提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化效率的研究

曹張磊，王德培，張 嵐

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

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提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化效率的研究

曹張磊，王德培，張 嵐

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

摘 要：為提高根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)黑曲霉（Aspergillus niger）轉(zhuǎn)化（ATMT）效率，本文對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的分生孢子與農(nóng)桿菌的比例、轉(zhuǎn)化媒介、誘導(dǎo)溶氧、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)乙酰丁香酮（AS）濃度這5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最終確定提高其轉(zhuǎn)化效率的最優(yōu)條件為：根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)過(guò)程在400，μmol/L乙酰丁香酮終濃度條件下，100，mL三角瓶中28，℃、100，r/min振蕩培養(yǎng)5，h，分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例為1∶100，在硝酸纖維膜媒介上24，℃共培養(yǎng)48，h.在此優(yōu)化條件下，黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到35個(gè)/107分生孢子.相比于優(yōu)化前，轉(zhuǎn)化效率提升了78%，并且整合至黑曲霉基因組的外源潮霉素B抗性基因在轉(zhuǎn)接15代以后仍能穩(wěn)定遺傳.

關(guān)鍵詞：黑曲霉；根癌農(nóng)桿菌；潮霉素B抗性

黑曲霉（Aspergillus niger）現(xiàn)已成為重要的工業(yè)發(fā)酵菌種之一，廣泛應(yīng)用于食品加工、輕化紡織、飼料加工、廢物處理、醫(yī)藥等領(lǐng)域.工業(yè)生產(chǎn)菌株黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88全基因組測(cè)序的完成為在分子層面上研究黑曲霉代謝機(jī)理、提升菌株性能奠定了理論基礎(chǔ)［1］.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法的建立，大大簡(jiǎn)化了絲狀真菌的轉(zhuǎn)化操作，提高了其轉(zhuǎn)化效率，為絲狀真菌基因功能的研究、有用基因的克隆表達(dá)與菌株遺傳性能的改造開(kāi)辟了一條全新途徑.

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種能夠侵染植物體受傷的組織細(xì)胞的革蘭氏陰性菌，最初應(yīng)用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化研究，其能在自然狀態(tài)下對(duì)受傷的植物細(xì)胞所釋放的各種酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生趨向性，侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA［2］轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)并整合至植物的基因組中，最終導(dǎo)致植物腫瘤的產(chǎn)生，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物體的遺傳改造.De Groot等［3］利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了黑曲霉，這為絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的研究方法.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化效率受到諸多因素的影響，如何提高其在黑曲霉中的轉(zhuǎn)化效率仍是一個(gè)值得研究的課題.黎明等［4］發(fā)現(xiàn)孢子懸液的新鮮程度和濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)溫度這5個(gè)主要因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生較大影響.郭慧等［5］發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮加入與否對(duì)日本曲霉轉(zhuǎn)化效率有著明顯的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了誘導(dǎo)物的添加能活化農(nóng)桿菌中的毒性蛋白，提高侵染效率.龍朝欽等［6］對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙曲霉轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化媒介對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙曲霉轉(zhuǎn)化效率影響顯著.本文曾參考黎明等［4］和Michielse等［7］的實(shí)驗(yàn)方法所得到的轉(zhuǎn)化子平均個(gè)數(shù)為15個(gè)/107分生孢子，轉(zhuǎn)化效率低，推測(cè)其原因是農(nóng)桿菌的侵染毒性低.通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)很少有學(xué)者關(guān)注誘導(dǎo)農(nóng)桿菌過(guò)程各因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，因此本文就提高農(nóng)桿菌侵染毒性即農(nóng)桿菌在誘導(dǎo)過(guò)程中溶氧條件、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物乙酰丁香酮濃度以及其他相關(guān)提高轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步完善根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 5751、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1、質(zhì)粒p50均為本實(shí)驗(yàn)室保存.

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10，g，酵母粉5，g，氯化鈉10，g，蒸餾水定容至1，L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15，g，121，℃滅菌20，min.

PDA固體培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮馬鈴薯200，g，切成小塊，加入適量蒸餾水，煮沸30，min，6層紗布過(guò)濾，定容至1，L，加入葡萄糖20，g，瓊脂粉20，g，121，℃滅菌20，min.

IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌侵染所需培養(yǎng)基及試劑參考文獻(xiàn)［7］配制.

1.2試劑與溶液的配制

Taq DNA聚合酶、T4，DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶等，TaKaRa公司；乙酰丁香酮（AS），Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、潮霉素B，Solarbio公司；2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸鈉鹽（MES），上海生工生物工程有限公司；其他試劑，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠.

基因組提取緩沖液：5，mol/L NaCl 20，mL，0.5，mol/L EDTA 100，mL，1，mol/L Tris-HCl（pH 8.5）50，mL，10%， SDS 100，mL，蒸餾水定容至1，L.

TE緩沖液：1，mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10，mL，0.25，mol/L EDTA（pH 8.0）4，mL，蒸餾水定容至1，L.

pH 5.0，HAc-NaAc溶液：稱(chēng)取NaAc 5.4，g，溶于適量去離子水中，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0，定容至100，mL.

苯酚混合物：苯酚、三氯甲烷、異戊醇按體積比24∶25∶1量取混合.

1.3黑曲霉分生孢子的制備

取6，mL滅菌蒸餾水，從培養(yǎng)4，d的黑曲霉PDA平板上洗孢子，用無(wú)菌水稀釋孢子懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)至孢子密度為2×107，mL-1備用.

1.4根癌農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取根癌農(nóng)桿菌AGL1接種于3，mL LB液體培養(yǎng)基中，28，℃、180，r/min培養(yǎng)過(guò)夜；取2，mL培養(yǎng)液于100，mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至A600為0.5左右；將培養(yǎng)液置冰浴中40，min，4，℃、5，000，r/min離心10，min，棄去上清液；4，℃、10，mL的無(wú)菌水離心洗滌1次，棄去上清液；用4，℃、10，mL 10%，甘油懸浮菌體；4，℃、5，000，r/min離心5，min，棄去上清液；用1，mL預(yù)冷的10%，甘油懸浮，分裝成每管70，μL，-70，℃保存.

1.5根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)

取1，μL具有潮霉素B抗性基因的重組質(zhì)粒p50質(zhì)粒，加到70，μL根癌農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，吸取并加到間距0.2，cm電轉(zhuǎn)杯中，擦拭干凈，調(diào)節(jié)電擊電壓2.5，kV，電擊5，ms.將電轉(zhuǎn)化［8］后的根癌農(nóng)桿菌涂布于LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上進(jìn)行篩選，篩選得到的陽(yáng)性克隆子在LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上劃線，28，℃培養(yǎng)2，d，挑取單菌落接種于5，mL（含100，μg/mL卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，28，℃、180，r/min培養(yǎng)16～20，h，將1，mL根癌農(nóng)桿菌菌液接種于含有相應(yīng)抗性的100，mL LB液體培養(yǎng)基中，按照同等條件繼續(xù)培養(yǎng)至A600為0.8備用.

1.6優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件

將4，mL（A600=0.8）根癌農(nóng)桿菌菌液5，000，r/min離心5，min收集菌體，用6，mL含有不同濃度AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮菌體，在不同溶氧條件下（直徑18，mm試管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶）進(jìn)行不同時(shí)間段（2、4、5、6、8，h）誘導(dǎo)培養(yǎng)，取黑曲霉孢子懸液250，μL，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)后根癌農(nóng)桿菌菌液濃度，按黑曲霉孢子與農(nóng)桿菌不同比例（1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000）等體積混合均勻，涂布在不同的轉(zhuǎn)化媒介（尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜、醋酸硝酸混合膜）的IM固體培養(yǎng)基上，24，℃避光培養(yǎng)48，h，然后將混合體系用無(wú)菌水稀釋后涂到含有150，μg/mL潮霉素B平板上進(jìn)行初篩，培養(yǎng)4～5，d，隨后轉(zhuǎn)接至200，μg/mL潮霉素B進(jìn)行復(fù)篩，每種條件重復(fù)3次，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子后記錄轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù).以107個(gè)分生孢子所得到的具有潮霉素B外源基因的轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)來(lái)表示轉(zhuǎn)化效率.具體操作詳見(jiàn)文獻(xiàn)［7］.

1.7轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證及遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證

提取黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組，以潮霉素B抗性基因序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），PCR方法驗(yàn)證.

表1　潮霉素B引物Tab.1　Primers of hygromycin B

從篩選培養(yǎng)基中隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，轉(zhuǎn)接15代以后，提基因組對(duì)潮霉素B進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確定抗性基因的穩(wěn)定性.

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Mintab 16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2　結(jié)果與討論

2.1黑曲霉對(duì)潮霉素B的敏感性

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建可以使用多種形式的受體細(xì)胞，如原生質(zhì)體、分生孢子、菌絲體等［3］，本實(shí)驗(yàn)采用了較易制備的分生孢子作為受體.所以用黑曲霉孢子對(duì)潮霉素B進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn).

將黑曲霉孢子懸液涂布于含有不同濃度潮霉素B的CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表2.隨著潮霉素B質(zhì)量濃度增大，黑曲霉的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到150，μg/mL時(shí)，黑曲霉已經(jīng)無(wú)法生長(zhǎng).本實(shí)驗(yàn)選擇150，μg/mL潮霉素B為初篩質(zhì)量濃度，200，μg/mL潮霉素B為復(fù)篩質(zhì)量濃度.

表2　黑曲霉CGMCC 5751對(duì)潮霉素B的敏感性Tab.2　Sensitivity of A. niger CGMCC 5751 to hygromycin B

2.2黑曲霉分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在其他條件一樣的情況下，取2×107，mL-1黑曲霉孢子懸液250，μL與不同濃度根癌農(nóng)桿菌250，μL混合，最終按體積比為1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000充分混勻，涂布在IM固體平板上，24，℃避光培養(yǎng)48，h，然后轉(zhuǎn)移到CM篩選平板（含150，μg/mL潮霉素B）上篩選轉(zhuǎn)化子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.在一定范圍內(nèi)（1∶1～1∶100），黑曲霉分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例增加時(shí)，轉(zhuǎn)化子的數(shù)量隨之提高，但是當(dāng)達(dá)到1∶1，000時(shí)，轉(zhuǎn)化子的數(shù)量反而降低.單因素方差分析顯示比例為1∶100時(shí)轉(zhuǎn)化效率最佳，與其他各組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.然而提高至1∶1，000時(shí)轉(zhuǎn)化子反而減少，分析原因是根癌農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，與黑曲霉共同競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也使其轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基上后不易被清除，影響轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)［9］.

圖1　黑曲霉分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的體積比對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1　Effect of A. niger conidia to A. tumefaciens ratio on transformation efficiency

2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農(nóng)桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有不同濃度的AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮菌體，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖2所示.AS濃度為400，μmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，與其他各組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

不同AS濃度對(duì)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)影響較大，過(guò)高或過(guò)低的AS濃度都不利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)立4個(gè)不同的濃度梯度對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AS誘導(dǎo)濃度為400，μmol/L時(shí)，根癌農(nóng)桿菌對(duì)黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率最高.ATMT是通過(guò)根癌農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒內(nèi)毒力區(qū)編碼的各種蛋白共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而AS對(duì)根癌農(nóng)桿菌中的毒性基因起到誘導(dǎo)或輔誘導(dǎo)作用［10］，激活毒力區(qū)基因的表達(dá).在一定濃度范圍內(nèi)，隨著AS濃度的增加轉(zhuǎn)化效率也隨之提升，這與De Groot等［3］的研究結(jié)果一致.但當(dāng)AS濃度超過(guò)400，μmol/L后，隨著AS濃度的增加轉(zhuǎn)化效率反而下降，其原因可能是AS過(guò)量會(huì)抑制毒蛋白的活性，降低其侵染效率，同時(shí)過(guò)高的AS濃度對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子數(shù)量減少.

圖2　 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入AS的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2　Effect of concentration of AS in inducing medium on transformation efficiency

2.4誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌時(shí)溶氧對(duì)其轉(zhuǎn)化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農(nóng)桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮菌體，分別于直徑18，mm試管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)至A600=0.8，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖3所示.隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)溶氧的增大，轉(zhuǎn)化效率也隨之上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）.

圖3　 誘導(dǎo)溶氧對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3　Effect of inducing dissolved oxygen on transformation efficiency

根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)溶氧的高低對(duì)轉(zhuǎn)化效率也產(chǎn)生一定的影響.隨著溶氧的增加，根癌農(nóng)桿菌代謝旺盛，細(xì)胞增殖，活力增強(qiáng)，其所分泌的毒蛋白活性也相應(yīng)增強(qiáng)［11］，使T-DNA更容易侵入進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)提高.

2.5誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

將4，mL（A600=0.8）根癌農(nóng)桿菌菌液5，000，r/min離心5，min，收集菌體，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮菌體，將根癌農(nóng)桿菌菌液分別誘導(dǎo)培養(yǎng)2～8，h，培養(yǎng)后將根癌農(nóng)桿菌菌體濃度調(diào)成一致，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖4所示.隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)增大，誘導(dǎo)時(shí)間為5，h效果最好，低于此時(shí)間，轉(zhuǎn)化效率明顯下降，高于此時(shí)間效率有所下降，并且各組數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.這說(shuō)明誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都不利于轉(zhuǎn)化介導(dǎo).其原因是過(guò)長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致毒蛋白活性下降，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致大量假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生，而過(guò)短的誘導(dǎo)時(shí)間又無(wú)法激活毒力區(qū)基因的表達(dá)，影響轉(zhuǎn)化效率.

圖4　 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4　Effect of inducing time on transformation efficiency

2.6轉(zhuǎn)化媒介對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

取2×107，mL-1黑曲霉孢子懸液250，μL，與等體積的誘導(dǎo)后根癌農(nóng)桿菌菌液（A600=0.8）混勻，二者比例為1∶100分別涂在貼有尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜、醋酸硝酸混合膜的IM固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24，℃避光培養(yǎng)48，h，然后轉(zhuǎn)移到CM（150，μg/mL潮霉素B）篩選平板上篩選轉(zhuǎn)化子，結(jié)果如圖5所示.硝酸纖維膜轉(zhuǎn)化效果要明顯優(yōu)于其他媒介，尼龍膜效果最差，組間具有明顯差異（P＜0.01）.

能夠作為共培養(yǎng)媒介的物質(zhì)有很多，如尼龍膜、硝酸纖維膜、玻璃紙等都曾被報(bào)道應(yīng)用于絲狀真菌的轉(zhuǎn)化［12-15］，其原理是媒介能將菌體與培養(yǎng)基分離，但不影響菌體對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的吸收及其自身生長(zhǎng).本研究結(jié)果表明，用硝酸纖維膜進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉要明顯優(yōu)于其他轉(zhuǎn)化媒介，其原因可能是不同的膜具有不同的化學(xué)特性與吸附能力，其會(huì)影響農(nóng)桿菌細(xì)胞與黑曲霉孢子的相互作用，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的不同.硝酸纖維膜轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)可能是由于其對(duì)毒性蛋白質(zhì)具有高度的親和性［16］.

圖5　 轉(zhuǎn)化媒介對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5　Effect of transformation media on transformation efficiency

2.7轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證及遺傳穩(wěn)定性鑒定

隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，10個(gè)轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出潮霉素B的片段.將這10個(gè)轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)15代后提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，均能擴(kuò)增出潮霉素B的片段，結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)化子的潮霉素基因可以穩(wěn)定遺傳.

圖6　 黑曲霉CGMCC 5751轉(zhuǎn)化子PCR結(jié)果Fig.6　PCR results of the A. niger CGMCC 5751 transformants

2.8根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)條件優(yōu)化前后轉(zhuǎn)化效率對(duì)比

將各單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件綜合后對(duì)黑曲霉進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并與優(yōu)化前的實(shí)驗(yàn)方法［4］進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3.107分生孢子中轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)從平均8個(gè)上升至35個(gè)，并且在篩選平板上轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)明顯加快（P＜0.01），轉(zhuǎn)化效率明顯提高.

表3　優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件前后轉(zhuǎn)化效率的對(duì)比Tab.3　Comparison of transformation efficiency before and after the optimization of A. tumefaciens-mediated transformation conditions

3　結(jié) 論

本文利用根癌農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉，優(yōu)化其轉(zhuǎn)化條件，尤其是在誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌過(guò)程中各因素優(yōu)化成功，進(jìn)一步驗(yàn)證了根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系對(duì)絲狀真菌的可行性.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出添加400，μmol/L乙酰丁香酮，100，mL搖瓶誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌AGL1培養(yǎng)5，h，調(diào)節(jié)黑曲霉孢子與根癌農(nóng)桿菌體積比為1∶100，用共培養(yǎng)媒介硝酸纖維膜，根癌農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉效果最好，107個(gè)分生孢子中黑曲霉轉(zhuǎn)化子可達(dá)35個(gè)，相比于優(yōu)化前的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率提高了78%，.農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系的確立，克服了原有絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系操作繁雜、轉(zhuǎn)化效率低、耗時(shí)多等缺點(diǎn).通過(guò)研究影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，基本上確立了該方法在黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化上的一些特性，雖然對(duì)于不同的曲霉，其最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件存在著一定的差異，但對(duì)于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立具有重要的參考價(jià)值.

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責(zé)任編輯：郎婧

Improvement of Transformation Efficiency of Aspergillus niger Mediated by Agrobacterium tumefaciens

CAO Zhanglei，WANG Depei，ZHANG Lan

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To improve the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation（ATMT）efficiency of Aspergillus niger，we performed some single-factor tests for five factors：ratio of conidia to bacterium，transformation media，inducing dissolved oxygen，inducing time and inducing concentration of acetosyringone（AS）.The optimum conditions to improve the transformation efficiency were as follows：A tumefaciens was cultivated in 400，μmol/L AS at 28，℃ and 100，r/min for 5，h in 100，mL conical flask；co-cultivation was conducted at a 1∶100，ratio of conidia to bacterium on nitrocellulose membrane at 24，℃ for 48，h.Under the above optimized conditions，the transformation efficiency of A.niger achieved 35，transformants/ 107，conidia. The transformation efficiency was increased by 78%， compared with that before optimization，and all the selected hygromycin B resistant transformants were genetically stable after 15 subcultures on complete medium.

Key words：Aspergillus niger；Agrobacterium tumefaciens；hygromycin B resistance

中圖分類(lèi)號(hào)：Q933

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-6510（2016）02-0020-06

收稿日期：2015-04-27；修回日期：2015-08-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471725）

作者簡(jiǎn)介：曹張磊（1990—），男，浙江人，碩士研究生；通信作者：王德培，教授，shiyao218@163.com.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150054