(nèi)抗氧化相關基因SOD、CAT mRNA表達水平顯著上調(diào)，與對應抗氧化酶活力增強結(jié)果相一致；MTH是果蠅體內(nèi)3號染色體上編碼G蛋白偶聯(lián)受體的基因，當MTH發(fā)生突變后，果蠅的平均壽命能夠延長35%，且表現(xiàn)出更強的抵抗外源氧化應激［16］.本實驗測得MTH mRNA表達水平顯著下調(diào)，與其體內(nèi)過氧化物產(chǎn)量降低結(jié)果一致.Nrf2-keap1-ARE是機體抵御內(nèi)外界氧化及化學應激的主要防御通路，調(diào)控抗氧化和Ⅱ相解毒酶的表達，組成一個強大的“抗氧化酶鏈”，起著重要的氧化防御功能［17］. 本研究發(fā)現(xiàn)，給予迷迭香提取物后，果蠅體內(nèi)Nrf2 mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）.Satoh等［18-19］也曾研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸在神經(jīng)元HT22細胞中能夠通過激活Nrf2/Keap1途徑和ARE表達上調(diào)NQO1的表達.

因此，迷迭香提取物能有效降低果蠅體內(nèi)氧化損傷，使果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力及其mRNA表達升高，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量下降，有效調(diào)控高脂膳食導致的氧化應激損傷，從而延長果蠅壽命.參考文獻：

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責任編輯：郎婧

The Antioxidant Effect of Rosemary Extract on High Fat Diet-induced Damage in Female Drosophila melanogaster and its Regulatory Mechanism

WANG Hong1， 2，CHEN Chun1，WANG Yifei1， 2，CHENG Lifang1， 2，CAI Jiarong1，WANG Hao1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To study the effect of rosemary extract（ROE）on anti-aging and antioxidation in high-fat dietary Drosophila melanogaster，Drosophila melanogasters were divided into three groups：the normal group：the high fat diet group（HF diet）and the experimental groups fed with different doses of rosemary extract（0.2，0.5，1.5，mg/mL）.The medium was replaced every three days and the number of the dead Drosophila melanogasters was recorded immediately，so the mean lifespan and maximum lifespan were calculated.The variation of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and malondialdehyde（MDA），as well as the mRNA expression levels of their encoding genes were determined after 45，days by Real-time PCR.It revealed that the lifespan of Drosophila melanogasters treated with resomary extract was extended significantly compared with the normal group. 0.2，mg/mL ROE could increase the enzyme activity of Mn-SOD significantly（P＜0.05），and 1.5，mg/mL ROE increased the enzyme activity of Cu-Zn-SOD，Mn-SOD and CAT significantly（P＜0.05）accompanied by a decrease of MDA content（P＜0.01）；with 0.5，mg/mL ROE，the mRNA expression levels of Cu-Zn-SOD，Mn-SOD，CAT and Nrf2 were up-regulated（P＜0.05）；with 1.5，mg/mL ROE，the mRNA expression levels of Mn-SOD and Nrf2，were up-regulated very significantly（P＜0.01）.It is concluded that the effect of rosemary extract on extending lifespan is likely to be related with the up-regulation of the gene expression level of endogenous antioxidant enzymes.

Key words：rosemary extract；high fat diet；Drosophila melanogaster；antioxidant；enzyme activity；gene expression

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1672-6510（2016）02-0031-05

收稿日期：2015-07-06；修回日期：2015-09-29

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金資助項目（31201322）

作者簡介：王 紅（1990—），女，山東人，碩士研究生；通信作者：王 浩，副教授，wanghao@tust.edu.cn.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150088