高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型的建立

陳 琳，黃小麗，楊亞旭，周美佳，郝臻鳳，孔桂美，胡 榮，卜 平（.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 5000；.泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰州 5300）

?

高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型的建立

陳 琳1，黃小麗1，楊亞旭1，周美佳1，郝臻鳳2，孔桂美1，胡 榮1，卜 平1
（1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 2225000；2.泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰州 225300）

【摘要】目的 探討穩(wěn)定、可靠與妊娠期胰島素抵抗相似的小鼠模型建立方法。方法 將60只SPF級(jí)5周齡KM小鼠隨機(jī)分為高脂飲食組和普食組，高脂飲食組高脂飼料喂養(yǎng)4周后，按雌雄1∶1合籠，在雌鼠陰道看到陰道栓定位妊娠第一天。妊娠成功后，按30 mg/ kg間隔24 h腹腔注射，共注射3次，對(duì)照組注射等量的檸檬酸緩沖液（0. 1 mol/ L，pH =4. 2）。于造模成功后的第3、7、14及19天記錄小鼠的隨機(jī)血糖，體重，以及24 h的飲水量和攝食量。ELISA檢測血清中INS、ADP、LEP和CRP因子的濃度。結(jié)果 孕鼠在造模成功后出現(xiàn)明顯飲水量、攝食量、尿量增多癥狀，飲水量、攝食量與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0. 01），造模組血糖＞11. 1 mmol/ L，明顯高于對(duì)照組。GDM組INS（1. 50±0. 25）Mu/ L，ADP（0. 65±0. 13）μg/ L，LEP（1. 60±0. 12）μg / L，CRP（37. 54±4. 70）μg / L，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0. 01）。產(chǎn)后，小鼠血糖恢復(fù)到正常水平。結(jié)論 高脂飲食結(jié)合小劑量STZ多次誘導(dǎo)的方法能夠建立的GDM模型且符合人類妊娠期糖尿病病理性胰島素抵抗的特征。

【關(guān)鍵詞】妊娠期糖尿病；高脂飲食；鏈脲佐菌素；模型；小鼠

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）系指在妊娠期首次發(fā)現(xiàn)或發(fā)生的糖代謝異常，是孕期常見的并發(fā)癥之一。GDM對(duì)孕婦、胎兒，甚至新生兒、嬰兒等產(chǎn)生許多不良影響，增加了巨大兒，畸形胎兒及死胎的發(fā)生率，也增加了Ⅱ型糖尿病家族史的婦女患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。由于妊娠期的特殊性，使很多有創(chuàng)性研究無法展開，在一定程度上限制了對(duì)GDM病理生理等方面的深入研究，因此GDM動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒂兄趯?duì)GDM更進(jìn)一步的研究。目前國內(nèi)外建立糖尿病動(dòng)物模型已有很多成熟的方法，但制作GDM的動(dòng)物模型截止今日尚無成熟的辦法。胰島素抵抗（IR）被認(rèn)為是GDM發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)［1］，而在眾多影響胰島素抵抗的眾多因素中，飲食結(jié)構(gòu)中脂肪比例增加是形成肥胖和胰島素抵抗的重要因素［2］。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）是目前廣泛用于建立糖尿病動(dòng)物模型的化學(xué)誘導(dǎo)劑［3］。本研究我們結(jié)合妊娠期的特殊性，以及以往建立糖尿病模型的方法，采用高脂飲食誘導(dǎo)結(jié)合小劑量STZ多次誘導(dǎo)的方法建立GDM的動(dòng)物模型，并通過血糖的測定，血清中與糖尿病相關(guān)的炎性因子含量的測定等指標(biāo)來確定模型建立情況。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)4周齡KM小鼠60只（雌雄各半），體重18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012－0001】。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心【SYXK（蘇）2012－0029】，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma公司），檸檬酸（C6H8O7·H2O），檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）（國藥集團(tuán)），高脂飼料（上海普路騰生物科技有限公司），血糖儀和試紙（三諾生物傳感股份有限公司），血胰島素（insulin，INS）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）、瘦素（leptin，LEP）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）因子的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒（ELISA）（上海豐翔生物科技有限公司）。

1.3造模方法

KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為兩組高脂飲食組和普通飲食組，每組30只。高脂飼料在普通飼料的基礎(chǔ)上添加豬油、蔗糖、酪蛋白和麥芽糊精等，供能比例分別為脂肪45%，粗蛋白19%，碳水化合物36%。喂養(yǎng)4周后，小鼠達(dá)9周齡，按雌雄1 ∶1合籠，在雌鼠陰道看到陰道栓定為妊娠第1天，取合籠后3 d內(nèi)見栓的定為同一實(shí)驗(yàn)批次，造模組3 d 內(nèi)16只妊娠成功，對(duì)照組22只妊娠成功。妊娠成功后，給予STZ新鮮溶液（溶于現(xiàn)配制的檸檬酸緩沖溶液中），根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的條件30 mg/ kg間隔24 h腹腔注射，共注射3次，對(duì)照組注射等量的檸檬酸緩沖液（0. 1 mol/ L，pH = 4. 2）。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：孕鼠隨機(jī)血糖＞11. 1 mmol/ L。

1.4檢測及觀察指標(biāo)

①觀察各組小鼠的一般情況，分別于高脂飼料喂養(yǎng)前及喂養(yǎng)4周后記錄小鼠體重，并分別在造模成功后的第3、7、14、19天記錄小鼠的體重，以及24 h的飲水量和攝食量。②通過剪尾法用血糖儀檢測各組孕鼠造模成功后第3、7、14及19天的血糖。③血清的采集：采用內(nèi)眥取血的方法于妊娠第18天采血，3000 r/ min離心10 min，分離血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法應(yīng)用雙抗夾心法測定樣本中的因子水平，實(shí)驗(yàn)時(shí)按照試劑盒中說明書的步驟分別測定血清中INS、ADP、LEP、CRP因子的濃度。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1小鼠一般情況觀察

高脂飼料喂養(yǎng)4周后小鼠體重增長較快，與普食組有顯著差異（P＜0. 01），高脂4周時(shí)，高脂組與普食組的血糖值無顯著差異。30 mg/ kg STZ小劑量多次注射造模成功后（血糖＞11. 1 mmol/ L）于第3天開始出現(xiàn)飲水量、攝食量及尿量增多，明顯消瘦，毛發(fā)漸無光澤，且攝食量與飲水量與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0. 01）（表1）。

表1　高脂飲食誘導(dǎo)前后小鼠體重以及成模后24 h飲水量、攝食量的變化Tab. 1 Changes in body weight，24 h water intake，24 h food intake of mice with different diets in different groups

表2　妊娠期糖尿病小鼠與對(duì)照組血糖比較（mmol/ L）Tab. 2 Blood glucose levels in different groups（mmol/ L）

表3　造模組和對(duì)照組INS、ADP、LEP和CRP水平比較Tab. 3 Comparison of levels of INS，ADP，LEP，CRP in different groups

2.2KM小鼠模型穩(wěn)定性及血糖變化比較

高脂飼料喂養(yǎng)4周后，高脂組與普食組血糖并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，于是在妊娠成功后，進(jìn)行30 mg/ kg STZ小劑量誘導(dǎo)3次，每次間隔24 h，造模組16只小鼠10只造模成功，成模率約60%，無死亡，與對(duì)照組孕鼠相比血糖值明顯升高（P＜0. 01）（表2），隨著妊娠的進(jìn)展并無降低，直至妊娠結(jié)束血糖恢復(fù)正常水平。

2.3小鼠血清中INS、ADP、LEP、CRP因子的濃度

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）結(jié)果表明，造模組血清中INS、ADP、LEP、CRP因子的含量與對(duì)照組相比差異顯著（表3）。

3　討論

目前建立Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的方法有很多種，運(yùn)用較為廣泛的是通過鏈脲佐菌素或四氧嘧啶破壞胰島β細(xì)胞。而肥胖是GDM發(fā)生的高危因素，胰島素抵抗是GDM發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。通過高脂飼料誘導(dǎo)復(fù)制胰島素抵抗大鼠模型成功的例子很多［4－6］，為我們建立妊娠期糖尿病動(dòng)物模型提供了借鑒。張婕等［7］在確定小鼠受孕成功之日起采用高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立妊娠期模型，但是鑒于小鼠妊娠時(shí)間短，只有19～21 d，短期高糖高脂飼料誘導(dǎo)并不能達(dá)到升高血糖的效果。姜驪［8］、李強(qiáng)［9］等分別采用高脂飲食結(jié)合一次性注射STZ的方法建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，對(duì)此我們也在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了嘗試，但是因?yàn)榭赡芡庠谝蛩氐牟町?，并沒有達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果，所以我們采用高脂飼料誘導(dǎo)結(jié)合小劑量多次注射STZ的方法建立妊娠期糖尿病小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)方案是通過預(yù)試的，尤其是STZ的誘導(dǎo)劑量，劑量過大可以引起明顯的胰島β細(xì)胞受損，血糖明顯升高，建立的是Ⅰ型糖尿病，死亡率也較高。劑量過低，血糖沒有變化。因此，預(yù)實(shí)驗(yàn)是必需的。

GDM的IR程度高于正常妊娠婦女，所以胰島素分泌能力也代償性增加，因此GDM的胰島素水平高于正常婦女。諸多證據(jù)表明，在IR發(fā)展至GDM的過程中，炎癥反應(yīng)扮演了重要角色，CRP是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的重要因子，最近研究發(fā)現(xiàn)CRP作為一種炎癥因子與妊娠生理和病理關(guān)系較為密切。CRP為妊娠期糖尿?。℅DM）早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防提供了一個(gè)新靶點(diǎn)［10－12］。糖代謝異常的孕婦孕期體重增加和脂肪過度積累，增加的體脂合成了更多的瘦素，以及更強(qiáng)的IR及代償性胰島素分泌增加，形成高胰島素血癥，促進(jìn)瘦素合成［13－14］。脂聯(lián)素是脂肪組織產(chǎn)生的對(duì)抗IR與炎癥反應(yīng)的一種蛋白質(zhì)，GDM的脂聯(lián)素水平是降低的，它與TNF-α和瘦素呈負(fù)相關(guān)［15－17］。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食誘導(dǎo)結(jié)合小劑量STZ多次誘導(dǎo)后，小鼠的攝食量、飲水量、尿量明顯增多，血糖、胰島素水平、血清中C反應(yīng)蛋白、瘦素水平明顯升高，脂聯(lián)素水平明顯下降，產(chǎn)后血糖恢復(fù)正常水平，符合人類妊娠期糖尿病的主要表型特征和相似的發(fā)病過程，說明高脂飲食誘導(dǎo)結(jié)合小劑量STZ多次誘導(dǎo)是一種理想的建立妊娠期糖尿病模型的方法，為研究妊娠期糖尿病提供了可靠的研究媒介，使得產(chǎn)科臨床無法開展的操作成為可能。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張婭，徐先明.妊娠期糖尿病病因?qū)W研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，29（4）：299－302.

［2］ Morens C，Sirot V，Scheurink AJ，et al. Low carbohydrate diets affect energy balance and fuel homeostasis differentially in lean and obese rats［J］. Am J PhysiolRegul Integr Comp Physiol，2006，291（1）：R1622－R1629.

［3］ MatteucciE，Giampietro O. Proposal open for discussion Defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research［J］. J E thnophamacol，2008，118（3）：163－172.

［4］ 吳晏，韓靜，黃黎明，等.高脂喂養(yǎng)合并小劑量鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20 （2）：11－15.

［5］ 周迎生，高妍，李斌，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13（3）：154－158.

［6］ 張麗麗，黃亞絹，葛聲，等.高脂飲食誘導(dǎo)妊娠期胰島素抵抗大鼠糖代謝特征［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2009，18（6）：446 －449.

［7］ 張婕，王琦，楊建軍，等.高脂高糖飲食誘導(dǎo)妊娠糖尿病小鼠模型的建立［J］，寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（7）：756 －758.

［8］ 姜驪，陳輝，何勇，等.高脂飲食加低劑量鏈脲霉素建立小鼠2型糖尿病模型［J］，中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（3）：35 －38.

［9］ 李強(qiáng)，丁實(shí)，周劍宇，等.高脂飲食合并不同劑量STZ建立小鼠2型糖尿病模型［J］，承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，30（1），1：5 －7.

［10］ 韓姹，牛秀敏. C反應(yīng)蛋白與妊娠期糖尿病的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)，2006，33（1）：20－23.

［11］ Myles W，Kar en H，Laura S，et al. First-trimesterc-reactive protein and subse-quent gestational diaetes［J］. Diabetes Care，2003（6），26：819－824.

［12］ Retnakaran R，Hanley A J，Raif N，et al. C-reactive protein and gestational diabetes：the central role of maternal obesity ［J］. Clin End ocrinol Metab，2003，88（8）：3507－3512.

［13］ Qiu C，Will iams M A，Vadachkor ia S，et al. Increased matenal plasma leptin in early pregnancy and risk of gestational diabetes mellitus［J］. Obstet Gynecol，2004，103（3）：519 －525.

［14］ Kautzky W A，Pacini G，Tura A，et al. Increased plasma leptin in gestational diabetes［J］. Diabetol ogia，2001，44（2）：164－172.

［15］ 周桂菊，叢林.脂聯(lián)素與妊娠關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)，2007，34（3）：159－161.

［16］ Ranh eim T，Haugen F，Staf f A C，et al. Adiponectin is reduced in gestational diabetes mellitus in normal weight women ［J］. Acta Obstet Gynecology Scand，2004，83（4）：341 －347.

［17］ Williams M A，Qiu C，Muy R，et al. Plasma adiponectin concent rations in early pregnancy and sub sequent risk of gestational diabetes mellitus［J］. Clin Endocrinol Metab，2004，89（7）：2306－2311.

〔修回日期〕2016－01－13

High fat diet combined with streptozotocin-induced gestational diabetes mellitus on mice

CHEN Lin1，HUANG Xiao-li1，YANG Ya-xu1，ZHOU Mei-jia1，HAO Zhen-feng2，KONG Gui-mei1，HU Rong1，BO Ping1
（1. School of Medicine，Yangzhou University，Jiangsu Yangzhou 225000，China；2. Taixing People’s Hospital，Jiangsu Taizhou 225300，China）

【Abstract】Objective To explore a gestational insulin resistance mice model establishing method，which is steady，reliable and similar to human being. Method Female KM mice at 5 weeks were randomly divided into high fat diet group（n =30）and normal diet group（n = 30）. High fat diet group was exposed to high diet for 4 weeks，and then male and female were mated（n∶n = 1∶1）Then the pregnancy mice were intraperitoneal injected with 30 mg/ kg/ d STZ during the first 3 days，the control group was injected with equal dosage of citrate buffer solution（0. 1 mol/ L，pH =4. 2）for 3 days. Their blood glucose，body weight，the amount of food intake and water intake were recorded at 3，7，14 and 19 d of the GDM model respectively. The serum INS，ADP，LEP，CRP were measured by ELISA. Results We successfully made the GDM mice model，and the pregnant mice showed significant signs of polyuria，polydipsia，hyperphagia and weight loss compared to the control model（P＜0. 01）. The blood glucose of GDM mice＞11. 1mmol/ L，the serum cytokines（INS（1. 50±0. 25）Mu/ L，ADP（0. 65±0. 13）μg/ L，LEP（1. 60±0. 12）μg / L，CRP（37. 54±4. 70）μg /L）of GDM mice were significant difference compared to the control model（P＜0. 01）. Postpartum，the GDM mice blood glucose returned to the normal level. Conclusion Gestational diabetes mellitus mice model can be successfully developed by high fat diet with low dose STZ and three times induce，which preferable mimics the characteristic of gestational pathologic insulin resistance in human beings.

【Key words】Gestational diabetes mellitus；High fat diet；Streptozotocin；Model；Mice

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0015-04

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 004

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272537；30801497）；江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（11KJB360010）；揚(yáng)州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”資助（2012）。

［作者簡介］陳琳（1991－），女，碩士，專業(yè)：藥劑學(xué)。E-mail：chenlin910107@163. com。

［通訊作者］孔桂美（1978－），女，副教授，研究方向：腫瘤防治及人類疾病動(dòng)物模型研究。E-mail：gmkong@ yzu. edu. cn；胡榮（1957－），女，教授，研究方向：藥劑學(xué)及中藥藥劑學(xué)。E-mail：398563432@ qq. com。