長爪沙鼠肝星狀細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

樓 琦，李 巍，石巧娟，盧領(lǐng)群，郭紅剛，杜江濤，薩曉嬰（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，杭州 310010）

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長爪沙鼠肝星狀細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

樓 琦，李 巍，石巧娟，盧領(lǐng)群，郭紅剛，杜江濤，薩曉嬰
（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，杭州 310010）

【摘要】目的 探索長爪沙鼠穩(wěn)定、經(jīng)濟的肝星狀細胞分離和培養(yǎng)方法，為深入探討長爪沙鼠肝纖維化的細胞機制提供技術(shù)支撐。方法 取成年雄性長爪沙鼠，用鏈蛋白酶、膠原酶及DNA酶體內(nèi)門靜脈灌注消化長爪沙鼠肝臟細胞，經(jīng)Nycodenz密度梯度離心，分離肝星狀細胞。臺盼藍拒染實驗鑒定細胞活力，α-SMA，Desmin免疫細胞化學(xué)染色鑒定細胞性質(zhì)。結(jié)果 肝星狀細胞得率為0. 5～1×107/肝。肝星狀細胞存活率在90%以上。原代培養(yǎng)3 d α-SMA陽性細胞達75%以上，傳代培養(yǎng)后，α-SMA，Desmin陽性達100%。結(jié)論 成功建立了穩(wěn)定可靠的長爪沙鼠肝星狀細胞分離培養(yǎng)方法，為肝臟相關(guān)疾病研究和防治藥物的開發(fā)提供了技術(shù)支持。

【關(guān)鍵詞】長爪沙鼠；肝星狀細胞；細胞分離；原代培養(yǎng)

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC），又稱儲脂細胞（fat-store cell，F(xiàn)SC）、間質(zhì)細胞和Ito細胞，主要分布于肝細胞與肝竇內(nèi)皮細胞之間的竇周隙內(nèi)（Disse間隙）［1－2］。HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有核心作用，是促進肝纖維化發(fā)展的主要因素［3］。靜息狀態(tài)的HSC主要參與維生素A的代謝調(diào)節(jié)，當(dāng)肝臟受到化學(xué)、物理及生物因素刺激而發(fā)生損傷后，HSC發(fā)生增殖并被活化，合成以膠原蛋白為主的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）及各類細胞因子如MMPs、TNF-α等，參與受損肝組織的修復(fù)。刺激持續(xù)發(fā)生時，HSC大量激活，引發(fā)ECM的合成與降解失衡，進而導(dǎo)致肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常沉積，發(fā)生肝纖維化［4］。

長爪沙鼠在單純高脂飲食喂養(yǎng)下，可發(fā)生非酒精性脂肪肝系列病變。在經(jīng)歷了纖維化［5－8］發(fā)展的經(jīng)典模式“膠原帶-橋接纖維化-假小葉”后，最終可形成肝硬化［9］，其疾病譜與人類脂肪肝極為接近［10］。因此長爪沙鼠是肝纖維化研究方面很有價值的模型動物。HSC已成為國內(nèi)外學(xué)者研究肝纖維化的熱點［11－12］，建立穩(wěn)定、經(jīng)濟的分離和培養(yǎng)HSC方法是研究肝纖維化的基礎(chǔ)。目前針對大、小鼠分離培養(yǎng)HSC的方法已經(jīng)較為成熟［13－15］，但是國內(nèi)尚無關(guān)于長爪沙鼠HSC的研究，而國外也尚未建立完善的培養(yǎng)體系。本文旨在Friedman等的基礎(chǔ)上進行改良，建立適合長爪沙鼠肝星狀細胞的培養(yǎng)體系，為從細胞和分子水平進一步研究長爪沙鼠肝纖維化形成的機制奠定堅實的基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1動物準(zhǔn)備

雄性長爪沙鼠，浙江省實驗動物中心提供【SCXK（浙）2014－0001】，實驗在本中心進行【SYXK（浙）2014－0008】體重50～70 g，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，正常飲水。在分離HSCs前2周每天V itamin A 20 U/ 10 g體重灌胃［16－17］。

1.1.2主要試劑

鏈霉蛋白酶E（Pronase E），IV型膠原酶（TypeIV collagenase），DNase、Nycodenz、6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。Hank’s液為自配溶液。封閉用羊血清、羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記卵裂白霉素為中國北京中杉金橋公司生產(chǎn)。兔抗Desmin、α-SMA一抗購自美國Santa Cruz公司。異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，Cy3偶聯(lián)的羊抗兔IgG均購自美國Chemicon公司。

1.1.3主要儀器

正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）、超速離心機（BECKMAN COULTER，J-26 XPI）、普通倒置顯微鏡（Nicon TS100）、CO2培養(yǎng)箱（Forma Sceitific）、潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1肝星狀細胞的分離制備

肝星狀細胞的分離采用改良的Friedman方法，長爪沙鼠術(shù)前禁食8 h，自由飲水。用水合氯醛（400 mg/ kg）腹腔內(nèi)注射麻醉長爪沙鼠。胸腹部剃毛，皮膚消毒。仰臥位固定，大十字開腹，上至劍突，下至恥骨聯(lián)合，左右至兩側(cè)腋中線。皮瓣外翻固定擴創(chuàng)，顯露腹腔所有臟器。將小腸翻至鼠體左側(cè)，游離肝臟，在右腎靜脈上方游離肝下下腔靜脈。下壓肝臟剪斷鐮狀韌帶至肝上下腔靜脈。游離腹主動脈，穿刺針穿刺，注入4℃Hank’s液（內(nèi)含肝素25 U/ mL）20 mL，夾閉胸主動脈同時切開肝下下腔靜脈與破心，盡量將肝臟內(nèi)淤積的紅細胞沖出。待肝臟顏色變成土黃色時，結(jié)扎肝上下腔靜脈，行門靜脈插管固定，取下肝臟，沖洗肝臟表面。4℃Hank’s液20 mL行門靜脈灌注肝臟，完成后肝臟移入37℃水浴中的250 mL燒杯，繼續(xù)循環(huán)灌注預(yù)溫至37℃的聯(lián)合酶液50 mL（含0. 05%鏈酶蛋白酶、0. 1%膠原酶及0. 001%DNAse），消化肝臟10 min。在培養(yǎng)皿中去除肝包膜和Glisson鞘。將肝臟粉碎成糊狀，放入含0. 05%鏈酶蛋白酶、0. 1%膠原酶、0. 001%DNaseI（V/ V）的Hank’s中，37℃水浴用鑷子攪拌10～15 min，使肝組織充分消化。在消化好的肝組織中加入50 mL 4℃Hank’s液，用100目鋼絲篩過濾。濾過的肝組織裝入50 mL離心管中，加Hank’s液至50 mL，1815 r/ min離心10 min。取沉淀重懸于50 mL Hank’s液中，再次1815 r/ min離心10 min。取沉淀加Hank’s液5 mL重懸，吸取1 mL置于10 mL玻璃離心管中，加入1. 5 mL的20%Nycodenz液混勻，按此比例分裝完全部沉淀，每管液面覆蓋2 mL Hank’s液，2400 r/ min，4℃離心18 min，輕輕取出，不要搖動液面，可見在Hank’s液下有一混濁帶。用16號針頭插入液面下此處抽吸混濁帶于10 mL離心管。加DMEM培養(yǎng)液，1924 r/ min離心10 min，沉淀重懸于10 mL左右DMEM培養(yǎng)液中，加入10%胎牛血清。細胞計數(shù)并且行臺盼藍拒染試驗，判斷活力。

1.2.2細胞培養(yǎng)

將細胞以1×105～1×106mL的密度接種到50 mL細胞培養(yǎng)液中，在37℃、體積分數(shù)為5%CO2、95%潮濕空氣的CO2恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。培養(yǎng)1 d后首次換液，以后視情況每2～3 d換液一次。做免疫細胞化學(xué)檢測時，可將細胞接種于內(nèi)有玻片的6孔板中。當(dāng)細胞融合度達到80%～90%左右可進行傳代。傳代時按常規(guī)使用0. 125%胰酶消化。

1.2.3細胞鑒定

細胞活力測定：吸取180 μL細胞懸液置于載玻片上，加入20 μL 0. 4%的臺盼藍溶液，混勻并在顯微鏡下觀察細胞。未被臺盼藍染色者為活細胞。光鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)，計算細胞得率及存活率。

細胞性質(zhì)鑒定：（1）熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)激發(fā)波長為325 nm時出現(xiàn)的自發(fā)熒光細胞即為分離的肝星狀細胞，用DAPI復(fù)染。（2）細胞爬片用油紅O直接染色45 min，雙蒸水漂洗后用蘇木素染細胞核，2 min后用雙蒸水清洗，鏡下觀察。（3）細胞爬片經(jīng)固定，PBS清洗，羊血清封閉，用兔抗α-SMA一抗，聯(lián)合羊抗兔IgG（二抗）及HRP標(biāo)記卵裂白霉素（三抗），進行DAB法免疫細胞化學(xué)染色。另有細胞爬片經(jīng)固定、PBS清洗、羊血清封閉，用兔抗Desmin （α-SMA）一抗，Cy3（FITC）熒光標(biāo)記二抗孵育后，DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察分析［19］。

2　結(jié)果

2.1HSC的存活率與收率

采用Nycodenz密度梯度離心法分離長爪沙鼠HSC，長爪沙鼠平均體重為60 g，每只鼠肝的細胞收率約為（0. 5～1）×107個。根據(jù)臺盼藍拒染試驗，細胞活力為（98. 6）%。

2.2HSC的形態(tài)觀察

在普通光學(xué)倒置顯微鏡下觀察，新鮮分離的HSC由于富含脂滴，具有很強的折光性，呈現(xiàn)透亮、立體感較強的小圓球狀（圖1）。細胞在325 nm波長紫外光的激發(fā)下自發(fā)綠色熒光（圖6）。細胞在接種后30～60 min出現(xiàn)貼壁，培養(yǎng)24 h后85%細胞貼壁（圖2），72 h貼壁細胞呈現(xiàn)出梭形，多邊形（圖3），普通光鏡下觀察油紅染色結(jié)果表明，紅色脂滴主要分布于胞漿內(nèi)（圖4）。5～7 d后，細胞繼續(xù)伸展，絕大多數(shù)細胞呈星形，部分細胞出現(xiàn)片狀融合（圖5）；10～11 d左右融合達到80%～90%，細胞鋪滿瓶底可以傳代。傳代后1 d細胞表現(xiàn)為活化表型。

2.3HSC鑒定

圖1　長爪沙鼠HSCs原代培養(yǎng)2h貼壁，含折光顆粒的HSC（×10）Fig. 1 Gerbils hepatic stellate cells in primary culture，adherence happened in 2 hours，including the refractive index particles HSC（×10）

圖2　長爪沙鼠HSCs原代培養(yǎng)24h生長狀況（×20）Fig. 2 Gerbils hepatic stellate cells’growth status in primary culture for in 24 hours（×20）

圖3　長爪沙鼠HSCs原代培養(yǎng)3 d呈局灶性生長（×20）Fig. 3 Gerbils hepatic stellate cells’focal growth status in primary culture for in 3 days（×20）

免疫細胞化學(xué)檢測顯示，貼壁24 h的α-平滑肌動蛋白（α-SMA）呈陰性，原代培養(yǎng)3 d后，α-SMA陽性率為75%（圖7）。肝星狀細胞消化傳代后，細胞表現(xiàn)為活化狀態(tài)，免疫熒光檢測顯示Desmin（圖8）和α-SMA（圖9）陽性染色達到100%，胞漿呈顆粒狀或彌漫著色。

圖4　長爪沙鼠HSCs培養(yǎng)至第3天行油紅染色（×20）Fig. 4 Gerbils hepatic stellate cells in primary culture for in 3 days，oil red O staining（×20）

圖5　長爪沙鼠HSCs原代培養(yǎng)7 d呈纖維細胞樣形態(tài)（×20）Fig. 5 Gerbils hepatic stellate cells in primary culture for in 7 days，fibroblast morphology（×20）

圖6　HSC自發(fā)熒光（×20）Fig. 6 HSC spontaneous fluorescence（×20）

圖7　長爪沙鼠HSCs培養(yǎng)至第3天行α-SMA免疫細胞化學(xué)染色（A×20，B×40）Fig. 7 Gerbils hepatic stellate cells in primary culture for in 5 days，positive staining with labeled antibody against α-SMA，A（A×20，B×40）

圖8　Desmin免疫熒光染色（傳代后24h）Fig. 8 Desmin immunofluorescence stain

圖9　α-SMA免疫熒光染色（傳代后24h）Fig. 9 α-SMA immunofluorescence stain

3　討論

HSC是肝內(nèi)的一種非實質(zhì)細胞，激活的HSC是合成、分泌ECM的主要來源，在肝纖維化的病程進展中處于重要地位。如前所述，長爪沙鼠脂質(zhì)代謝模式與人類相仿，對高脂飲食敏感，相對于大、小鼠，容易形成肝纖維化，被認為是肝纖維化模型研究的理想動物。因此長爪沙鼠HSC的分離培養(yǎng)將為肝纖維化的發(fā)病機制研究及其逆轉(zhuǎn)治療奠定基礎(chǔ)。

國內(nèi)外關(guān)于大、小鼠HSC分離培養(yǎng)的方法報道很多，但有關(guān)長爪沙鼠HSC的分離培養(yǎng)體系的建立尚屬首次。我們參照Friendman［18］的方法，并經(jīng)過改良，反復(fù)試驗，最終形成一套適用于長爪沙鼠的經(jīng)濟、合理、方便的HSC提取方法，有關(guān)經(jīng)驗總結(jié)如下：（1）長爪沙鼠的選擇與預(yù)處理：本課題組所保存的封閉群有部分沙鼠具有自發(fā)性肥胖癥狀，即3月齡后，體態(tài)明顯偏胖，體重較同齡鼠明顯偏高，故本實驗中選擇60 g左右的長爪沙鼠，性別不限，并預(yù)先用維生素A灌胃處理，確保肝星狀細胞具有一定的浮力，以便在密度梯度離心時，能較好地與其他細胞分離。（2）灌注方法的改良：我們在原位灌注方法的基礎(chǔ)上［19－20］，進行了改良，采用肝臟體外循環(huán)灌注的方法，具體如下：用4℃的預(yù)灌注液腹主動脈灌注，灌注液可以通過門靜脈與肝動脈進入肝臟，肝內(nèi)血細胞沖冼得相對較為干凈，低溫灌注可以減少肝熱缺血對肝臟的損傷。取下肝臟后，行門靜脈插管固定再行灌注與肝表面清洗，盡可能的減少血細胞對消化酶活性產(chǎn)生不良影響。在整個灌注過程中亦應(yīng)避免氣泡進入肝內(nèi)血管導(dǎo)致的灌注不充分。（3）酶消化中的注意事項：肝臟消化是否適度，是影響細胞得率及活力的關(guān)鍵因素。本法采用離體酶消化法。該方法主要有以下3個優(yōu)點：a.肝臟局部容易實現(xiàn)溫度控制，肝臟在37℃水浴中進行灌注，使肝臟與肝內(nèi)酶消化液保持在37℃，可以保證酶的活性，可以減少消化時間。b.可避免原位酶消化法中由于肝臟側(cè)枝循環(huán)豐富導(dǎo)致的酶用量增加，成本增高。c.在保證門靜脈插管良好同時，適當(dāng)?shù)淖钄喔蜗孪虑混o脈，讓酶消化液在肝內(nèi)形成高壓，消化酶通過門脈系統(tǒng)均勻地作用于肝組織，可提高酶的使用率。在本方法中所用的各消化酶的配比為：膠原酶∶DNA酶∶鏈蛋白酶= 0. 1%∶0. 001%∶0. 05%，膠原酶主要用于消化肝臟內(nèi)膠原，DNA酶可降解肝實質(zhì)細胞破裂后釋放的DNA，減少細胞間的粘連，而鏈蛋白酶主要用于去除肝細胞，提高HSC的濃度。消化酶務(wù)必在臨用前配置，并且濃度準(zhǔn)確。（4）分離介質(zhì)的選擇與添加：由于HSC富含脂滴，細胞密度在所有肝細胞中最低，故可采用密度梯度離心的方法分離HSC，因此，分離介質(zhì)的選擇在HSC的分離純化中亦是十分重要。常用的分離介質(zhì)有Metrizamidee，Percoll，Nycodenz［21－22］。我們通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)Metrizamidee，Percoll較難形成明顯的條帶，且需要高速離心，而Nycodenz分層穩(wěn)定，配置簡單，因此我們采用Nycodenz作為分離介質(zhì)，其常用濃度為18%，但該濃度離心后HSC細胞層不集中，而用20%的濃度較為理想，重復(fù)性好，故在本實驗中采用20%Nycodenz作為分離介質(zhì)。Nycodenz的添加方法有2種［23－25］，第一種是懸浮法，即將Nycodenz置于管底，輕輕覆蓋上相應(yīng)體積的細胞懸液，形成不能混勻的兩個液層，第二種是混勻法，即將細胞懸液與Nycodenz混勻，再在上面覆蓋少量的細胞培養(yǎng)液，或Hank’s，本課題組經(jīng)比較選擇了混勻法，該法密度梯度離心后，細胞數(shù)量多，條帶較為集中。（5）其他：消化好的肝組織粘稠度很高，不易過濾，影響HSC的收率和活力，因此過濾時，我們加入4℃Hank’s液，不僅降低細胞懸液的粘稠度，同時也可以降低鏈蛋白酶活性，減少對HSC的毒性作用，促使HSC的收率、純度和活力大大提高。

總之，本課題組經(jīng)多次實驗摸索出這一套長爪沙鼠肝星狀細胞分離培養(yǎng)方法，本方法不需要昂貴的試劑和特殊的儀器設(shè)備，單層密度梯度離心一步法即可分離純化HSC，且細胞收率亦較高，適于推廣應(yīng)用，為進一步研究肝星狀細胞在肝損傷后細胞基質(zhì)的沉積及纖維化的形成機制奠定了基礎(chǔ)。

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〔修回日期〕2015－12－30

Establishment of a primary culture protocol of Mongolian gerbil hepatic stellate cells

LOU Qi，LI Wei，SHI Qiao-juan，LU Ling-qun，GUO Hong-gang，DU Jiang-tao，SA Xiao-ying
（Experimental Animal Center，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Zhejiang experimental animal and safety research key laboratory，Hangzhou 310013，China）

【Abstract】Objective To investigate the method to isolate and culture hepatic stellate cells（HSCs）for studying the cellular mechanisms of hepatic frbrosis. Methods HSCs were isolated by nycodenz density gradient centrifugation after the hepatocytes obtained from adult male gebils were digested with pronase，collagenase and DNase，infused via portal vein. The cell viability was determined by trypan blue exclusion test. The purity of HSCs was identified by detecting α-SMA，desmin immunohistochemical staining. Results The yield rate of HSCs was 0. 5～1×107per gerbil liver，and the cell viability was more than 90%. The percentage of α-SMA-positive cells was more than 75%after 3 days primary culture and almost 100%cells were α-SMA and desmin positive in passage culture. Conclusion The successful protocol of primary culture of Mongolian gerbil HSC provide a technical support for research of relevant liver diseases and drug development in the future.

【Key words】Mongolian gerbil；Hepatic stellate cell；Cell isolation；Primary culture

【中圖分類號】R-332

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0029-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 007

［基金項目］國家自然科學(xué)基金（31301933）；浙江省科技計劃項目（2013C37012，2013C37013，2014C27013）。

［通訊作者］薩曉嬰，E-mail：saxiaoyin@163. com。