人工誘導(dǎo)樹鼩乳腺腫瘤的病理分析

何保麗，夏厚軍，角建林，王春艷，張海林（.昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，昆明 650500；.中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明 6503）

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人工誘導(dǎo)樹鼩乳腺腫瘤的病理分析

何保麗1，夏厚軍2，角建林1，王春艷2，張海林2
（1.昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，昆明 650500；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明 650223）

【摘要】目的 建立樹鼩乳腺腫瘤模型。方法 用DMBA聯(lián)合人工合成孕激素MPA的方法，挑選45只雌性樹鼩，隨機(jī)分為3組。（1）DMBA組：連續(xù)3次進(jìn)行DMBA（20 mg/次）灌胃處理，每周1次；（2）DMBA + MPA組：每3周1次，連續(xù)3次DMBA灌胃處理之后，于樹鼩背部左側(cè)皮下第1次植入MPA緩釋片劑（150 mg/片，90 d緩釋），間隔3個月，第2次植入MPA片；（3）正常對照組：使用花生油進(jìn)行灌胃處理，每3周1次，連續(xù)3次。實驗處理后，每周定期觀察腫瘤發(fā)生情況，共觀察45周。采用HE染色對誘發(fā)腫瘤的病理類型進(jìn)行鑒定。結(jié)果 DMBA能單獨誘導(dǎo)樹鼩特異的產(chǎn)生乳腺腫瘤，誘發(fā)率為12%；聯(lián)合MPA皮下植入可以把DMBA誘導(dǎo)的乳腺腫瘤發(fā)病率提高到50%；而對照組沒有觀察到乳腺腫瘤的發(fā)生。誘導(dǎo)的腫瘤主要為導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤，惡性程度低，僅有一例為惡性程度高的浸潤性導(dǎo)管癌。結(jié)論 所誘導(dǎo)的樹鼩導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和浸潤性導(dǎo)管癌均為人類共有的腫瘤病理類型。誘發(fā)腫瘤形態(tài)與自發(fā)腫瘤相似。

【關(guān)鍵詞】樹鼩；乳腺腫瘤；模型，動物

盡管早在1966年《Nature》就首次報道了一例樹鼩自發(fā)性乳腺癌［1］，國內(nèi)夏厚軍等［2］報道了樹鼩自發(fā)乳腺腫瘤的特征，但自那以后，極少見到學(xué)者成功建立樹鼩的乳腺癌模型研究報道。

二甲基苯蒽（7，12-dimethylbenz（a）anthracene，DMBA）是目前誘發(fā)乳腺腫瘤常用的化學(xué)致癌劑，對乳腺的選擇作用較強(qiáng)，特異性高達(dá)70%～80%［3］。它是一種多環(huán)芳烴類化合物，經(jīng)代謝產(chǎn)生致癌物，從而引起DNA損傷，基因突變，最終導(dǎo)致腫瘤生成。DMBA所誘發(fā)的SD大鼠乳腺癌大多為ER + / PR +［4］，表明雌激素和孕激素可以加速DMBA誘發(fā)的乳腺癌生長。研究證實醋酸甲羥孕酮（medroxyprogesterone acetate，MPA），一種人工合成的孕酮衍生物，能夠加速大鼠［5］或小鼠［6］DMBA誘發(fā)乳腺癌的速度。

DMBA和MPA是否也能在樹鼩中誘發(fā)乳腺腫瘤仍然是未知的，鑒于此，我們的實驗首次嘗試用DMBA和MPA誘導(dǎo)樹鼩的乳腺腫瘤，分析不同誘導(dǎo)組的差異，以了解化學(xué)致癌劑對樹鼩致乳腺腫瘤的情況，進(jìn)一步探討DMBA誘導(dǎo)的樹鼩乳腺腫瘤模型是否適于人類乳腺腫瘤的研究，以期為人類乳腺腫瘤的研究提供新的動物模型。

1　材料和方法

1.1動物及疼痛管理

實驗用樹鼩45只，雌性，3～4月齡，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供【SCXK（滇）K2013－ 0002】，均為人工繁殖的子一代樹鼩。所有樹鼩飼養(yǎng)在普通級動物飼養(yǎng)室，飼喂樹鼩專用的全價飼料，自由飲水。實驗觀察期限為12個月。動物實驗在昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗室進(jìn)行【SYXK（滇）2015 －0002】。樹鼩產(chǎn)生乳腺癌后，每天灌胃鹽酸曲馬多緩釋片（2 mg/ kg），以防止和緩解癌痛。

1.2試劑

致癌劑DMBA購自美國Sigma公司，用花生油做為溶劑，DMBA終濃度為20 mg/ mL。MPA購自美國Innovative Research of America，IRA）公司，規(guī)格為150 mg/片，90 d緩釋片劑。

1.3DMBA誘導(dǎo)的樹鼩乳腺腫瘤模型的建立

1.3.1致癌劑灌胃和孕激素緩釋片埋植

致癌劑DMBA和孕激素緩釋片MPA聯(lián)合誘導(dǎo)是建立乳腺癌動物模型的常用手段［4］。我們擬選取45只子一代性成熟的雌性樹鼩（3～4個月），按體重隨機(jī)分為3組，進(jìn)行乳腺癌誘導(dǎo)實驗。①DMBA + MPA組：每3周1次，連續(xù)3次DMBA灌胃處理之后，于樹鼩背部左側(cè)皮下植入MPA緩釋片劑（150 mg/片，90 d緩釋），間隔3個月植入第2次MPA片；②DMBA組：連續(xù)3次進(jìn)行DMBA（20 mg/次）灌胃處理，每周1次；③正常對照組：使用花生油進(jìn)行灌胃處理。12個月內(nèi)觀察樹鼩乳腺癌發(fā)生情況。

1.3.2樹鼩乳腺腫瘤發(fā)生過程中的觀察、記錄及標(biāo)本采集

在進(jìn)行DMBA灌胃操作以后，每周觀察樹鼩乳腺部位腫瘤生長情況。當(dāng)有可觸腫瘤出現(xiàn)時，記錄腫瘤的發(fā)現(xiàn)時間（潛伏期）、腫瘤大小和轉(zhuǎn)移情況。每周測量腫瘤的長徑和寬徑，依照公式V =πLW2/6計算腫瘤的體積，制作腫瘤生長曲線圖。在致瘤過程中，記錄樹鼩死亡情況，制作生存曲線圖。

樹鼩乳腺標(biāo)本的采集：灌胃DMBA后每周定期觀察各組樹鼩生長情況，觀察各組樹鼩腫瘤潛伏期（實驗開始至腫瘤出現(xiàn)），腫瘤大小等，觀察乳腺外觀，發(fā)育情況，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到2 cm左右時將樹鼩處死并解剖，將腫物完整切除，分別置于10%中性福爾馬林溶液中固定、石蠟包埋、切片。其中當(dāng)腫瘤出現(xiàn)破潰時則終止實驗，并處死樹鼩解剖，按實驗結(jié)束統(tǒng)計。

1.3.3樹鼩乳腺腫瘤病理形態(tài)學(xué)分析

在誘導(dǎo)樹鼩乳腺癌模型中，當(dāng)腫瘤最長徑達(dá)到2 cm左右，手術(shù)活取腫瘤組織，通過HE組織染色后鑒定樹鼩乳腺腫瘤所屬類型。HE染色如下：切取腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，組織包埋，連續(xù)切片厚約5 μm，二甲苯脫蠟，無水酒精及各級酒精梯度水化，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分色，返藍(lán)，0. 5%伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡10倍（低倍）物鏡及40倍（高倍）物鏡下觀察，記錄腫瘤的病理形態(tài)及惡性程度。

2　結(jié)果

2.1DMBA誘發(fā)乳腺腫瘤發(fā)生

由于樹鼩是膽小易受驚的動物，應(yīng)激性很強(qiáng)，有的樹鼩在實驗過程中因?qū)嶒炦M(jìn)行實驗處理而死亡，尤其是在埋植MPA藥片的時候。在實驗結(jié)束時，DMBA + MPA組有6只樹鼩存活，DMBA組有8只樹鼩存活，對照組有9只樹鼩存活。

DMBA組有1只樹鼩發(fā)生了腫瘤，樹鼩腫瘤發(fā)生率為12. 5%；DMBA + MPA組發(fā)生腫瘤的樹鼩為3只，樹鼩腫瘤發(fā)生比率為50%；在對照組沒有觀察到腫瘤發(fā)生，腫瘤圖片見圖1。與對照組相比，DMBA處理組的腫瘤發(fā)生率并沒有增加（P = 0. 247，＞0. 05），而DMBA + MPA組的腫瘤發(fā)生率顯著提高（P = 0. 018，＜0. 05）；DMBA + MPA組的腫瘤發(fā)生率與DMBA組相比沒有顯著差異（P = 0. 124，＞0. 05）。腫瘤發(fā)生的潛伏期為26～28周，第1只腫瘤發(fā)生在DMBA灌胃后第25周。

圖1　DMBA誘導(dǎo)的樹鼩乳腺腫瘤Note：A：Breast tumor in vivo；B：Tumor tissue in vitro.Fig. 1 DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

2.2誘發(fā)乳腺腫瘤的病理類型

將這4個樹鼩乳腺腫瘤進(jìn)行HE染色后判斷其所屬類型（表1），共鑒定了2種類型，即乳頭狀瘤和浸潤性導(dǎo)管癌，除#7外，其它樹鼩腫瘤均為導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤，屬于良性腫瘤。#7為浸潤性導(dǎo)管癌2級，屬于惡性腫瘤。對照組#3僅為小葉增生。圖2為各病理類型的代表性圖片。導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤顯微鏡下導(dǎo)管內(nèi)可見乳頭狀結(jié)構(gòu)，乳頭中軸見纖維及血管，瘤細(xì)胞排列極性規(guī)則，細(xì)胞無異型性。DMBA誘導(dǎo)的兩類乳腺腫瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)與自發(fā)的相似。

圖2為各病理類型的代表性圖片。導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤（#12）顯微鏡下結(jié)構(gòu)與自發(fā)性導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤極其一致，乳頭表面及腔面被覆雙層上皮細(xì)胞，內(nèi)層為柱狀上皮細(xì)胞，胞漿較豐富，外層為肌上皮細(xì)胞，其外包裹完整的基底膜。乳頭中軸見纖維及血管，瘤細(xì)胞排列極性規(guī)則，細(xì)胞無異型性。#7的浸潤性導(dǎo)管癌也與自發(fā)導(dǎo)管癌在結(jié)構(gòu)上比較一致，癌細(xì)胞充滿多個擴(kuò)張的導(dǎo)管內(nèi)腔隙，呈實性結(jié)構(gòu)。癌細(xì)胞較大，形態(tài)多樣，異型性明顯，胞漿較豐富，核仁大，核膜厚，核分裂象多見。依據(jù)腺管形成的程度、細(xì)胞核多形性及核分裂數(shù)的多少將此浸潤性導(dǎo)管癌分為中度分化的II級。

圖2　DMBA誘發(fā)的腫瘤病理類型Note：A：normal tissue；B：intraductal papillomas；C：invasive duct carcinoma.Fig. 2 Pathological types of DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

表1　DMBA誘導(dǎo)樹鼩乳腺腫瘤的病理類型Tab. 1 Pathological types of DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

3　討論

至今為止，關(guān)于野生或人工馴養(yǎng)的樹鼩人工誘導(dǎo)的腫瘤模型只有兩個成功建立，一個是黃曲霉素B1［7］和HBV［8－9］聯(lián)合誘導(dǎo)的肝癌模型，另一個是2-羥基丙基亞硝胺（2，2’-dihydroxy-di-npropylnitrosamine，DHPN）誘導(dǎo)的肺腺瘤模型［10］。由于缺乏轉(zhuǎn)移的和免疫缺陷的樹鼩，我們不得不采用誘導(dǎo)時間很長的化學(xué)誘導(dǎo)法，DMBA［11］和亞硝基甲基脲（N-methyl-nitrosourea，NMU）［12］是在嚙齒類動物乳腺癌誘導(dǎo)中常用的兩種致癌劑。實驗中所使用的致癌劑DMBA主要是通過微粒體的羥化酶系經(jīng)過羥基化和環(huán)氧化等代謝過程產(chǎn)生最終致癌物［13］。我們的研究選用了DMBA作為致癌劑，DMBA由于不溶于水而必須用油或吐溫溶解。DMBA的給藥方式可以通過灌胃［14］，也可以肌肉注射［15］，或者乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射［16］。我們采用灌胃的方式來進(jìn)行給藥。另外，越來越多的證據(jù)證明，在人類女性的雌激素聯(lián)合孕酮的治療中，長期的孕酮治療增加乳腺癌的患病風(fēng)險［17］。有研究發(fā)現(xiàn)孕酮和它的衍生物MPA足以誘導(dǎo)乳腺癌［18］，而且，MPA的致癌效應(yīng)也被隨后在大鼠、貓、狗和小鼠的研究所支持［19］，這些研究證實了MPA能加速乳腺癌的發(fā)生。本研究中，最早出現(xiàn)可觸及的乳腺腫瘤的時間為實驗處理后第25周，這一腫瘤潛伏期與大鼠的11周相差甚遠(yuǎn)，腫瘤誘發(fā)率也遠(yuǎn)低于大鼠（80%以上），與國內(nèi)文獻(xiàn)報道的注射法致癌不一致［20－21］。出現(xiàn)這一情況的原因除了DMBA的給藥方法不同以外，可能還跟動物種屬差異也有較大的關(guān)系，由于種屬不同，對致癌劑的敏感性也不一樣。我們的研究中還發(fā)現(xiàn)MPA能夠加速DMBA誘導(dǎo)的樹鼩乳腺腫瘤的發(fā)生，并提高腫瘤發(fā)病率。DMBA聯(lián)合MPA誘導(dǎo)的樹鼩乳腺腫瘤有兩種類型，即導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和浸潤性導(dǎo)管癌，其中，以導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤為主，所誘導(dǎo)的乳腺腫瘤在組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)方面與自發(fā)乳腺腫瘤相似。DMBA誘導(dǎo)嚙齒類會產(chǎn)生多種類型器官的腫瘤，而在樹鼩，DMBA誘導(dǎo)樹鼩產(chǎn)生的腫瘤集中在乳腺腫瘤，但大多是導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤。雖說誘發(fā)樹鼩腫瘤和自發(fā)的類型有相似之處，但與人高比例導(dǎo)管癌的情況有一定差異。

綜上所述，采用DMBA灌胃的方法成功建立了樹鼩的乳腺腫瘤模型，MPA與DMBA聯(lián)合使用可以促進(jìn)樹鼩乳腺腫瘤的發(fā)生。所誘導(dǎo)的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和浸潤性導(dǎo)管癌均為人類共有的腫瘤類型，但存在潛伏期長、腫瘤發(fā)生率低、主要病理類型為非浸潤性導(dǎo)管癌的缺點。這一方法所建立的腫瘤模型其腫瘤是非常不規(guī)則的形狀，很難定期監(jiān)測腫瘤準(zhǔn)確生長速度和體積，在以后的研究中，課題組將著力解決這一問題。該模型的成功建立，為研究人類乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防及治療提供了一個新的比嚙齒類動物更高級的動物模型。

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〔修回日期〕2015－12－25

Pathological analysis of the induced breast tumor models in tree shrew

HE Bao-li1，XIAO Hou-jun2，JIAO Jian-lin1，WANG Chun-yan2，ZHANG Hai-lin2
（1. Department of Laboratory Animal Science，Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2. Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China）

【Abstract】Objective To establish a tree shrew mode of breast tumor. Method Forty-five 3 to 4 month-old female tree shrews were orally gavaged with 20 mg 7，12-dimethylbenz（a）anthracene（DMBA）or peanut oil per animal for three times. Following that，fifteen DMBA administrated tree shrews were implanted 90 day-release medroxyprogesterone acetate（MPA）pellets. The tree shrews were palpated once weekly to detect mammary tumors for 45 weeks after first DMBA administration. Results DMBA were able to induce breast tumors（12. 5%）in tree shrews，and MPA increased the tumor incidence（50%）while no breast tumors were observed in the control group. Three induced breast tumors were intraductal papillary carcinomas and one was IDC by H&E stain. Conclusion All induced tumors are similar with spontaneous tumors in structure and molecular markers.

【Key words】Tree shrew；Mammary tumor；Mmodel，animal

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0006-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 002

［基金項目］國家自然科學(xué)基金項目（31560613）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究昆醫(yī)聯(lián)合專項（2013FB126）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（2013FZ071）。

［作者簡介］何保麗（1978－），女，博士，從事人類疾病動物模型研究，Email：hbl117@ sina. com。