紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及灰霉病拮抗菌的篩選

周泠璇 劉婭

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及灰霉病拮抗菌的篩選

周泠璇 劉婭

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

旨在從新疆紅提葡萄的不同部位中，分離篩選出對葡萄灰霉病具有較強拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。采用組織分離法對紅提葡萄不同部位的內(nèi)生細(xì)菌進行分離，同時進行16S rDNA序列測定及同源性分析，并采用平板對峙法和濾紙片法進行篩選，研究其對葡萄灰霉菌的抑制作用。結(jié)果表明，在分離得到的18株內(nèi)生細(xì)菌中，有5株具有良好的拮抗效果，分別為NR4-1、NR5-1、NG4-1、NP1-1和PG1，抑菌率可達(dá)68.7%。

內(nèi)生細(xì)菌；葡萄灰霉菌；拮抗作用；分離；鑒定

葡萄營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是世界產(chǎn)量最大的水果之一［1，2］。新疆是我國葡萄的主產(chǎn)區(qū)，在地區(qū)水果種植業(yè)中占有重要地位［3］。近年來，紅提葡萄作為新疆鮮食葡萄優(yōu)良品種之一，栽培面積迅速增加，發(fā)展前景廣闊［4］。然而，紅提葡萄在采后貯藏運輸期間，灰霉病病害發(fā)生普遍而且嚴(yán)重，給生產(chǎn)造成巨大損失，成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要障礙［5］。長久以來一直使用化學(xué)殺菌劑來抑制葡萄灰霉病，但此類傳統(tǒng)保鮮法易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、危害人體健康以及病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題，也制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［6，7］，而生物保鮮法為解決上述問題提供了新的契機。

植物內(nèi)生菌是指存活在健康植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群［8，9］。它們在長期的協(xié)同進化過程中，與植物形成互惠互利的共生關(guān)系［10］。植物內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生活性物質(zhì)，如抗菌肽、生物堿和幾丁質(zhì)酶等［11，12］，對生物防治和穩(wěn)定生態(tài)環(huán)境有一定作用。目前，內(nèi)生細(xì)菌抑制病原菌的研究受到越來越多的關(guān)注，已有從駿棗［13］、辣椒［14］、小麥［15］等多種植物內(nèi)分離篩選出具有抗病作用的內(nèi)生細(xì)菌的報道，但內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于果蔬采后病害防治的研究相對較少，因此分離并利用植物自身的內(nèi)生細(xì)菌來控制果蔬采后病害對生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究采用組織分離法，從健康紅提葡萄的果梗、果皮、果肉、果籽中分離出內(nèi)生細(xì)菌，探索其對葡萄灰霉菌的拮抗作用，篩選具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，從而為葡萄灰霉病的生物防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紅提葡萄（Red Grape）采自新疆省石河子143團葡萄園，封存于封口袋中，帶回實驗室進行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

1.1.2 病原菌 葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基［16］的分離純化培養(yǎng)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2；PDA培養(yǎng)基［17］：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

1.2 方法

1.2.1 紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 取新鮮、完整、無病害的紅提葡萄，用自來水將表面沖洗干凈。常規(guī)無菌操作下，用75%的乙醇溶液浸泡3 min，并用無菌水沖洗4次，再用10%的次氯酸鈉溶液浸泡15-30 s，無菌水沖洗4次，之后用無菌濾紙擦干［18］。取最后一遍沖洗的無菌水做空白對照實驗，涂布NA于29℃下靜置培養(yǎng)7 d，若培養(yǎng)皿中無菌落出現(xiàn)，則證明消毒徹底。

將表面消毒后的紅提葡萄果實用無菌刀片切開，用鑷子撕取果皮、果肉并將果蒂、果籽切開緊貼NA平板進行培養(yǎng)，29℃培養(yǎng)3-5 d。待組織塊周圍長出菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、干濕度等挑取性狀不同的菌落反復(fù)劃線純化，直至得到單菌落，斜面4℃保存?zhèn)溆茫?9］。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分類鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征 根據(jù)菌落特性及菌體形態(tài)大小特征，革蘭氏染色等對內(nèi)生細(xì)菌進行初步鑒定［20］。

1.2.2.2 16S rDNA序列測定及同源性比對 內(nèi)生細(xì)菌DNA的提取采用常規(guī)CTAB法［21］。采用細(xì)菌通用引物 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'） 擴增16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)體系為：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、模板2 μL、Taq DNA 聚合酶1 μL、引物各1 μL，補充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進行分析后送北京市理化分析測試中心進行測序。

獲得各菌株序列后，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比對分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA序列。并利用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌對葡萄灰霉菌拮抗作用的測定

1.2.3.1 初篩 采用平板對峙法［22］進行初篩，將分離得到的內(nèi)生細(xì)菌菌株在NA平板上活化1 d后，用接種環(huán)挑取一環(huán)在PDA平板中央劃線，并將供試葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）分別接種在平板兩側(cè)，接種點具平板中心3 cm。同時以單獨接種灰霉菌菌餅的平板為對照，每處理做3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落直徑，從中篩選出抑菌活性強的拮抗菌進行復(fù)篩。

1.2.3.2 復(fù)篩 采用濾紙片法［23］進行復(fù)篩。將初篩出的拮抗菌活化并擴大培養(yǎng)制成106CFU/mL的菌懸液待用。將葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）放于PDA平板中央，然后在平板上接入4個沾有內(nèi)生菌發(fā)酵原液的圓濾紙片，并以沾有無菌水的濾紙片為對照。接種點具平板中心3 cm，每種處理均做3次重復(fù)。置于25℃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑。

病原菌抑菌效果用抑菌率衡量，抑菌率（%）=［1-（處理菌落直徑/對照菌落直徑）］×100%。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化結(jié)果

經(jīng)7 d觀察，最后一次清洗水涂布的NA平板中并未有任何菌體生長，證明表面消毒徹底，NA平板中分離得到微生物為紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌。

通過組織分離法，從紅提葡萄中共分離得到18株內(nèi)生細(xì)菌，不同組織部分分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌種類不同，且分離頻率不同。其中果梗中分離出6株（33%），果肉中分離出6株（33%），果皮中分離出5株（28%），果籽中分離出1株（6%）（表1）。雖然分離數(shù)量有限，但在一定程度上反映了紅提葡萄中內(nèi)生菌的多樣性。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分類鑒定結(jié)果

2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征 將分離得到的18株內(nèi)生細(xì)菌在NA固體平板上29℃培養(yǎng)1 d，根據(jù)性狀、顏色、透明度等菌落形態(tài)進行觀察，并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果（表2）顯示，篩選出的18株內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后，除PG1外均呈革蘭氏陽性，菌株均為桿狀、產(chǎn)芽孢。

2.2.216 S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取紅提內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，其中大部分PCR產(chǎn)物條帶清晰且單一，大小均約為1.5 kb，與預(yù)期目標(biāo)大小一致（圖1）。

表1 紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌的分離

表2 紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征

將所測得的16S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，用BLAST 進行相關(guān)序列的比對，結(jié)果（表3）表明菌株16S rDNA序列與已知序列的同源性均達(dá)到98%以上。同時從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬、相關(guān)種的16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

通過16S rDNA序列比對分析結(jié)果和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，分離得到的18株內(nèi)生細(xì)菌均為芽孢桿菌屬。其中枯草芽孢桿菌10株（NP2-2、NG1-1、NZ3-1、NR1-1、NR4-1、NR4-2、NR5-1、PP9、PG2和PG6），高溫芽孢桿菌3株（NP1-1、NG4-1和PG10），特基拉芽孢桿菌2株（NR2-1和NR3-1），短小芽孢桿菌1株（NP1-2），地衣芽孢桿菌1株（NP2-1），嗜熱溶胞土芽孢桿菌1株（PG1）?？莶菅挎邨U菌類為優(yōu)勢類群，占總數(shù)的55.6%。

2.3 內(nèi)生拮抗菌的篩選結(jié)果

2.3.1 初篩結(jié)果 采用平板對峙法對分離得到的18株內(nèi)生細(xì)菌進行拮抗篩選，初篩得到8株內(nèi)生細(xì)菌對葡萄灰霉菌有不同程度的拮抗作用（圖3），分別為NR3-1、NR4-1、NR5-1、NP1-1、NP2-2、NG4-1、PG1和PP9，占所分離菌株的44.4%。將初篩得到的8株菌進行復(fù)篩實驗。

圖1 部分菌株的16S rDNA基因擴增產(chǎn)物電泳圖譜

表3 紅提葡萄內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.3.2 復(fù)篩結(jié)果 采用濾紙片法對初篩得到的8株內(nèi)生細(xì)菌進行復(fù)篩實驗，其中5株內(nèi)生細(xì)菌對葡萄灰霉菌有較好的拮抗作用（表4），占所分離菌株的27.8%。其中，2株分離自葡萄果梗，2株分離自葡萄果肉，1株分離自葡萄果皮。NR4-1對葡萄灰霉菌抑菌效果最強，抑菌率可達(dá)68.7%。

3 討論

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的紅提內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 部分內(nèi)生細(xì)菌對葡萄灰霉病病原菌的拮抗效果

表45 株內(nèi)生細(xì)菌對葡萄灰霉菌的抑菌效果

葡萄灰霉病是由葡萄灰霉菌引起的一種世界性病害，其病菌具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點，多發(fā)生于葡萄貯藏運輸期間，引起果實腐爛，損失嚴(yán)重。目前對葡萄灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主，包括多菌靈、速克靈、撲海因等化學(xué)藥劑的使用仍是抑制病害的主要手段，但由于藥劑的連續(xù)使用，病菌的抗藥性產(chǎn)生迅速，使防效不斷下降，同時易造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的嚴(yán)重污染，危害人體健康［21］。為了減少化學(xué)殺菌劑的使用，確保果實的安全性，生物防治日益成為灰霉病控制中一條重要而有效的途徑。作為重要生防微生物之一的內(nèi)生細(xì)菌，可以通過提高植物抗病性、與病原菌競爭生態(tài)位或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)等發(fā)揮防病功效，且內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)不易受到外界環(huán)境條件的影響，可以較長時間發(fā)揮生物學(xué)作用，因此具有防治果蔬采后病害的優(yōu)勢［22］。目前用于防治灰霉菌的生防內(nèi)生菌種類很多，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢耐熱抗逆，具有突出的優(yōu)勢，在灰霉菌的防治中使用次數(shù)較多。其中主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。本實驗從紅提葡萄中分離出18株內(nèi)生細(xì)菌，均為芽孢桿菌，并將其用于葡萄灰霉病的生物防治中，其中5株內(nèi)生細(xì)菌對病菌具有較好的拮抗效果，抑菌率最高可達(dá)68.7%。本研究所分離篩選的內(nèi)生細(xì)菌是在體外條件下對病原菌進行的拮抗實驗，但其在活體上對病原菌的抑制能力是否和體外一致，能否對試驗以外的病原菌有抑菌作用，能否增加葡萄的抗病性，還需進一步研究驗證。

4 結(jié)論

本研究采用組織分離法從健康的紅提葡萄中分離得到18株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，均為芽孢桿菌屬。其中5株對葡萄灰霉菌具有較好的拮抗作用，分別為枯草芽孢桿菌、高溫芽孢桿菌和嗜熱溶胞土芽孢桿菌。NR4-1對葡萄灰霉菌的生長抑制作用尤其明顯，抑菌率達(dá)68.7%，具有潛在開發(fā)價值。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Red Grape，and Screening of Antagonistic Bacteria Against Botrytis cinerea

ZHOU Ling-xuan LIU Ya
（College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000）

This experiment aims to separate the endophytic bacteria，which have the strongly antagonistic effect on Botrytis cinerea，from different parts of red grape in Xinjiang. The tissue isolation was adopted to separate the endophytic bacteria from different parts of red grape，and concurrently 16S rDNA sequence determination and homology analysis were carried out. Meanwhile，the antagonistic effect of endophytic bacteria on B. cinerea was analyzed by confrontation culture method and disc diffusion assay method. The results showed that 5 of 18 strains of endophytic bacteria had solid antagonistic effect，they were NR4-1，NR5-1，NG4-1，NP1-1，and PG1 respectively，and the bacteriostasis rate reached 68.7%.

endophytic bacteria；Botrytis cinerea；antagonism；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.024

2015-10-08

國家自然科學(xué)基金項目（31460031），兵團博士資金專項（2014BB006）

周泠璇，女，碩士研究生，研究方向：果蔬加工與貯藏；E-mail：1427168798@qq.com

劉婭，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：L68274609@163.com