大腸埃希菌致兔慢性輸卵管炎癥模型的建立

馮子聰，張 昭，黎 哲，馮博儀，陳思艾，李君宇，肖小敏（.暨南大學(xué)國際學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，廣州 50000；.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 50000）

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大腸埃希菌致兔慢性輸卵管炎癥模型的建立

馮子聰1，張 昭2，黎 哲2，馮博儀1，陳思艾1，李君宇1，肖小敏2
（1.暨南大學(xué)國際學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，廣州 510000；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510000）

【摘要】目的 利用大腸埃希菌建立新西蘭兔輸卵管慢性炎癥模型。方法 制備3×109/ mL的混合菌液（大腸埃希菌：金葡菌：鏈球菌按2∶1∶1體積混合）和3×108/ mL大腸埃希菌混懸液。18只新西蘭雌兔隨機(jī)分三組，其中正常組2只、混合菌液實驗組8只、大腸埃希菌液實驗組8只。通過經(jīng)陰道宮腔插管灌注術(shù)分別將混合菌液和大腸埃希菌液注入兩組實驗兔體內(nèi)。于菌液宮腔灌注術(shù)后第5、10、15、20天觀察大體標(biāo)本及光鏡下輸卵管炎癥形成情況。結(jié)果 混合菌液組和大腸埃希菌液組兔均于灌注術(shù)第15天呈慢性輸卵管炎癥改變。結(jié)論 兩種建模方法均具有接近人體感染途徑、成模率高、操作簡便的優(yōu)點，是建立輸卵管慢性炎癥動物模型的有效方法。

【關(guān)鍵詞】慢性輸卵管炎癥模型；混合菌液；大腸埃希菌液；經(jīng)陰道宮腔內(nèi)插管灌注術(shù)；

在進(jìn)行動物實驗以探討輸卵管炎癥性不孕的治療方法時，首先必須選擇一種輸卵管結(jié)構(gòu)和功能與人類相近的動物制作相應(yīng)疾病的動物模型。新西蘭兔不僅其輸卵管結(jié)構(gòu)與人類輸卵管結(jié)構(gòu)相似，而且具有便于實驗操作，價格便宜，飼養(yǎng)容易等特點，因此本研究以其為研究對象，制作輸卵管慢性炎癥模型。在建模效果相似的前提下，相對于混合菌液，單一菌液具有細(xì)菌用量少，配制更簡便，細(xì)菌活力影響小等優(yōu)點。因此，本節(jié)分別使用混合菌液與大腸埃希菌液兩種方法制備新西蘭兔輸卵管模型，以探討選擇新西蘭兔慢性輸卵管炎模型建立的具體可行方法。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔級新西蘭雌兔18只（4～5月齡，未孕，體重2. 5 kg±250 g）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供【SCXK（粵）2009－0023】。無菌手術(shù)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心無菌實驗室進(jìn)行【SYXK（粵）2013－0001】。購回后在動物實驗中心飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境。18只清潔級新西蘭雌兔按體重由低到高依次編號：1～18號，根據(jù)SPSS完全隨機(jī)設(shè)計的分組方法將18只新西蘭兔隨機(jī)分3組，分別為正常組2只、混合菌液實驗組8只、大腸埃希菌液實驗組8只。

1.2細(xì)菌混懸液的制備

大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC21059），均由廣州市暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供、培養(yǎng)。將這三種細(xì)菌原液分別加入生理鹽水稀釋濃度至3×109/ mL［1］，然后大腸埃希菌：金葡菌：鏈球菌按2∶1∶1體積的比例混合，制備成混合細(xì)菌混懸液備用。另將大腸埃希菌3×109/ mL濃度的菌液加入生理鹽水制備成3×108/ mL大腸埃希菌混懸液備用（制模用細(xì)菌懸液均為即用即配，以避免菌液濃度明顯改變）。

1.3新西蘭兔造模

步驟：（1）實驗前6 h每只兔于后肢外側(cè)肌肉豐富處肌內(nèi)注射HCG 80國際單位［2－3］。（2）經(jīng)陰道宮腔內(nèi)插管灌注術(shù)：3%戊巴比妥鈉溶液按1 mL/ kg予耳緣靜脈注射麻醉兔后，固定并暴露外陰，將一次性無菌6號小兒吸痰管插入兔泌尿生殖口內(nèi)約8～10 cm［3－4］；回抽未見液體，證明插管順利進(jìn)入宮腔?；旌暇航M8只兔均予插管內(nèi)灌注混合菌液（每兔按1 mL/ kg的灌液量，取3×109/ mL混合菌液1 mL加入生理鹽水調(diào)至相應(yīng)的灌液量）；大腸埃希菌液組8只兔則予插管內(nèi)灌注大腸埃希菌液（每兔按1 mL/ kg的灌液量，取3×108/ mL大腸埃希菌液1 mL加入生理鹽水調(diào)至相應(yīng)的灌液量）。灌菌液后抬高兔臀靜置3 min后放回飼養(yǎng)籠。（3）術(shù)后于第5、10、15、20天兩個實驗組分別隨機(jī)處死2只兔，正常組兔于肌注HCG后第20天處死，取輸卵管標(biāo)本備檢。

1.4觀察項目

1.4.1肉眼觀察：

輸卵管外觀形態(tài)改變、與周圍組織器官粘連情況以及腹腔有無積液等情況。

1.4.2輸卵管通暢情況觀察：

距宮角約1 cm處用動脈夾夾閉子宮腔，自宮角處向輸卵管方向進(jìn)針，用5%亞甲藍(lán)溶液2 mL向輸卵管內(nèi)注射。通暢程度判斷：（1）通暢，即注射過程中無阻力，傘端見亞甲藍(lán)液體溢出；（2）通而不暢，即注射過程中有阻力，加壓后阻力減少，傘端可見亞甲藍(lán)液體溢出；（3）不通，即注射過程中阻力大，加壓后阻力無減少，傘端未見亞甲藍(lán)液體溢出。

1.4.3盆腔粘連情況：

參考Nair等［5］制定的5級分類法，完全無粘連為0級，計0分；內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間1條粘連帶為Ⅰ級，計1分；內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間2條粘連帶為Ⅱ級，計2分；多于2條粘連帶而內(nèi)臟未直接粘連至腹壁為Ⅲ級，計3分；內(nèi)臟直接粘連到腹壁，不管粘連帶多少為Ⅳ級，計4分。

1.4.4光鏡下病理改變：

觀察完后，取雙側(cè)輸卵管-子宮交界部，近端、遠(yuǎn)端各一段，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察病理改變。

2　結(jié)果

3組兔共18只均存活，兩組模型兔外觀及分泌物均未見明顯異常。制模過程未使用抗生素和其他藥物。

2.1各組新西蘭兔輸卵管大體觀察比較

正常組 兔盆腔未見異常。生殖器官包括陰道、雙角子宮、輸卵管和卵巢。輸卵管外觀光滑，呈粉紅色，峽部管腔內(nèi)徑約0. 5～1 mm，壺腹部管腔內(nèi)徑約1～2 mm。于造模第5天，混合菌液組和大腸埃希菌液組均呈現(xiàn)腹膜充血、盆腔膜性粘連，腹腔積液等急性盆腔炎改變，而雙側(cè)輸卵管則出現(xiàn)系膜血管充血，管壁水腫增粗等急性炎癥反應(yīng)。造模后第10天，兩組模型兔均見盆腔充血，仍可見盆腔膜性粘連，盆腔積液較第5天時明顯減少，輸卵管系膜血管充血，管腔稍增粗、扭曲。造模后第15天，兩組模型兔均見腹膜炎癥充血，盆腔見少量清亮積液，腹膜粘連較第5、10天時致密，輸卵管增粗、扭曲、僵硬或腫脹，內(nèi)有淡黃色積液。制模第20天，兩組模型兔均見腹膜炎癥充血，盆腔見清亮積液，可見致密腹膜粘連，輸卵管增粗、扭曲、僵硬或腫脹，內(nèi)有淡黃色積液（表1）。

表1　造模不同時期輸卵管通暢情況及粘連情況Tab. 1 The patency and adhesion of oviduct in different periods

2.2各組新西蘭兔輸卵管光鏡下觀察比較

正常組兔輸卵管間質(zhì)部，鏡下可見管腔通暢，結(jié)構(gòu)清晰，粘膜皺褶低矮且二級分支不明顯，皺褶被覆粘膜為單層柱狀上皮，上皮纖毛短小，粘膜下間質(zhì)未見明顯血管增生，粘膜下層間質(zhì)和肌層比例約1：1（圖1A）。輸卵管壺腹部粘膜皺褶豐富，二級分支多，皺褶被覆粘膜為單層高柱狀上皮，上皮纖毛豐富整齊，粘膜下層間質(zhì)少且無明顯血管增生（圖1B）。于造模第5天，混合菌液組和大腸埃希菌液組模型兔輸卵管均呈典型急性炎癥改變：輸卵管上皮壞死脫落，管腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞滲出，間質(zhì)充血，管壁全層大量中性粒細(xì)胞浸潤。造模第10天的病理與第5天基本相似，皆呈急性炎癥改變，但間質(zhì)充血減輕，中性粒細(xì)胞浸潤稍減少。造模第15天，兩組模型兔輸卵管鏡下均呈典型慢性炎癥改變：輸卵管間質(zhì)部可見管腔狹窄，粘膜皺褶變平；粘膜下間質(zhì)增生，厚度大于全層2/3，間質(zhì)血管增生明顯；淋巴細(xì)胞散在浸潤全層（圖1C，D）。輸卵管壺腹部粘膜皺褶尚豐富，二級減少分支；上皮纖毛凌亂、稀疏、短小或缺如，高柱狀上皮變立方上皮且胞核排列不規(guī)整；粘膜下層間質(zhì)增生，間質(zhì)血管增生；淋巴細(xì)胞散在或局灶浸潤（圖1E，F(xiàn)）。制模第20天兩組模型兔輸卵管鏡下所見與第15天時相似。

3　討 論

輸卵管炎性動物模型的建立，是研究輸卵管性不孕、盆腔炎癥等疾病的基礎(chǔ)。目前制作輸卵管炎癥阻塞動物模型的方法主要有物理、化學(xué)、生物學(xué)方法3種［6－7］。物理、化學(xué)方法包括機(jī)械夾閉損傷、電熱、激光、苯酚等藥物灼傷等，雖然均有大量報道能制成慢性炎癥損傷輸卵管的模型，但是其致炎途徑和人類發(fā)生輸卵管炎的途徑差異很大，因此這些建模方法現(xiàn)在已被大部分實驗摒棄。生物方法即采用細(xì)菌、沙眼衣原體、支原體等病原微生物注入輸卵管內(nèi)引起其炎性反應(yīng)［8－10］，這種方法基本接近人類輸卵管炎癥感染的途徑，能更真實的在動物體內(nèi)還原人類輸卵管炎癥的實際情況，在這種成模方法下建立的輸卵管炎癥模型研究結(jié)果更具有說服力。

在建立輸卵管炎的動物模型實驗操作中，大部分學(xué)者采用開腹后將一定濃度的病原微生物混懸液直接自宮角向一側(cè)輸卵管內(nèi)注射的方法［10－14］。該方法對動物的損傷大，動物接受手術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)重，易加重腹盆腔感染情況及出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥、敗血癥等意外情況，造成動物死亡，降低成模率。申剛等［1］在數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiongraphy，DSA）引導(dǎo)下經(jīng)子宮輸卵管插管介入途徑，將金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和大腸埃希菌的混合菌混懸液經(jīng)導(dǎo)管注入輸卵管，建成新西蘭兔輸卵管慢性炎癥模型。但是DSA費(fèi)用昂貴，顯然不能作為常規(guī)建模手段。李俊良等［3］應(yīng)用金葡菌和大腸埃希菌混合菌液采用直接宮腔插管灌注的方法同樣成功制備兔輸卵管炎癥模型。該方法試驗器材簡便、便宜，操作簡單，對實驗動物損傷小，接種細(xì)菌后動物死亡率低，因此本研究建立新西蘭兔輸卵管慢性炎癥模型時亦采用此法。

圖1　各組新西蘭兔輸卵管光鏡下病理學(xué)改變比較Note：A. Normal interstitial part（×20）The arrow indicated simple columnar epithelium；B. Normal ampullar part（×20）The arrow indicated simple tall columnar epithelium；C. Model’s interstitial part on the 15thday（×40）（E. coli group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively；D. Model’s interstitial part on the 15thday （×40）（Mixed group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively；E. Model’s ampullar part on the 15thday（×40）（E. coli group）The arrows from left to right indicated the proliferating vessel and the infiltrating lymphocyte，respectively；F. Model’s ampullar part on the 15thday（×40）（Mixed group）The arrows from left to right indicated the infiltrating lymphocyte and the proliferating vessel，respectively.Fig. 1 Comparison of the pathological changes of oviducts among different groups under light microscope

在本研究中分別采用3×109/ mL的混合菌混懸液（大腸埃希菌：金葡菌：鏈球菌以2∶1∶1體積混合）和3×108/ mL的大腸埃希菌混懸液對新西蘭雌兔進(jìn)行經(jīng)陰道宮腔插管灌注。兩種菌液灌注后，均在第5天時光鏡下觀察到輸卵管上皮脫落，壞死，管腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞滲出，間質(zhì)充血，管壁全層大量中性粒細(xì)胞侵潤等典型急性炎癥的表現(xiàn)；在第15天時觀察到輸卵管管腔狹窄，粘膜皺褶減少，粘膜下間質(zhì)增生，間質(zhì)血管增生，淋巴細(xì)胞浸潤，上皮纖毛凌亂、稀疏、短小或缺如等典型慢性炎癥的表現(xiàn)。這與李俊良等［3］報道的輸卵管炎癥動物模型14 d前均為急性炎癥，15 d開始出現(xiàn)慢性炎癥至49 d完全建成慢性炎癥模型相比有時間上的差別。但與申剛等［1］報道的新西蘭兔輸卵管炎癥建模于第5天出現(xiàn)急性炎癥，第15天出現(xiàn)慢性炎癥相似?？紤]其原因可能有：病原菌侵入機(jī)體能否致病，與細(xì)菌的毒力、侵入機(jī)體的數(shù)量、侵入門戶以及機(jī)體的免疫力、環(huán)境因素等密切相關(guān)。另外各種常規(guī)實驗操作和不同的飼育環(huán)境對實驗動物的神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫、血液生理等指標(biāo)亦有不同程度的影響［15］。

對比混合菌液和大腸埃希菌液兩組動物模型，在第15天時，雖然混合菌液組兔的盆腔粘連情況、鏡下見淋巴細(xì)胞浸潤和間質(zhì)增生情況等均較大腸桿菌組兔嚴(yán)重，但是大腸埃希菌組兔的輸卵管鏡下亦能呈現(xiàn)典型慢性炎癥的表現(xiàn)。且3×108/ mL的大腸埃希菌混懸液與3×109/ mL的混合菌混懸液相比具有細(xì)菌濃度低、細(xì)菌用量少、配制更簡便、細(xì)菌活力受影響小等優(yōu)點。但就模擬輸卵管炎的混合細(xì)菌逆行感染條件而言，混合菌混懸液則更具相似性。

因此綜上所述，采用3×108/ mL的大腸埃希菌混懸液或3×109/ mL的大腸埃希菌：金葡菌：鏈球菌以2：1：1體積混合的細(xì)菌混懸液進(jìn)行經(jīng)陰道宮腔插管灌注的方法均能在灌注術(shù)后第15天建立新西蘭兔輸卵管慢性炎癥的模型。兩種建模方法均具有接近人體感染途徑、成模率高、操作簡便的優(yōu)點，是建立輸卵管慢性炎癥動物模型的有效方法。

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〔修回日期〕2015－11－12

The establishment of chronic salpingitis model of New Zealand rabbits caused by Escherichia coli

FENG Zi-cong1，ZHANG Zhao2，LI Zhe2，F(xiàn)ENG Bo-yi1，CHEN Si-ai1，LI Jun-yu1，XIAO Xiao-min2
（1. Clinical Medicine，International School，Jinan University，Guangzhou 510000，China；2. Obstetrics and Gynecology Department，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510000，China）

【Abstract】Objective To investigate the possibility of utilizing the mixed bacteria liquid and the Escherichia coli （E. coli）liquid to establish the chronic salpingitis model of New Zealand rabbits，respectively. Methods Taken as the study object，the un-pregnant New Zealand rabbits（4～5 years old）were randomly divided into three groups：the normal group，the mixed bacteria experimental group and the E. coli experimental group. The trans-vaginal intrauterine intubation operation was performed for the injection of the mixed bacteria liquid and the E. coli liquid. Visual observation was to evaluate the gross pathological changes of the salpingitis and the pelvic cavity. HE staining and the light microscope were used to observe the micro-pathological changes of salpingitis. Results On the 15thday after modeling，increased pelvic effusion，dense peritoneal adhesion，interstitial hyperplasia and infiltration of lymphocytes were observed in both experimental groups. Conclusion Through the trans-vaginal intrauterine intubation operation，the chronic salpingitis model of New Zealand rabbits could be successfully established either by using the mixed bacteria liquid or by using the E. coli liquid.

【Key words】Chronic salpingitis model；Mixed bacteria liquid；E. coli liquid；Trans-vaginal intrauterine intubation operation

【中圖分類號】Q-31 R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0019-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 005

［基金項目］國家自然科學(xué)基金項目（81370676）；暨南大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目（201310559069）；廣東省科技計劃項目（2012B32000007）；廣州市科技計劃項目（7411785665675）。

［作者簡介］馮子聰（1992－），男，本科生，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)；張昭（1984－），女，主治醫(yī)師，博士，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)。兩者為共同第一作者。

［通訊作者］肖小敏（1962－），女，教授，博士，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)。