Mecp2在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中對NOTCH信號通路的調(diào)控

何麗番 高海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

Mecp2在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中對NOTCH信號通路的調(diào)控

何麗番 高海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

旨在探討Mecp2在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中的調(diào)控及機(jī)制。利用Notch轉(zhuǎn)基因魚，通過原位雜交技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)Mecp2在胚胎發(fā)育過程前期廣泛表達(dá)，隨后逐漸表達(dá)在腦部。在敲低Mecp2的胚胎中，Notch信號的表達(dá)明顯降低，注射Mecp2-RNA和胞內(nèi)NICD-RNA均能夠恢復(fù)這種表型，標(biāo)記神經(jīng)成熟的神經(jīng)因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map和RNA結(jié)合蛋白HUC表達(dá)下調(diào)。在敲低Mecp2后其靶分子轉(zhuǎn)錄抑制因子Hey2表達(dá)下調(diào)，敲低Mecp2阻礙了神經(jīng)細(xì)胞的正常分化成熟，結(jié)果表明Mecp2能夠通過Notch-Hey2信號通路來調(diào)控斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞的分化。

Mecp2；斑馬魚；神經(jīng)發(fā)育；Notch信號通路；神經(jīng)細(xì)胞分化

Mecp2基因突變導(dǎo)致瑞氏綜合征［1］（Rett syndrome，RTT），是一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，典型RTT的臨床特征為，出生后6-18個(gè)月生長發(fā)育基本正常，隨后出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育停滯或倒退。到目前為止，人們尚不清楚Mecp2在細(xì)胞中的功能。Bird［2］推測其在保護(hù)或維持細(xì)胞功能完整性起作用。Mecp2基因敲除小鼠可正常出生，但壽命較短，會出現(xiàn)一些RTT的癥狀［3，4］。Notch信號通路在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中扮演著重要角色，維持著神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡之間的平衡，對細(xì)胞分化命運(yùn)起決定性作用。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段（NICD）釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活Hey、Hers、Hes等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用［5-8］。本實(shí)驗(yàn)選用斑馬魚作為研究對象，探討Mecp2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對Notch通路中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)質(zhì)粒：pGEX-4T-1載體。斑馬魚：實(shí)驗(yàn)用斑馬魚野生型品系為TL與AB。轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系NotchTg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry），Tg（neurod：EGFP）。Mecp2-MO（morpholino oligo）：GeneTools公司，5'-TCTGCGGCGGCCATTTTTATTTAAA-3'。Mecp2原位雜交探針序列：F：5'-CGGGATCCGGCAGGGGAAGCCCG-3'，R：5'-GTTGAATTCATTTTCCTGGA CTCTTTTCTATGACGCG-3'。

Mecp2抗體：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所胡克平實(shí)驗(yàn)室惠贈［9］。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚的飼養(yǎng) 斑馬魚生長于28.5℃環(huán)境下，以豐年蝦為食，循環(huán)水使用紫外滅菌水，水鹽度維持在450-500 μs/cm，pH值為7左右。在每晚喂食后與熄燈前，將雌魚和雄魚放于同一交配盒中，并用隔板將雌雄魚分開，放入約1/3的系統(tǒng)循環(huán)水。待第2天亮燈后，移除擋板，雌雄魚分別產(chǎn)下卵細(xì)胞和精子，并在水中受精。胚胎使用E3培養(yǎng)液，以保證胚胎的生理平衡。用于原位雜交的斑馬魚胚胎在受精后24 h左右換入含有0.0045% PTU（Sigma P7629）的1 × E3水溶液，以防止胚胎色素的生成。1.2.2 斑馬魚胚胎的顯微注射 顯微注射采用氣壓注射儀，用普通氮?dú)怛?qū)動，壓力設(shè)為0.3 PSI，從而防止液體回流。使用無齒鑷在體視鏡下將針頭折斷，盡量斷成斜切面，以便于注射。

1.2.3 斑馬魚胚胎免疫熒光染色 胚胎發(fā)育到所需時(shí)間，置于4% PFA在4℃過夜。PBST洗滌3次后，用30%蔗糖溶液置換。放入OCT包埋劑中，置于-80℃中冷卻樣品。將切片加入到預(yù)冷的丙酮于-20℃處理10 min。加入封閉液，室溫孵育1 h。加入一抗，4℃過夜，洗滌，再加入二抗，用含有DAPI的封片劑封片，避光保存。胚胎成像使用 Zeiss 700激光共聚焦顯微鏡的20倍水鏡，并用Imaris7.0（Bitplane）軟件處理拍攝的3D圖像。

1.2.4 斑馬魚胚胎原位雜交 制備 RNA探針，用雜交液將RNA探針稀釋10倍作為儲存液-80℃凍存。胚胎收集與固定，每管加入1 mL多聚甲醛固定，4℃過夜。次日進(jìn)行胚胎脫水，依次用25%甲醇的PBS溶液3-5 min、50%甲醇的PBS溶液3-5 min、75%甲醇的水溶液3-5 min、100%甲醇處理并在-20℃放置至少2 h，也可存放-20℃。經(jīng)過胚胎復(fù)水，洗滌，蛋白酶K處理，預(yù)雜交，雜交，封閉，洗滌，染色，雜交后胚胎信號采集等過程。

2 結(jié)果

2.1 Mecp2在斑馬魚神經(jīng)發(fā)育過程中的表達(dá)

原位雜交結(jié)果顯示，Mecp2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，隨時(shí)空變化，在腦部呈現(xiàn)高表達(dá)，Mecp2從單細(xì)胞到24 h表達(dá)廣泛（圖1-A-D），48 h Mecp2在斑馬魚頭部高表達(dá)（圖1-E），且主要在細(xì)胞核表達(dá)，通過免疫熒光和蛋白印跡再次證實(shí)敲低Mecp2的胚胎中Mecp2蛋白表達(dá)明顯減少，同時(shí)也證明Mecp2-MO特異性顯著［9］。

2.2 注射Mecp2-MO斑馬魚表型變化

將Mecp2-MO稀釋成2 mmol/L 貯存液，注射時(shí)4倍稀釋，每胚注射2.3 nL。注射斑馬魚Mecp2-MO（圖2-D），28 h側(cè)觀相比野生型（圖2-C），個(gè)體變小，頭部結(jié)構(gòu)紋理不清晰，眼睛輪廓變小，尾部彎曲等各種表型變化；背觀頭部（圖2-F），28 h相比野生型（圖2-E），前腦、中腦、后腦結(jié)構(gòu)紋理模糊；15 d后，注射斑馬魚Mecp2-MO的魚（圖2-B），有部分死亡，存活下來大部分畸形，貌似正常的相比野生型（圖2-A），發(fā)育遲緩。

2.3 注射Mecp2-MO后NOTCH信號的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低Mecp2（圖3-B、D、F）相對野生型（圖3-A、C、E），觀察發(fā)現(xiàn)NOTCH轉(zhuǎn)基因魚胚胎頭部（前腦、中腦、后腦）和軀干部表達(dá)明顯下調(diào)，共注射Mecp2-RNA（鼠源，圖4-D）和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)，但單一注射RNA-Mecp2（鼠源，圖4-C）與野生型Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉(zhuǎn)基因魚胚胎相比較，其前腦、中腦表達(dá)明顯下調(diào)，但其后腦的表達(dá)變化不明顯。觀察到同時(shí)注射NICD-RNA和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)（圖4-H），但只注射NICD-RNA（圖4-G）與野生型（圖4-E）NOTCH轉(zhuǎn)基因魚胚胎相比較，頭部表達(dá)顯著提高。

圖1 Mecp2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)

圖2 注射Mecp2-MO后斑馬魚的表型變化

圖3 Mecp2對NOTCH信號表達(dá)影響

2.4 敲低Mecp2的胚胎，對神經(jīng)因子表達(dá)影響

注射Mecp2-MO后，胚胎免疫熒光顯示（圖5-A-F），在敲低Mecp2的胚胎中標(biāo)記分化成熟神經(jīng)細(xì)胞的蛋白Huc的表達(dá)與野生型胚胎相比明顯減少。標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞分化成熟的神經(jīng)因子Neurod Tg（neurod：GFP）相比野生型neurod的表達(dá)明顯減少（圖6-C），注射NICD-RNA后，相比野生型Neurod的表達(dá)并沒有明顯的變化（圖6-B），但共同注射NICD-RNA和Mecp2-MO后，其表型可恢復(fù)到正常狀態(tài)（圖6-D）。原位雜交結(jié)果顯示，敲低Mecp2的胚胎中相關(guān)神經(jīng)因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map（圖7-B、D、F、H、J）表達(dá)與野生型（圖7-A、C、E、G、I）相比較明顯減少。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低Mecp2雖然沒有造成斑馬魚腦部發(fā)育出現(xiàn)明顯的缺陷，但是神經(jīng)細(xì)胞分化成熟過程受到影響，神經(jīng)細(xì)胞處于分化不完全或遲緩的狀態(tài)。

2.5 注射Mecp2-MO后轉(zhuǎn)錄抑制因子Hey2的表達(dá)變化

原位雜交結(jié)果顯示，Hey家族成員hey2，在敲低Mecp2的胚胎中的表達(dá)與野生型胚胎（圖8-A）相比也明顯降低（圖8-B），背部神經(jīng)管消失。注射NICD-RNA（圖8-C）與野生型相比，沒有明顯變化，當(dāng)共同注射NICD-RNA+Mecp2-MO時(shí)發(fā)現(xiàn)背部神經(jīng)管能部分得到恢復(fù)（圖8-D），有一定比例胚胎的表達(dá)回到了正常水平。實(shí)驗(yàn)表明敲低Mecp2胚胎中，Hey2的表達(dá)也降低，抑制Mecp2的低表達(dá)相應(yīng)hey2的表達(dá)也得到提高。

圖4 Mecp2-RNA-和NICD-RNA能夠rescue敲低Mecp2-Tg（Tp1bglob∶hmgb1-mCherry）轉(zhuǎn)基因魚的表型

3 討論

有研究表明［10，11］，Notch信號通路對于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。在斑馬魚突變體mind bomb（mib）中，Notch信號通路活性減弱，標(biāo)記分化成熟神經(jīng)細(xì)胞的基因如huc表達(dá)明顯增加。Notch信號對于激活許多Hairy and Enhancer-of-split［H/E（Spl）］基因是必需的，這些基因通過抑制神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄從而影響了神經(jīng)細(xì)胞正常的分化成熟過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制Mecp2的胚胎中Notch信號本身減弱，以及NICD（Notch intracellular domain）直接的靶基因hey2，在斑馬魚腦部的表達(dá)與野生型胚胎相比都明顯降低（圖3-B、D），這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，敲低Mecp2后Notch信號通路活性減弱。

圖5 敲低Mecp2對RNA結(jié)合蛋白HUC表達(dá)的影響

圖6 Mecp2對Neurod Tg（Neurod：GFP）信號表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低Mecp2后（圖3-B），觀察到Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉(zhuǎn)基因魚胚胎頭部前腦、中腦、后腦表達(dá)明顯下調(diào)，共注射Mecp2-RNA（鼠源，圖3-C）和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)，但注射 Mecp2-RNA（鼠源，圖4-C）與野生型Notch轉(zhuǎn)基因魚胚胎相比較，其前腦、中腦表達(dá)明顯下調(diào)，但其后腦的表達(dá)變化不明顯。同時(shí)也觀察到，同時(shí)共注射RNA-NICD和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)（圖4-H），但只注射NICD-RNA（圖4-G）與野生型Notch轉(zhuǎn)基因魚胚胎相比較，頭部表達(dá)顯著提高。注射Mecp2-RNA和NICD-RNA都能夠恢復(fù)Mecp2-MO敲低的表型，說明Mecp2在神經(jīng)發(fā)育過程中起非常重要的作用，并對Notch信號通路具有調(diào)控作用。從而激活HEY家族堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（Basichelix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。

圖7 Mecp2對Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map不同神經(jīng)因子表達(dá)的影響

圖8 Mecp2對Hey2表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚Mecp2存在母源表達(dá)，發(fā)育早期廣泛表達(dá)，從胚胎受精后24 h表達(dá)開始增加，隨著發(fā)育的進(jìn)程逐漸集中在腦部，到受精后48 h表達(dá)集中于頭部（圖1）。敲低Mecp2影響斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞的分化成熟；從而實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞分化成熟的精細(xì)調(diào)控。敲低Mecp2的斑馬魚胚胎腦部發(fā)育正常但是總體積變小，能夠正確分隔成為前腦、中腦和后腦；神經(jīng)細(xì)胞的增殖正常；標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的基因如ngn1、pax2、pax3、neurod、map2、eno2和蛋白Huc的表達(dá)明顯減少（圖7）。Mecp2基因敲除小鼠神經(jīng)細(xì)胞增殖正常，樹突分支復(fù)雜度降低，電生理活性降低［12］；最新研究表明，敲除Mecp2后小鼠神經(jīng)細(xì)胞胞核以及胞體變小，單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成都減少［13］；但抑制Mecp2表達(dá)的斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞增殖也正常；樹突分支復(fù)雜度和電生理活性本實(shí)驗(yàn)沒有分析；運(yùn)動神經(jīng)元的胞體大小需統(tǒng)計(jì)定量才能得出結(jié)論；標(biāo)志成熟神經(jīng)細(xì)胞的基因如map2的表達(dá)也明顯減少。因此認(rèn)為，Mecp2對于不同物種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響還是存在一定差異的。這種功能上的差異可能是因?yàn)镸ecp2在不同物種發(fā)育過程中表達(dá)的時(shí)空差異造成的。

在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)敲低Mecp2后，觀察到Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉(zhuǎn)基因魚胚胎頭部前腦、中腦、后腦表達(dá)明顯下調(diào)，共注射RNA-Mecp2和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)，共注射RNA-NICD和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復(fù)，說明Mecp2或其復(fù)合物在notch信號通路中起抑制作用。之前的文獻(xiàn)報(bào)道，Mecp2能夠與轉(zhuǎn)錄活化因子cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）相互作用，介導(dǎo)基因啟動子區(qū)的活化［14］。Mecp2還能夠和Y盒結(jié)合蛋白1（YB-1）［15］，PRPF3（pre-mRNA processing factor 3）［16］相互作用，調(diào)節(jié)基因mRNA的剪切，找到的Mecp2結(jié)合蛋白具有明確的轉(zhuǎn)錄激活功能和mRNA剪切功能，將進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合蛋白在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育中的功能，但hey2如何調(diào)控notch信號通路活性的，尚不清楚，這是下一步需要認(rèn)真研究的問題。

4 結(jié)論

Mecp2在胚胎神經(jīng)發(fā)育前期廣泛表達(dá)，敲除Mecp2能延緩胚胎神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，Mecp2能夠通過Notch-Hey2信號通路來調(diào)控斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞的分化。

［1］Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2［J］. Nature Genetics, 1999, 23：185-188.

［2］Gitschier J. On the Track of DNA Methylation：An Interview with adrian bird［J］. PLoS Genet, 2009, 5（10）：e1000667.

［3］Chen RZ, Akbarian S, Tudor M, Jaenisch R . Deficiency of methyl-CpG binding protein-2 in CNS neurons results in a Rett-like phenotype in mice［J］. Nature Genetics, 2001, 27：327-331.

［4］Guy J, Hendrich B, Holmes M, et al. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome［J］. Nature Genetics, 2001, 27：322-326.

［5］Weng AP, Ferrando AA, Lee W, et al. Activating mutations of Notch1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia［J］. Science, 2004, 306（5694）：269-271.

［6］Radtke F, Schweisguth F, Pear W. The Notch ‘gospel’-workshop on notch signalling in development and cancer［J］. EMBO Reports, 2005, 6（12）：1120-1125.

［7］De Strooper B, Annaert W, Cupers P. A presenilin-1-dependent r-secretase-like protease mediates release of Notch intraCellular domain［J］. Nature, 1999, 398（6727）：518-522.

［8］Iso T, Kedes L, Hamamori Y. HES and HERP families：multiple effectors of the Notch signaling pathway［J］. Journal of Cellular Physiology, 2003, 194（3）：237-255.

［9］ Gao H, Bu Y, Wang X, et al. Mecp2 regulates neural cell differentiation by suppressing the Id1-Her2/Hes5 axis in zebrafish［J］. Journal of Cell Science, 2015, 128（12）：2340-2350.

［10］ Louvi A, Artavanis-Tsakonas S. Notch signalling in vertebrate neural development［J］. Nature Reviews Neuroscience, 2006, 7（2）：93-102.

［11］ Fortini ME. Notch Signaling：The core pathway and its posttranslational regulation［J］. Developmental Cell, 2009, 16（3）：633-647.

［12］Kishi N, Macklis JD. MECP2 is progressively expressed in postmigratory neurons and is involved in neuronal maturation rather than cell fate decisions［J］. Molecular and Cellular Neuroscience, 200, 27：306-321.

［13］ Li Y, Wang H, Muffat J, et al. Global transcriptional and translational repression in human-embryonic-stem-cell-derived rett syndrome neurons［J］. Cell Stem Cell, 2013, 13：446-458.

［14］Chahrour M, Jung SY, Shaw C, et al. Mecp2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription［J］. Science, 2008, 320：1224-1229.

［15］Young JI, Hong EP, Castle JC, et al. Regulation of RNA splicing by the methylation-dependent transcriptional repressor methyl-CpG binding protein 2［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102：17551-17558.

［16］Long SW, Ooi JY, Yau PM, Jones PL. A brain-derived Mecp2 complex supports a role for Mecp2 in RNA processing［J］. Bioscience Reports, 2011, 31：333-343.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Regulation of Mecp2 on Notch Signaling Pathway During Early Neural Development of Zebrafish Embryos

HE Li-fan GAO Hai
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

This study aims to explore the regulation role and mechanism of Mecp2 during early neural development of zebrafish embryos. By the techniques of confocal laser scanning microscopy and in situ hybridization，and using Notch transgenic fish，it was found that Mecp2 widely expressed in the early embryonic development，then gradually expressed in the brain. In the embryos with Mcep2 knockdown，the expression of Notch signal decreased，and both the injection of Mcep2-RNA and intracellular INCD-RNA restored the phenotype. The expression of neural factors of Ngn1，Pax2，Pax3，Eno2，and Map labelling for neural maturation as well as HUC binding with RNA were downregulated. After Mecp2 knocked down，the expression of transcriptional repressor Hey2 downregulated because the knockdown hindered the differentiation and maturation of neural cells. Our study showed that Mecp2 regulated the differentiation of nerve cells of zebrafish through Notch-Hey2 signaling pathways.

Mecp2；zebrafish；neurodevelopmental；Notch signaling pathway；neural cell differentiation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.031

2015-09-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011CB504700）

何麗番，女，碩士研究生，研究方向：分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控；E-mail：helifan89@163.com

高海，博士，副教授，研究方向：蛋白功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；E-mail：scaugh@163.com