表皮生長(zhǎng)因子受體及其Ⅲ型突變體在人食管癌的表達(dá)及意義

朱彥紅，韓大正

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南開(kāi)封475001）

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表皮生長(zhǎng)因子受體及其Ⅲ型突變體在人食管癌的表達(dá)及意義

朱彥紅，韓大正

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南開(kāi)封475001）

摘要：目的檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）及表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體（EGFRvⅢ）在人食管癌組織中的表達(dá)，探討其與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其與各臨床病理特征之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)染色法（MaxvisionTM二步法）檢測(cè)食管癌組織及正常食管組織中EGFR和EGFRvⅢ蛋白的表達(dá)水平，并將檢測(cè)結(jié)果與臨床病理參數(shù)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果食管癌組織EGFR和EGFRvⅢ的表達(dá)率分別為65.6%、58.5%，正常食管黏膜EGFR和EGFRvⅢ表達(dá)率為30.0%、0%。EGFR在食管癌組織的表達(dá)明顯高于正常食管組織（P＜0.01），EGFRvⅢ在正常食管黏膜不表達(dá)。二者在食管癌組織的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小和生長(zhǎng)部位均無(wú)相關(guān)（P＞0.05），與食管癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論EGFR、EGFRvⅢ過(guò)度表達(dá)可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EGFR、EGFRvⅢ有望作為預(yù)測(cè)食管癌預(yù)后的候選基因，EGFRvⅢ在食管癌組織中特異性表達(dá)，可能使其成為食管癌治療的理想的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：表皮生長(zhǎng)因子受體；表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體；食管癌；免疫組織化學(xué)

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，全世界每年大約有30萬(wàn)人死于食管癌，中國(guó)為高發(fā)區(qū)，死亡率每年約15萬(wàn)人，嚴(yán)重危害人類的生命健康。流行病學(xué)資料顯示食管癌的人群分布與年齡、性別、職業(yè)、種族、地理生活環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣、遺傳易感性等有一定聯(lián)系。不典型的早期癥狀使患者得到早期診斷成為一個(gè)難題，雖然給予積極的臨床治療，但食管癌患者和其他消化道腫瘤患者一樣，大部分死于轉(zhuǎn)移或者腫瘤的復(fù)發(fā)。因此研究食管癌的發(fā)病機(jī)制造有著重大意義。目前對(duì)于表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvIII）在食管癌中的表達(dá)情況和相關(guān)性研究報(bào)道并不多。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌患者腫瘤組織中EGFR、EGFRvⅢ表達(dá)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以期為食管癌患者預(yù)后、綜合性的個(gè)體化治療方案的制定及分子靶向治療提供有力的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

研究組58份食管癌組織標(biāo)本來(lái)源于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年6月-2013年12月經(jīng)食管-胃-十二指腸鏡活檢標(biāo)本，并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中，男性38例，女性20例；年齡37～83歲，中位年齡64歲。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療和免疫治療。另外取20份正常食管黏膜組織標(biāo)本（來(lái)源于同時(shí)期接受內(nèi)鏡檢查活檢的非食管癌病例）作為對(duì)照組。

1.2試劑

Rabbit Anti-EGFR（濃縮型）、Rabbit Anti-EGFRvⅢ（濃縮型）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxvisionTM2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3方法

組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋后，連續(xù)切片3張，厚4μm，1份作HE染色，1份作EGFRvⅢ免疫組織化學(xué)染色，1份作EGFR免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用MaxvisionTM二步方法，所有標(biāo)本在同一條件下染色、DAB顯色（滴加一抗?jié)舛葹?∶600），選用公司提供的已知EGFRvⅢ、EGFR陽(yáng)性表達(dá)的食管癌切片在同一條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組織化學(xué)MaxvisionTM二步方法：①65℃烤片4 h。②石蠟切片脫蠟和水化。③PBS液沖洗3次，每次3 min。④抗原修復(fù)：浸泡于枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，高壓鍋中煮沸2 min，放至室溫后用蒸餾水沖洗2 min。⑤室溫下浸泡于3%H2O2中10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。⑥PBS沖洗，3 min×3次。⑦每張切片滴加1滴適當(dāng)濃度的一抗Rabbit Anti-EGFR或一抗Rabbit Anti-EGFRvⅢ試劑，室溫下孵育2 h。⑧PBS沖洗，2 min×3次。⑨每張切片滴加1滴即用型MaxvisionTM2試劑，室溫下孵育30 min。⑩PBS沖洗，3 min×3次。11除去PBS液，每張切片滴加2滴配置后的DAB顯色液，室溫25℃顯色，顯微鏡下觀察3～5 min，蒸餾水洗滌。12自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)。13脫水，透明，封片。

1.4結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果觀察，采用雙盲法，由2位病理科醫(yī)生在不知臨床資料的情況下讀片，在全切片的上、下、左、右中隨機(jī)選取一個(gè)400倍視野，觀察5個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)不少于1 000個(gè)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分為：陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜5%為陰性（-）；5% ～24%為弱陽(yáng)性（+）；25%～50%為中度陽(yáng)性（++）；＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間分析用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EGFR、EGFRvⅢ在食管癌和正常組織的陽(yáng)性表達(dá)

正常食管黏膜組織的EGFRvⅢ無(wú)陽(yáng)性染色（見(jiàn)圖1），EGFR的陽(yáng)性染色主要位于基底膜，呈棕色或棕褐色沉淀，點(diǎn)片狀分布（見(jiàn)圖2）；食管癌組織的EGFR表達(dá)和EGFRvⅢ陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞膜，呈棕色或棕褐色沉淀，點(diǎn)片狀分布，胞漿也可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核無(wú)染色（見(jiàn)圖3、4）。食管癌組織EGFR表達(dá)的陽(yáng)性率為65.6%（38/58），正常組織EGFR陽(yáng)性率30.0%（6/20），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05）。食管癌組織EGFRvⅢ陽(yáng)性率為58.5%（34/58），正常組織陽(yáng)性率為0%（0/20），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

圖1　正常食管黏膜組織的EGFRvⅢ陰性表達(dá)（×400）

圖2　正常食管黏膜組織的EGFR陽(yáng)性表達(dá)（×400）

圖3　食管癌組織的EGFRvⅢ陽(yáng)性表達(dá)（×400）

圖4　食管癌組織的EGFR陽(yáng)性表達(dá)（×400）

表1　正常食管黏膜組織和食管癌組織中EGFR和EGFRvIII表達(dá)

2.2EGFR、EGFRvⅢ與臨床病理特征的關(guān)系

EGFR和EGFRvIII在食管癌組織的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小和生長(zhǎng)部位均無(wú)相關(guān)（P＞0.05），與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2　EGFR和EGFRvⅢ表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2

3　討論

EGFR是原癌基因c-erbB-1（HE-1）的表達(dá)產(chǎn)物，是相對(duì)分子量為170×103的跨膜受體蛋白。研究表明EGFR在與其配體結(jié)合后可以引起細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化，在正常的細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。EGFR的活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，以及抑制細(xì)胞凋亡。

目前已知EGFRvⅢ有3種突變體，即EGFRvⅠ、EGFRv、EGFRvⅢ，其中，EGFRvⅢ是EGFR最常見(jiàn)的刪除突變型EGF受體。相對(duì)于EGFR而言，EGFRvIII基因中有801個(gè)堿基對(duì)被刪除，導(dǎo)致胞外區(qū)6～273位氨基的缺失，而在融合交點(diǎn)新產(chǎn)生一個(gè)甘氨酸，導(dǎo)致受體不依賴于配體的組成性激活［1］，從而誘發(fā)細(xì)胞的異常增殖、腫瘤的發(fā)生。

本研究中作者發(fā)現(xiàn)，EGFR和EGFRvⅢ在食管癌的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、生長(zhǎng)部位無(wú)相關(guān)（P＞0.05）。隨著細(xì)胞分化程度的降低，EGFR 和EGFRvⅢ的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，表明腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，EGFR和EGFRvⅢ表達(dá)也越強(qiáng)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中EGFR和EGFRvⅢ陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；伴有遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移的食管癌的EGFR及EGFRvⅢ表達(dá)明顯高于無(wú)遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期食癌患者的EGFR、EGFRvⅢ陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于臨床分期Ⅰ期和Ⅱ期者（P＜0.05）。這表明EGFR和EGFRvⅢ被激活并參與食管癌的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并隨著腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)和病情的進(jìn)展，EGFR和EGFRvⅢ表達(dá)也越強(qiáng)；隨著浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)和病情的進(jìn)展，EGFR表達(dá)也增強(qiáng)，且EGFR過(guò)度表達(dá)組的食管癌患者預(yù)后明顯較對(duì)照組為差；Zhang等［2］研究發(fā)現(xiàn)EGFR高表達(dá)的食管癌，其生存率低于低表達(dá)，EGFR可以作為食管癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)；王建正等［3］研究也發(fā)現(xiàn)EGFR的高表達(dá)可能參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可作為預(yù)測(cè)食管癌預(yù)后的重要指標(biāo)；王玉峰等［4］、Wang［5］等研究發(fā)現(xiàn)EGFR過(guò)表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。劉敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)EGFRvⅢ在食管癌特異性表達(dá)，EGFR與EGFRvⅢ與食管癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。這與該研究結(jié)果一致。另外在其他一些腫瘤的研究中，如楊永濱等［7］在乳腺癌的研究中認(rèn)為EGFRvⅢ可能參與乳腺癌的發(fā)生，可能在乳腺癌的浸潤(rùn)過(guò)程中起重要作用；蔣艷霞等［8］在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)EGFR可以作為新的預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床靶向治療的重要因子，為肝癌的基因治療提供理論依據(jù)?？梢酝茰y(cè)，EGFR、EGFRvⅢ的表達(dá)是食管癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷，建立食管癌發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，可作為手術(shù)切除后預(yù)測(cè)食管癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)。

EGFRvⅢ很早就被認(rèn)為是一種腫瘤特異性表達(dá)EGFR突變體，在胚胎、神經(jīng)等正常組織中不能檢出。目前已有很多研究提示在人類腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到EGFRvⅢ，如人腎透明細(xì)胞癌［9］、乳腺癌［6］及胃癌［10］等。本研究中作者發(fā)現(xiàn)，EGFRvⅢ在正常組織陽(yáng)性染色率為0%，而在食管癌組織中陽(yáng)性染色率為58.6%，提示EGFRvⅢ在正常組織中不表達(dá)，而在食管癌組織中特異性表達(dá)。這與劉敏等［11］在食管癌中的研究及樊平等［12］在胃癌的研究結(jié)果相類似。EGFRvⅢ在正常組織不表達(dá)，而在腫瘤組織中特異表達(dá)，這可能使其成為抗癌治療的理想靶點(diǎn)。

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（申海菊 編輯）

Expressions of EGFR and EGFR variantⅢin human esophageal carcinoma and their significance

Yan-hong Zhu，Da-zheng Han
（Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）

Abstract:Objective To detect expression of epidermal growth factor receptor（EGFR）and epidermal growth factor receptor variantⅢ（EGFRvⅢ）in human esophageal carcinoma and to explore its relation with the genesis and development of human esophageal cancer and its relationship with clinicopathological parameters. Methods Immunohistochemistry（MaxvisionTM2）was used to detect the expressions of EGFR and EGFRvⅢprotein in human esophageal cancer tissues of 58 cases and normal esophageal tissue specimens from 20 non-cancer patients. Results Positive expression rates of EGFR and EGFRvⅢin the human esophageal cancer tissues（65.6%and 58.5%respectively）were higher than those of the normal gastric tissues（30.0%and 0%，P＜0.01）. EGFRvⅢwas not expressed in the normal esophageal tissue. Their expressions were irrelated with gender，age，tomor size or tumor location（P＞0.05）；but were closely related with the degree of differentiation，lymph node metastasis，distant metastasis and clinical stages of esophageal cancer patients（P＜0.05）. Conclusions Over-expression of EGFR and EGFRvⅢmay be closely related to initiation and progression of esophageal cancer. EGFR and EGFRvⅢcould be considered as the markers for predicting the prognosis of human esophageal cancer. And the specific expression of EGFRvⅢin esophageal carcinoma can make it the ideal target of treatment of esophageal carcinoma.

Keywords:EGFR；EGFRvⅢ；esophageal cancer；immunohistochemistry

中圖分類號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.006

文章編號(hào)：1005-8982（2016）07-0024-05

收稿日期：2015-06-10

［通信作者］韓大正，E-mail：hdyfyzyh@126.com；Tel：0371-25661617