穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜法檢測pBR322質(zhì)粒中十字形結(jié)構(gòu)

夏嵐 張旭

（1. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816；2. 鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，鹽城 224051；3. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210093）

穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜法檢測pBR322質(zhì)粒中十字形結(jié)構(gòu)

夏嵐1，2張旭2，3

（1. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816；2. 鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，鹽城 224051；3. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210093）

在目的DNA不被酶切成不同片段的情況下，應(yīng)用光譜方法探測pBR322質(zhì)粒中十字形結(jié)構(gòu)DNA的形成。吡咯脫氧胞苷（Pyrrolo deoxycytidine，PdC）取代dC摻入到pBR322質(zhì)粒的特定位點（3 195，3 222或3 281位點）。應(yīng)用穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光法研究十字形結(jié)構(gòu)DNA的形成。結(jié)果顯示：（1）穩(wěn)態(tài)熒光特性表明，當(dāng)PdC摻入到pBR322質(zhì)粒的3 222位點，PdC-pBR322超螺旋熒光強(qiáng)度大約是松弛型PdC-pBR322的4倍；與此同時，其時間分辨熒光壽命大約比松弛型PdC-pBR322長約0.3 ns。當(dāng)PdC摻入到3195或3281位點時，穩(wěn)態(tài)熒光光譜和熒光壽命（兩位點處約1.42 ns）并沒有顯著變化。（2）隨著鹽濃度的增大，熒光壽命略微有變化，但不是很明顯。通過檢測和分析pBR322質(zhì)粒的熒光光譜和熒光壽命，表明能夠形成在非配對環(huán)狀部分3222位點含有dC的十字形結(jié)構(gòu)。在一定的鹽濃度（0-100 mmol/L）條件下，十字形結(jié)構(gòu)能夠保持其穩(wěn)定性。

十字形結(jié)構(gòu)；pBR322質(zhì)粒；PdC；穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜法

在某些生理過程或生物技術(shù)如細(xì)菌的二分裂、病毒的復(fù)制、目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合等過程中，會發(fā)生DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者RNA的復(fù)制或逆轉(zhuǎn)錄過程，都遵循堿基的互補(bǔ)配對原則［1］。然而，越來越多的證據(jù)表明B型DNA并不是DNA存在的唯一結(jié)構(gòu)形式?；蛘{(diào)控區(qū)特殊形式的DNA（非雙鏈結(jié)構(gòu)DNA）在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用。例如，G-四鏈體是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種特殊的DNA結(jié)構(gòu)［2］。RNA或者單鏈DNA片段通過自身回折使互補(bǔ)的堿基配對能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)［3，4］。有研究報道在超螺旋質(zhì)粒DNA中能夠形成另外一種特殊的DNA結(jié)構(gòu)形式，十字形結(jié)構(gòu)，即具有反向重復(fù)序列的DNA的單鏈堿基分別自我互補(bǔ)配對而形成的一種二元對稱結(jié)構(gòu)［5，6］。生物體中很多遺傳性疾病都與機(jī)體內(nèi)的DNA重復(fù)序列有關(guān)［7］。強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成密切相關(guān)［8，9］。在基因調(diào)控區(qū)的 某些結(jié)合位點，小分子或蛋白質(zhì)與單鏈D NA具有高親和力，從而易于結(jié)合到單鏈DNA［10，11］。迄今為止，特殊結(jié)構(gòu)的DNA已成為藥物開發(fā)中潛在 的重要靶點。

與DNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)相似，DNA十字形結(jié)構(gòu)與許多遺傳過程密切相關(guān)。DNA的十字形突出結(jié)構(gòu)參與了機(jī)體的某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控、重組和復(fù)制。十字形結(jié)構(gòu)在真核和原核生物基因組中廣泛存在［12-14］，通常會在啟動子、增強(qiáng)子或終止子等基因調(diào)控區(qū)內(nèi)形成。有研究報道十字形結(jié)構(gòu)DNA通過與有關(guān)蛋白結(jié)合在芽殖酵母復(fù)制起源中發(fā)揮重要作用［15，16］。十字形結(jié)構(gòu)的形成促進(jìn)局部堿基對解除配對，有助于桿狀病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程［17］。在牛酪氨酸羥化酶基因啟動子的上游區(qū)域的十字形結(jié)構(gòu)，可作為激活或阻遏蛋白控制細(xì)胞特異性啟動子活性的目標(biāo)位點［18］。在pBR322質(zhì)粒的“-35”區(qū)域的十字形結(jié)構(gòu)能夠影響啟動子與聚合酶的相互作用［19］。在Alu元件（靈長類動物特有的約300 bp長的重復(fù)序列）下游形成的十字形結(jié)構(gòu)可明顯抑制T細(xì)胞特異性增強(qiáng)子的作用［20］。因此，有必要深入了解十字形結(jié)構(gòu)DNA的形成過程以及進(jìn)一步揭示它們的生物學(xué)作用。

研究DNA十字形結(jié)構(gòu)最常用的方法是使用酶裂解法把目標(biāo)DNA酶解成碎片，然后通過分析不同DNA片段來判斷十字形結(jié) 構(gòu)的位置［20-22］。然而，使用這種方法存在兩點不足之處：一是破壞目的基因二級結(jié)構(gòu)；二是十字形結(jié)構(gòu)形成中的某些特異性信息幾乎很少能夠被檢測出來。熒光光譜法是研究核酸結(jié)構(gòu)信息的一種重要方法，同時也有利于研究在體內(nèi)或者體外溶液中不同濃度條件下它們之間的相互作用。天然的DNA堿基能夠吸收200-300 nm區(qū)間的紫外輻射，但是激發(fā)態(tài)壽命很短，只有較弱的內(nèi)源熒光，熒光量子產(chǎn)量很低。很多種熒光核酸堿基類似物被合成并摻入到DNA中［23，24］。PdC是一種能監(jiān)測核酸二級結(jié)構(gòu)的熒光堿基類似物，首先，它類似于天然堿基脫氧胞苷而不破壞雙鏈結(jié)構(gòu)的形成，此外，它有很大的斯托克斯位移并且熒光對環(huán)境因素的改變很敏感［25］。

本實驗在沒有改變pBR322質(zhì)粒原有結(jié)構(gòu)的前提下，用PdC分別代替3 195、3 222和3 281位置上的dC。根據(jù)配對的PdC的熒光壽命比非配對的短的理論，用時間分辨熒光光譜方法分別研究3195、3222和3281位置處的時間分辨熒光壽命。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶BbvC I、Nb. BbvC I、Dpn I，deep vent DNA聚合酶，T4連接酶和pBR322 質(zhì)粒購買于New England Biolabs公司；純化的大腸桿菌（E.coli）DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶I購買于TopoGEN公司；寡核苷酸（引物，PdC寡核苷酸）購買于Midland Certified Reagent Company公司；XL10-gold感受態(tài)細(xì)胞購買于Stratagene公司。酶和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的使用嚴(yán)格按照制造商的指示說明進(jìn)行。2700型PCR擴(kuò)增儀（GeneAmp PCR System 2700）購買于Applied Biosystems公司。定點突變試劑盒（QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit）購買于Stratagene公司。凝膠回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid mega kit）均購買于QIAGEN公司。穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜儀購買于美國ISS公司。實驗中使用的其他材料見表1。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR反應(yīng)體積為50 μL，pBR322質(zhì)粒的量為100 ng，引物為70 ng，dNTP的濃度為250 μmol/L，DNA聚合酶為5 U 的deep vent。PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性30 s，在50℃退火50 s和72℃延伸8 min，經(jīng)25次循環(huán)后，樣品儲藏于4℃過夜。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取與 純化 用Dpn I內(nèi)切酶處理PCR擴(kuò)增完成后的片段， 然后將突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)入XL10-gold超級感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化操作步驟嚴(yán)格按照定點突變試劑盒說明書進(jìn)行。質(zhì)粒提取和純化嚴(yán)格按照質(zhì)粒提取 和純化手冊操作。純化后產(chǎn)品用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。突變的質(zhì)粒DNA由Seqwright公司測序分析。

1.2.3 酶切與純化 用限制性內(nèi)切酶Nb. BbvC I酶切雙突變的pBR322質(zhì)粒，處理方法嚴(yán)格按照內(nèi)切酶的說明書。應(yīng)用凝膠回收試劑盒，獲得純化的長的酶切DNA片段。

1.2.4 pBR322載體與含PdC的片段連接 將酶切后純化的DNA片段（pBR322載體）和含有PdC的113堿基序列的DNA片段進(jìn)行連接。處理如下：將含有PdC的 DNA片段與pBR322載體混合（280∶1），將混合溶液置于75℃水浴中20 min，然后自 然冷卻至室溫。隨后加入5 U T4 DNA連接酶。反應(yīng)體系于25℃孵育不同時間（10、30、60、90 min）和37℃條件下孵育120 min。最后用含有0.5 μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析鑒定。

1.2.5 連接后處理（純化） 將1.2.4的體系加熱到80℃維持20 min從而使T4 DNA連接酶失活。加入1 U的促旋酶置于37℃水浴中孵 育2 h后，應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

表1 實驗中所用到的DNA序列

1.2.6 穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜分析 選擇穩(wěn)態(tài)激發(fā)波長為375 nm，發(fā)射波長為425 nm測定pBR322質(zhì)粒的時間分辨熒 光光譜和穩(wěn)態(tài)光譜。室溫下，在固定波長為375 nm的激發(fā)光作用下，檢測樣品發(fā)射熒光強(qiáng)度在 390 nm和570 nm波長之間的分布情況。并檢測在波長為280 nm和380 nm之間的激發(fā)光作用下，樣品在發(fā)射波長為 425 nm處的熒光強(qiáng)度。時間分辨激發(fā)光譜用具有激發(fā)和發(fā)射單色器的K2多頻互相關(guān)相位調(diào)制熒光儀，采用相位調(diào)制方式收集。室溫下，使用含二甲基POPOP激光燃料的無水乙醇溶液（其熒光壽命在無水乙醇為1.45 ns）作為參考。氙燈為樣品激發(fā)源。采用單指數(shù)擬合，利用ISS187衰減分析軟件對相位延遲和調(diào)制延遲進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 野生型pBR322和擴(kuò)增后的pBR322的電泳圖的比較

pBR322質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后，由1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）可以看出，野生型pBR322質(zhì)粒與擴(kuò)增后的pBR322質(zhì)粒圖譜相似，說明 pBR322質(zhì)粒成功被擴(kuò)增出來。

2.2 細(xì)胞擴(kuò)增pBR322的電泳圖

將突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)入XL10-gold超級感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒提取和純化后1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）表明，成功獲得突變的pBR322質(zhì)粒。

2.3 雙突變型pBR322質(zhì)粒的酶切鑒定

雙突變的質(zhì)粒因為被酶切了兩次，一條含有113個堿基的DNA片段被釋放出來，因此，泳道2所顯示的DNA的泳動速度比泳道4的DNA稍快（圖3）。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

圖2 純化產(chǎn)物凝膠電泳

圖3 酶切鑒定凝膠電泳

2.4 連接產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

用溴化乙錠處理后的共價閉合雙鏈DNA環(huán)，極易形成正超螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致連接后的超螺旋產(chǎn)物比對照pBR322的泳動速度快（圖4）。從泳道7可以看出，當(dāng)溫度升高時，連接產(chǎn)物的產(chǎn)量增多，所以減少了酶切質(zhì)粒。

圖4 不同時間連接產(chǎn)物凝膠電泳

2.5 純化后的PdC-pBR322連接產(chǎn)物電泳圖

超螺旋和松弛型PdC-pBR3222的含量足夠用于穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜的測量（圖5）。

圖5 連接產(chǎn)物純化凝膠電泳

圖6 質(zhì)粒的穩(wěn)態(tài)熒光圖譜分析

2.6 穩(wěn)態(tài)熒光分析

穩(wěn)態(tài)熒光分析結(jié)果（圖6）顯示，PdC-pBR322（3195）和PdC-pBR322（3281）的激發(fā)和發(fā)射光譜沒有顯著變化。松弛型和超螺旋PdC-pBR322光譜幾乎相同。然而，能夠觀察到松弛型的PdC-pBR322（3222）的激發(fā)和發(fā)射光譜淬滅，這表明超螺旋PdC-pBR322（3222）中PdC沒有配對，十字形環(huán)狀部分含有PdC。

2.7 時間分辨熒光壽命

熒光壽命檢測結(jié)果（表2）表明，熒光壽命長短相當(dāng)接近，除了超螺旋PdC-pBR322（3222）的熒光壽命1.72 ns比松弛型PdC-pBR322（3222）的熒光壽命1.42 ns大約延長了0.3 ns。結(jié)果表明，超螺旋PdC-pBR322（3222）中PdC沒有配對，這可能意味著在這個位置形成了一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

表2 質(zhì)粒熒光壽命檢測結(jié)果

2.8 鹽濃度對熒光壽命的影響

應(yīng)用熒光壽命探討了溶液中離子強(qiáng)度對PdC-pBR322的作用。結(jié)果（圖7）顯示，隨著鹽濃度的增加，熒光壽命有變化，然而，當(dāng)鹽濃度低于20 mmol/L時，壽命變化相對較大，但仍不顯著，表明十字形結(jié)構(gòu)在該實驗研究的鹽濃度范圍內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7 不同鹽濃度下的熒光壽命變化

3 討論

十字形結(jié)構(gòu)DNA與復(fù)制，基因表達(dá)調(diào)控，核小體結(jié)構(gòu)重組等生物過程有關(guān)，也與癌癥、沃納氏綜合征等疾病的演變與發(fā)展有密切聯(lián)系［26］。很多蛋白質(zhì)與十字形結(jié)構(gòu)DNA的識別與結(jié)合有關(guān)。在轉(zhuǎn)錄過程中高遷移率族蛋白家族（HMGB）、乳腺癌1號蛋白（BRCA1）等優(yōu)先與十字形結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合［27，28］。研究表明，P53在體內(nèi)更易于結(jié)合錯配的雙鏈、十字形結(jié)構(gòu)等非典型DNA［29，30］。14-3-3蛋白能夠在DNA復(fù)制的S期通過與復(fù)制起始暫時形成的十字形結(jié)合參與真核生物的DNA復(fù)制過程［31］。因此，十字形結(jié)構(gòu)DNA的形成過程以及其發(fā)揮的生物學(xué)作用有待深入研究。

在本實驗中我們探討了如何用PdC取代特定位點的dC摻入pBR322質(zhì)粒，并用穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜法來探測十字形結(jié)構(gòu)DNA的形成。該實驗方法與酶解消化法相比，pBR322質(zhì)粒不用被酶解成不同DNA片段，因此適用于研究某些完整質(zhì)粒特性的實驗，如超螺旋結(jié)構(gòu)條件下蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)合。盡管在連接步驟中的產(chǎn)率很低，但PdC的熒光非常敏感，濃度為1 ng/mL足夠應(yīng)用于熒光光譜測量。

本實驗由3種不同位點引入PdC的光譜分析結(jié)果分析推測，當(dāng)DNA片段中只有PdC位點不與G配對時，只能夠形成“泡”的形式。唯有PdC位點不與G形成配對，且該DNA具有反向重復(fù)序列，其單鏈DNA在被PdC取代位點相鄰的兩側(cè)能夠互補(bǔ)配對形成一種二元對稱結(jié)構(gòu)時，才能夠形成十字形結(jié)構(gòu)（圖8）。

圖8 PdC-pBR322（3222）質(zhì)粒中形成的十字形結(jié)構(gòu)DNA

該實驗中光譜分析檢測了十字形結(jié)構(gòu)的形成，除鹽濃度對十字形結(jié)構(gòu)的形成影響不明顯，其余均與先前文獻(xiàn)報道的一致［32］。我們在鹽濃度為100 mmol/L NaCl中發(fā)現(xiàn)不配對的PdC，而酶解消化法分析在20 mmol/L 以上的NaCl中檢測不到這種十字環(huán)結(jié)構(gòu)DNA。光譜數(shù)據(jù)清楚地表明，即使在高鹽濃度下仍然存在十字形結(jié)構(gòu)DNA，因此我們推測更高的鹽濃度可能影響了酶的功能作用。

4 結(jié)論

用PdC取代質(zhì)粒中指定位置的dC而沒用改變質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并利用配對的PdC的熒光壽命比非配對的短的理論，用時間分辨熒光光譜分別測量了3 195、3 222和3 281位置的熒光壽命，得到3 222處的PdC未配對。根據(jù)3 222處的堿基序列特點（3 222處的堿基序列具有回文結(jié)構(gòu)），推斷出質(zhì)粒在該處具有十字形結(jié)構(gòu)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Steady-state and Time-resolved Fluorescence Spectroscopy to Detect the Cruciform Structure in pBR322

XIA Lan1，2ZHANG Xu2，3
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816；2. School of Pharmacy，Yancheng Teachers University，Yancheng 224051；3. Medical School of Nanjing University，Nanjing 210093）

The specific aim of this work is to probe the formation process of DNA with cruciform extrusion in a pBR322 plasmid using spectroscopic methods while without digesting DNA into pieces. Pyrrolo deoxycitidine（PdC）was incorporated into pBR322 to substitute for dC at specific sites of 3 195，3 222 or 3 281. Steady-state and time-resolved fluorescence were employed to examine the specific properties of PdC in the cruciform region. Results were as followings：1）Steady-state fluorescent properties indicated that the fluorescence intensity of supercoiled PdC-pBR322 was about 4-fold stronger than that of relaxed PdC-pBR322，when PdC was incorporated into pBR322 at position 3 222；meanwhile，its time-resolved lifetime was about 0.3 ns longer than that of relaxed PdC-pBR3322. When PdC was incorporated at position 3 195 or 3 281，there was no significant change in either steady-state fluorescence spectra or time-resolved lifetime（about 1.42 ns at both positions）. 2）Lifetimes changed a little with the increasing of salt concentration，but not significantly. In conclusion，by analyzing fluorescence spectra and lifetimes（both in relaxed state and supercoiled plasmid），a cruciform structure with dC at site 3 222 of impaired loop is formed，and the cruciform is stable within this investigated salt concentration range（0-100 mmol/L）.

cruciform extrusion；pBR322 plasmid；PdC；steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.028

2016-02-25

江蘇省六大人才高峰資助項目（swyy-030）

夏嵐，女，碩士研究生，研究方向：抗瘤大分子的活性研究；E-mail：XLxialan@163.com

張旭，男，副教授，研究方向：抗瘤大分子的活性研究；E-mail：zhangxthunder@sina.com