葡萄糖脫氫酶溫控表達(dá)菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵工藝

李 楊，張志萌，董自星，王正祥，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

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葡萄糖脫氫酶溫控表達(dá)菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵工藝

李 楊，張志萌，董自星，王正祥，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

摘 要：膜結(jié)合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶（mPQQGDH，EC 1.1.5.2）是一種重要的氧化還原酶，因其在血糖診斷及葡萄糖傳感器中的重要應(yīng)用而受到廣泛的關(guān)注.但是其低表達(dá)水平限制了這種酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用.本文利用λ噬菌體的溫敏型啟動(dòng)子PL-PR替換葡萄糖脫氫酶基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建了重組菌大腸桿菌（E. coli）B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR，并使重組菌的酶活比原始菌株提高了21.2%，.再通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了mPQQGDH的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為：以甘油為碳源、誘導(dǎo)溫度42，℃、誘導(dǎo)時(shí)間4，h、誘導(dǎo)前菌體密度A600=1.6.最后對該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為25，℃和6.0，所得mPQQGDH的熱穩(wěn)定性在45，℃條件下可維持穩(wěn)定的活性.這為葡萄糖脫氫酶更廣泛的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：葡萄糖脫氫酶；溫敏型啟動(dòng)子；高效表達(dá)；發(fā)酵工藝優(yōu)化

數(shù)字出版日期：2015-10-16；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151016.1454.010.html.

大腸桿菌葡萄糖脫氫酶（mPQQGDH，EC 1.1.5.2）是一種膜結(jié)合型醌蛋白，位于細(xì)胞膜外表面.在醌式輔酶吡咯喹啉醌（PQQ）的存在下能特異性催化葡萄糖生成葡萄糖酸.1975年，Banauch 等就提出利用上述反應(yīng)，采用動(dòng)態(tài)法或終點(diǎn)法分析測定人體體液中的葡萄糖濃度［1］.近年來，以葡萄糖脫氫酶特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)制成的血糖檢測儀和生物芯片已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷和人體保健檢測等領(lǐng)域［2-3］.

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要順式作用元件，它一般具有序列特異性、位置特異性、種屬特異性、方向性等幾個(gè)明顯的特征［4］.tac啟動(dòng)子能夠以乳糖或IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，成本較高，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).而λ 噬菌體啟動(dòng)子PL和PR能夠通過改變培養(yǎng)溫度快速、有效地開啟或關(guān)閉重組蛋白的表達(dá)［5］.而且已被用于多種目的產(chǎn)物的表達(dá)，具有顯著優(yōu)勢［6］.此外，λ 噬菌體啟動(dòng)子還具有作為代謝調(diào)控基因開關(guān)的潛在應(yīng)用價(jià)值［7］.本實(shí)驗(yàn)室通過引入溫度開關(guān)（λ 噬菌體啟動(dòng)子）改變原有菌株代謝途徑，使發(fā)酵前期獲得足夠的菌體量，再通過溫度調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)入后續(xù)發(fā)酵，將代謝產(chǎn)物D-乳酸的產(chǎn)量提高了66%，［8-9］.

因此，本研究通過將大腸桿菌葡萄糖脫氫酶基因（gcd）的啟動(dòng)子替換為λ 噬菌體啟動(dòng)子PL-PR，引入溫度誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，改變了酶合成表達(dá)的誘導(dǎo)方式；找出在此表達(dá)系統(tǒng)下菌株的最適生長溫度及葡萄糖脫氫酶的最適表達(dá)溫度.通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了相應(yīng)的發(fā)酵條件，為后續(xù)生物法發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持.

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株與質(zhì)粒見表1.

表1　菌株和質(zhì)粒Tab.1　Strains and plasmids used in this study

1.2引物列表

本實(shí)驗(yàn)所使用的引物見表2，序列中的下劃線部分為酶切位點(diǎn).

表2　引物序列Tab.2　Primer sequences

1.3試劑與培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶（Pst Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、XhoⅠ）、T4，DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs均購自TaKaRa公司；其他藥品和試劑均為分析純.

LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸出物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，用去離子水溶解并定容.1×105，Pa滅菌20，min.固體培養(yǎng)基加入2%，瓊脂.

M9培養(yǎng)基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 15.113，KH2PO43，NH4，Cl 1，NaCl 1，用去離子水溶解并定容.每升 M9 液體培養(yǎng)基補(bǔ)加1，mL 1，mol/L MgSO4和1，mL微量元素母液.微量元素母液成分（g/L）：FeCl3·6H2O 2.400，CoCl2·6H2O 0.300，CuCl2·2H2O 0.150，ZnCl20.300，Na2MoO4·2H2O 0.300，H3BO30.075，MnCl2·4H2O 0.495.

1.4葡萄糖脫氫酶基因gcd的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中大腸桿菌（E.coli）K12的gcd基因序列設(shè)計(jì)兩條特異性引物：Gcd-1與Gcd-2.提取E.coli K12的基因組DNA作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶基因序列.PCR反應(yīng)體系（50，μL）：基因組DNA 1，μL，10×buffer 5，μL，25，mmol/L dNTP 4，μL，LA Taq DNA聚合酶0.5，μL，10，mmol/L上、下游特異性引物各2，μL，ddH2O 37.5，μL.反應(yīng)條件：94，℃ 5，min；94，℃ 45，s，58，℃ 45，s，72，℃ 1，min，30個(gè)循環(huán)；72，℃ 10，min.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，與線性化的pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證.

1.5重組菌株的構(gòu)建

用引物pPL3和pPL4，并以質(zhì)粒pPL-Km為模板，按照上述PCR體系與條件擴(kuò)增得PL-PR啟動(dòng)子，回收純化PCR產(chǎn)物并用EcoR I和EcoR V雙酶切得到酶切產(chǎn)物（2.4，kbp）.以重組質(zhì)粒pMD19-T-gcd為模板，設(shè)計(jì)引物Gcd-3f和Gcd-4r，進(jìn)行反向PCR，PCR產(chǎn)物為3.5，kbp，并用T4多聚核苷酸激酶對其產(chǎn)物平末端磷酸化.將PL-PR啟動(dòng)子序列與反向PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCd：：Km-PL-PR，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，提取質(zhì)粒并用Pst Ⅰ酶切驗(yàn)證得到5.2，kbp和0.7，kbp兩條條帶.

用重組質(zhì)粒pGCd：：Km-PL-PR的質(zhì)粒DNA作為模板，以Gcd-1和Gcd-2為引物，利用上述反應(yīng)體系和條件（1.4部分）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出pGCd：：Km-PL-PR基因片段.電擊轉(zhuǎn)化（1，800，V，5，ms）含有輔助質(zhì)粒pKD46并經(jīng)2，mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的目的菌株 B0013-080C，在卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子.挑取陽性轉(zhuǎn)化子，以D-gcd1和D-gcd2為引物，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證.

1.6重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：Km-PL-PR的單菌落于50，mL LB培養(yǎng)基中，30，℃、200，r/min 培養(yǎng)過夜.以2%，的接種量接種于50，mL含有5，g/L葡萄糖的M9液體培養(yǎng)基中，以30，℃、200，r/min培養(yǎng)2，h后，以42，℃、200，r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4，h.8，000，r/min離心10，min，去除上清液，制成粗酶液，測定葡萄糖脫氫酶酶活.

1.7葡萄糖脫氫酶酶活測定［10］

D-Glucose+ox-PMS→D-glucono-5-lactone+

re-PMS

re-PMS+ox-DCIP→ox-PMS+re-DCIP氧化態(tài)的2，6-二氯靛酚（DCIP）溶液為藍(lán)色，在600，nm處有吸光度，而還原態(tài)的DCIP溶液為無色.因此當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，藍(lán)色會(huì)慢慢褪去，相應(yīng)的A600值會(huì)逐漸減小，通過A600值的變化對酶活進(jìn)行測定計(jì)算.

酶活單位（U）：25，℃條件下，在1，min內(nèi)能夠使1，μmol的葡萄糖氧化（或1，μmol DCIP還原）的酶量.

酶活測定：50，mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20，mmol/L葡萄糖，0.75，mmol/L PMS，0.75，mmol/L DCIP和10，μL適當(dāng)稀釋的酶液.將反應(yīng)試劑母液依次加入到1，cm比色皿中混合均勻，在25，℃下進(jìn)行反應(yīng)，開始計(jì)時(shí)，通過UV-9100型分光光度計(jì)讀取記錄下第1，min和3，min的A600.空白對照：50，mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20，mmol/L 葡萄糖，0.75，mmol/L吩嗪硫酸甲酯（PMS），0.75，mmol/L DCIP和10，μL去離子水.將反應(yīng)試劑母液依次加入到1，cm比色皿中混合均勻，在25，℃下進(jìn)行反應(yīng)，開始計(jì)時(shí)，通過UV-9100型分光光度計(jì)讀取記錄下第0，min和3，min的A600.酶活按照式（1）進(jìn)行計(jì)算.式中：A測定和A空白分別為600，nm下酶活測定和空白對照的吸光度；Vt為體系體積，2，mL；tmin為反應(yīng)時(shí)間，3，min；Vs為加入的酶液體積，0.02，mL；df為酶液稀釋倍數(shù).

1.8誘導(dǎo)條件對重組葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

1.8.1培養(yǎng)基碳源對重組葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

本文選用甘油和葡萄糖兩種常用碳源進(jìn)行對比分析，分別挑取菌株B0013-120/pKD46以及轉(zhuǎn)化子B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR的單菌落于50，mL LB液體培養(yǎng)基中，30，℃、200，r/min 培養(yǎng)過夜.以2%，的接種量接種于50，mL 分別以甘油（終質(zhì)量濃度為5，g/L）和葡萄糖（終質(zhì)量濃度為5，g/L）為唯一碳源的M9液體培養(yǎng)基中，30，℃、200，r/min 培養(yǎng)2，h后，以42，℃、200，r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4，h.8，000，r/min離心10，min收集菌體，測定葡萄糖脫氫酶酶活.

1.8.2誘導(dǎo)溫度對葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR按照1.8.1的培養(yǎng)方式進(jìn)行過夜培養(yǎng).以2%，的接種量接種于含有上述最佳碳源的50，mL M9 液體培養(yǎng)基中，30，℃、200，r/min培養(yǎng)至菌體密度為A600=1.0時(shí)，添加0.5%，酵母膏，分別在30、37、42，℃以及200，r/min誘導(dǎo)4，h后測定酶活.

1.8.3誘導(dǎo)前菌體密度對葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR按照1.8.2的培養(yǎng)方式培養(yǎng)至菌體密度分別為A600=1.0、1.3、1.6、2.0時(shí)，添加0.5%，的酵母膏于最佳誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)4，h.收集菌體，用ddH2O清洗菌體后，收集30，mL菌體，添加約1，mL ddH2O（使每管菌體菌體密度一致）混勻并添加終濃度5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，25，℃孵育30，min，測定酶活.

1.8.4誘導(dǎo)時(shí)間對葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

按上述最佳培養(yǎng)條件，分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR培養(yǎng)至最佳菌體密度，添加0.5%，的酵母膏，分別在最佳誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)1、2、3、4，h.收集菌體，用ddH2O清洗菌體后，收集30，mL菌體，添加約1，mL ddH2O（使每管菌體菌體密度一致）混勻并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，25，℃孵育30，min.測定酶活.

1.9葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.9.1葡萄糖脫氫酶的最適反應(yīng)溫度

制備粗酶液并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，分別于15、20、25、30、35、42、50，℃孵育30，min.測定酶活，確定其最適反應(yīng)溫度.

1.9.2葡萄糖脫氫酶的熱穩(wěn)定性

將粗酶液分別于45、50、55、60、65，℃水浴鍋中進(jìn)行孵育，每10，min取樣1次，立即置于冰上2，min，室溫恢復(fù)30，min.測定酶活.

1.9.3葡萄糖脫氫酶的最適反應(yīng)pH

制備粗酶液并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，于25，℃孵育30，min.分別在pH 為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖體系（0.2，mol/L磷酸二氫鈉和0.3，mol/L磷酸氫二鈉緩沖液）中測定酶活，分析其最適反應(yīng)pH.

2　結(jié)果與分析

2.1重組菌株的構(gòu)建

按照1.3、1.4的方法擴(kuò)增出完整的gcd基因序列，經(jīng)過凝膠電泳檢測在0.9，kbp左右有明顯條帶（圖1），與gcd序列大小一致.

圖1　 gcd基因的PCR產(chǎn)物Fig.1　Products of gene gcd after PCR

擴(kuò)增出PL-PR啟動(dòng)子與卡那霉素抗性基因的序列經(jīng)電泳檢測，在約3.5，kbp有明顯條帶，大小相符.將兩段序列進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，獲得含有卡那霉素抗性序列的重組質(zhì)粒pGCd：：Km-PL-PR，PstⅠ酶切條帶為0.7，kbp和5.2，kbp.以該重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出大小為3.2，kbp的pGCd：：Km-PL-PR基因片段.將該片段電轉(zhuǎn)至菌株B0013-120/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中，從而得到重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR.提取該菌株的染色體，以引物D-gcd1和Gcd-2進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到3.2，kbp的目的條帶，如圖2所示.

圖2　重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR的 PCR驗(yàn)證Fig.2　PCR verification of the recombined vector B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR

2.2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

按照1.5的誘導(dǎo)方法，將得到的重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR與原始菌株B0013-120/ pKD46轉(zhuǎn)接搖瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)后，分別測定其酶活，發(fā)現(xiàn)對照菌和重組菌的酶活分別為（52±2）U/mL、（63±6）U/mL（圖3）.

圖3　 重組菌的葡萄糖脫氫酶酶活Fig.3　Assay of the enzymatic activity of the engineered strains

在相同條件下，重組菌酶活力高于原始菌酶活力.這是因?yàn)橹亟M菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR使用溫控開關(guān)替換了原始啟動(dòng)子，pPL451 具有λ噬菌體啟動(dòng)子PL和PR，在低溫（28～30，℃）下生長時(shí)，cIts857基因表達(dá)的λ抑制物可以抑制該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)細(xì)胞生長至適宜菌體濃度時(shí)，進(jìn)行42，℃培養(yǎng)可使λ抑制物快速失活.從而啟動(dòng)子恢復(fù)轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)而表達(dá)蛋白.

2.3誘導(dǎo)條件對重組葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響

培養(yǎng)基中豐富的營養(yǎng)供給對細(xì)胞生長極為有利，使誘導(dǎo)前細(xì)胞密度達(dá)到一個(gè)較高值，可為溫度誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)奠定良好的基礎(chǔ).此外，mPQQGDH作為一種膜蛋白，其表達(dá)量在一定程度上與菌體密度成正相關(guān)，因此提高菌體密度有利于膜蛋白產(chǎn)量的提高.M9培養(yǎng)基作為mPQQGDH的表達(dá)培養(yǎng)基，其氮源和微量元素非常豐富，但需要外源添加碳源.

分別以10%，甘油和葡萄糖作為碳源，它們對重組菌內(nèi)葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響如圖4所示.從圖4可以看出，重組菌株在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中葡萄糖脫氫酶的表達(dá)量較葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基的高17，U/mL，表明甘油更適合作為重組菌表達(dá)的培養(yǎng)基碳源.

圖4　 碳源對葡萄糖脫氫酶酶活的影響Fig.4　Influence of carbon sources on the enzymatic activity

以10%，甘油作為碳源，分別在30、37、42，℃的條件下對重組菌和原始菌進(jìn)行誘導(dǎo)，比較誘導(dǎo)溫度對葡萄糖脫氫酶表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示.30，℃誘導(dǎo)時(shí)，重組菌的酶活反而低于原始菌，37，℃誘導(dǎo)時(shí)，重組菌與原始菌的酶活差別不大，而42，℃誘導(dǎo)時(shí)，重組菌酶活為60，U/mL大于原始菌的酶活47，U/mL.這說明42，℃是重組菌的最適誘導(dǎo)溫度.

分別將原始菌和重組菌轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)至菌體密度分別達(dá)到A600=1.0、1.3、1.6、2.0時(shí)，在42，℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)后，分別測定其酶活，結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，在菌體密度為A600=1.6時(shí)，蛋白表達(dá)量最高.其原因可能是菌體密度達(dá)到一定程度時(shí)膜蛋白表達(dá)較高，但菌體密度過高的情況下，菌體老化等原因可能會(huì)對細(xì)胞有一定的毒害作用.因此，選取菌體密度為A600=1.6時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo).

圖5　 誘導(dǎo)溫度對酶活的影響Fig.5　Influence of induction temperature on the enzymatic activity

圖6　 誘導(dǎo)前菌體密度對酶活的影響Fig.6　Influence of optical density before induction on the enzymatic activity

分別將原始菌和重組菌轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)至菌體密度分別達(dá)到A600=1.6時(shí)，在42，℃條件下誘導(dǎo)1、2、3、4，h后，測定其酶活，其結(jié)果如圖7所示.誘導(dǎo)時(shí)間為4，h時(shí)，酶活力最高.因此，選取誘導(dǎo)時(shí)間為4，h，以得到最高產(chǎn)酶量.

圖7　 誘導(dǎo)時(shí)間對酶活的影響Fig.7　Influence of induction time on the enzymatic activity

誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間對重組蛋白的大量表達(dá)也有很大的影響.在升溫誘導(dǎo)的后期，重組蛋白的大量表達(dá)和高溫誘導(dǎo)條件下的熱誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生熱休克蛋白（37，℃條件即可產(chǎn)生）［11］.而這些熱休克蛋白中含有許多蛋白水解酶［12］，會(huì)降解部分重組蛋白，從而使得升溫誘導(dǎo)一段時(shí)間后mPQQGDH的活性下降.持續(xù)的高溫誘導(dǎo)和重組蛋白的大量表達(dá)除了促進(jìn)包涵體形成之外，也會(huì)引起大腸桿菌的應(yīng)急反應(yīng)（SOS response）.這種應(yīng)急反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)宿主菌表達(dá)Rec-A蛋白［13］，它會(huì)和溫度起到協(xié)同作用共同裂解cIts857阻遏蛋白，進(jìn)一步促使PL-PR啟動(dòng)子的高效轉(zhuǎn)錄.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，在42，℃的溫度條件下誘導(dǎo)4，h，能得到酶活較高的mPQQGDH.

2.4葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1葡萄糖脫氫酶的最適孵育溫度

在不同的溫度（15、20、25、30、35、42、50，℃）下測定酶活，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖8所示.結(jié)果表明：葡萄糖脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為25，℃.

圖8　 孵育溫度對相對酶活的影響Fig.8　Influence of incubation temperature on the relative enzymatic activity

2.4.2葡萄糖脫氫酶的熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性的研究表明（圖9），mPQQGDH在45，℃條件下比較穩(wěn)定，而在55，℃條件下半衰期為20，min，在65，℃、20，min酶活力僅為6，U/mL，而75，℃可直接導(dǎo)致酶的失活.與吡咯喹啉醌型水溶性葡萄糖脫氫酶（sPQQGDH）一樣，具有熱穩(wěn)定性差的特點(diǎn).后續(xù)研究中可以采用定點(diǎn)突變等方法提高其熱穩(wěn)定性.比如，Sode等［14］利用linker將PQQGDH-B的兩個(gè)亞基連起來，使該酶在55，℃孵育20，min后殘留的酶活提高了1倍，達(dá)到40%，以上.

2.4.3葡萄糖脫氫酶的最適測定pH

將葡萄糖脫氫酶粗酶液分別在不同pH的緩沖體系中測定酶活，以pH為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖10所示，葡萄糖脫氫酶的最適測定pH為6.0.

圖9　 酶的熱穩(wěn)定性Fig.9　Thermal stability of the enzyme

圖10　 pH對相對酶活的影響Fig.10　Influence of pH on the relative enzymatic activity

3　結(jié) 語

由于大腸桿菌具有遺傳背景清楚、表達(dá)體系穩(wěn)定以及大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，常用作外源基因表達(dá)的高效宿主，也是獲得外源基因穩(wěn)定高效表達(dá)的較好選擇.IPTG是tac啟動(dòng)子常用的誘導(dǎo)物，但其具有毒性且價(jià)格昂貴，不適用于工業(yè)化生產(chǎn).本文利用溫敏型啟動(dòng)子PL-PR替換葡萄糖脫氫酶原有的啟動(dòng)子，通過溫度的變化對其進(jìn)行誘導(dǎo)控制，節(jié)省了添加誘導(dǎo)劑的成本及步驟，使發(fā)酵過程更簡便.此外，優(yōu)化了搖瓶發(fā)酵條件并研究了葡萄糖脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)，這為其工業(yè)化生產(chǎn)及更廣泛的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)：

［1］ Duine J A，F(xiàn)rank J，Van der Meet R. Different forms of quinoprotein aldose-（glucose-）dehydrogenase in Acinetobacter calcoaceticus［J］. Archives of Microbiology，1982，131（1）：27-31.

［2］ Bilen H，Kilicaslan A，Akcay G，et al. Performance of glucose dehydrogenase（GDH）based and glucose oxi-dase（GOX）based blood glucose meter systems at moderately high altitude［J］. Journal of Medical Engineering and Technology，2007，31（2）：152-156.

［3］ Zhang M，Mullens C，Gorski W. Coimmobilization of dehydrogenases and their cofactors in electrochemical biosensors［J］. Analytical Chemistry，2007，79（6）：2446-2450.

［4］ 夏江東，程在全，季鵬章，等. 高等植物啟動(dòng)子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：7-14.

［5］ Love C A，Lilley P E，Dixon N E. Stable high-copynumber bacteriophage λ promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli［J］. Gene，1996，176（1）：49-53.

［6］ Makrides S C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli［J］. Microbiological Reviews，1996，60（3）：512-538.

［7］ Ptashne M. A genetic switch：Phage ［lambda］ and higher organisms［M］. 2nd ed. Cambridge：Cell Press，1992：11.

［8］ Tian K M，Chen X Z，Shen W，et al. High-efficiency conversion of glycerol to D-lactic acid with metabolically engineered Escherichia coli［J］. African Journal of Biotechnology，2012，11（21）：4860-4867.

［9］ Zhou L，Tian K M，Niu D D，et al. Improvement of D-lactate productivity in recombinant Escherichia coli by coupling production with growth［J］. Biotechnology Letters，2012，34（6）：1123-1130.

［10］Koji S，Hiroyuki S. Glu742 substitution to Lys enhances the EDTA tolerance of Escherichia coli PQQ glucose dehydrogenase［J］. Biotechnology Letters，1994，16（5）：455-460.

［11］Guisbert E，Yura T，Rhodius VA，et al. Convergence of molecular，modeling，and systems approaches for an understanding of the Escherichia coli heat shock response ［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2008，72（3）：545-554.

［12］Rosen R，Ron E Z. Proteome analysis in the study of the bacterial heat-shock response［J］. Mass Spectrometry Reviews，2002，21（4）：244-265.

［13］Liveris D，Mulay V，Schwartz I. Functional properties of Borrelia burgdorferi recA［J］. Bacteriology，2004，186（8）：2275-2280.

［14］Sode K，Shirahane M，Yoshida H. Construction and characterization of a linked-dimeric pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase［J］. Biotechnology Letters，1999，21（8）：707-710.

責(zé)任編輯：郎婧

Construction of a Recombined Bacterium for the Thermo-regulated Expression of Glucose Dehydrogenase and the Optimization of the Fermentation Process

LI Yang，ZHANG Zhimeng，DONG Zixing，WANG Zhengxiang，LU Fuping

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Membrane-bound pyrroloquinoline quinine-dependent glucose dehydrogenase（mPQQGDH，EC1.1.5.2）is a significant kind of oxidoreductase，and has received considerable attention for its wide application in the fields of clinical diagnosis and industrial glucose sensors.However，the low expression level limits its mass industrial production and application scope.In this study，temperature sensitive promoter PL-PRwas used to replace the promoter of mPQQGDH，resulting in a recombined bacterium E.coli B0013-120/pGCd：：Km-PL-PRwhose glucose dehydrogenase activity was 21.2%， higher than that of the original strain.Subsequently，the fermentation conditions were optimized to determine the suitable carbon source，induction temperature，optical density before induction and the induction time for the expression of mPQQGDH. Finally，by characterizing the enzymatic properties of this enzyme，the temperature and pH optima were determined to be 25，℃ and 6.0，respectively，and this enzyme was stable at 45，℃.These results can lay a solid foundation for the wider range of application and industrial production of mPQQGDH.

Key words：glucose dehydrogenase；temperature sensitive promoter；overexpression；fermentation process optimization

中圖分類號：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-6510（2016）02-0013-07

收稿日期：2015-05-06；修回日期：2015-06-02

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2013AA102106-07）

作者簡介：李 楊（1988—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150057