一個融合魏斯氏菌隱蔽質(zhì)粒的序列分析

王海娟戴雨珂蘇森森王英潘渠

（1. 成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500；3. 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都 610500）

一個融合魏斯氏菌隱蔽質(zhì)粒的序列分析

王海娟1戴雨珂2蘇森森1王英3潘渠1

（1. 成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500；3. 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都 610500）

從融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中發(fā)現(xiàn)一個隱蔽質(zhì)粒（pQJ012），測序結(jié)果顯示該質(zhì)粒大小為1 489 bp，堿基G+C含量為42.8%。BLAST結(jié)果顯示該質(zhì)粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分別為93%、92%。ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的復(fù)制蛋白（Rep），其氨基酸序列與質(zhì)粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%、85%。根據(jù)復(fù)制蛋白、dso和sso的序列特征，推定pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，是滾環(huán)復(fù)制pT181家族成員。質(zhì)粒pQJ012可能構(gòu)建為良好的表達載體。

融合魏斯氏菌；隱蔽質(zhì)粒；序列分析；復(fù)制蛋白

魏斯氏菌（Weissella）屬于乳酸菌（Lactic acid bacteria），近年來，魏斯氏菌在微生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)及發(fā)酵、工業(yè)、食品加工等方面的應(yīng)用開始受到研究者的關(guān)注。魏斯氏菌作為益生菌的一員，對胃腸道健康有一定的促進作用［1］。魏斯氏菌具有β-葡糖苷酶活性［2］，較好的抗真菌性［3］，能促進乳桿菌（Lactobacillus）的生長［4］。魏斯氏菌產(chǎn)生的乳酸和各種胞外多糖，對食品的風(fēng)味感官有一定的影響［5］。同時，相關(guān)魏斯氏菌新種的發(fā)現(xiàn)，證實其在食品的防腐方面也有著較大的應(yīng)用潛能［6］。魏斯氏菌益生性質(zhì)的廣泛應(yīng)用有待于其分子與基因水平更深層次的研究。

尋找新的質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)化率高的表達載體是促進魏斯氏菌基因工程發(fā)展的方法之一，也是魏斯氏菌走向?qū)嵺`應(yīng)用的有效途徑。2007年P(guān)ark等［7］首次從韓國泡菜分離的食竇魏斯氏菌（W. cibaria）中鑒定出3個質(zhì)粒，pKLCA、pKLCB和pKLCC。國內(nèi)學(xué)者在對發(fā)酵辣白菜的研究中，從食竇魏斯氏菌中分離出2個質(zhì)粒，其大小分別為3 000 bp和8 000 bp［8］。Kim等［9］從韓國泡菜分離得到的食竇魏斯氏菌（W. cibaria KLC140）中發(fā)現(xiàn)6種不同的質(zhì)粒，其中最小的質(zhì)粒長度為2 126 bp，命名為pKW2124，該質(zhì)粒的復(fù)制方式為θ復(fù)制。將pKW2124與slpA和 gfp 的融合基因連接，導(dǎo)入載體pUC19，形成一個8.6 kb的表面展示載體pKWCSLGFP。隨后，相關(guān)學(xué)者把pKW2124的復(fù)制起始點（ori）、核糖體結(jié)合位點（RBS）、復(fù)制蛋白（rep）基因插入克隆載體pUC19，形成載體pKUCm1。實驗發(fā)現(xiàn)，pKUCm1宿主范圍廣泛，包括魏斯氏菌屬（Weissella），乳球菌屬（Lactococcus），明串珠菌屬（Leuconostoc），乳桿菌屬（Lactobacillus），同時，含有啟動子的β-半乳糖苷酶基因被成功插入載體pKUCm1，形成可應(yīng)用于藍白斑篩選的質(zhì)粒pKUGal［7］。目前，已發(fā)現(xiàn)的魏斯氏菌質(zhì)粒還非常有限，而以上已被發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒中除pKW2124的復(fù)制方式被證實為θ復(fù)制外，其余質(zhì)粒復(fù)制方式都不明確。新質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)對魏斯氏菌分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的研究具有重要意義。

本研究從融合魏斯氏菌QJ012菌株中分離出一個隱蔽性質(zhì)粒，并對該質(zhì)粒進行測序和分析，旨在構(gòu)建為良好的表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pUC57為廣州艾基有限生物公司提供，T載體試劑盒、革蘭陽性菌基因組提取試劑盒和PCR（Ex Taq）購自大連寶生物公司（TaKaRa）。質(zhì)粒提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司（Bio-Tek USA），限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司。培養(yǎng)條件：MRS培養(yǎng)基［10］37℃靜置培養(yǎng)18-48 h。

1.2 方法

1.2.1 魏斯氏菌的分離鑒定 菌株QJ012樣本來自湖南泡菜。將泡菜樣品在MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取生長的單菌落進行革蘭染色觀察。魏斯氏菌應(yīng)該為紫紅色的短桿狀細菌。培養(yǎng)篩選出的革蘭陽性菌，用革蘭陽性菌基因組提取試劑盒提取基因組。根據(jù)細菌16S rDNA基因的高度保守，利用細菌16S rDNA通用引物對（正義：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反義：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'），擴增QJ012菌株的16S rDNA基因。PCR擴增片段通過膠回收純化，然后進行A-T克隆，最后送到成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 生化鑒定 過氧化氫酶試驗采用傳統(tǒng)方法進行。葡萄糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖的發(fā)酵產(chǎn)酸試驗使用細菌微量生化管進行，培養(yǎng)方式為37℃靜置培養(yǎng)［11］。

1.2.3 質(zhì)粒提取與測序 離心收集融合魏斯氏菌QJ012菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pQJ012，膠回收試劑盒分離純化質(zhì)粒條帶。將分離純化得到的質(zhì)粒委托廣州艾基生物有限公司進行測序，方法為物理破碎后導(dǎo)入載體pUC57，然后測序。

1.2.4 酶切鑒定 測序后通過分析pQJ012具有的酶切位點，使用HindⅢ和Nhe I 對質(zhì)粒提取液進行雙酶切，通過分析酶切前后條帶大小，鑒定其能否被相應(yīng)限制性內(nèi)切酶切開。

1.2.5 質(zhì)粒相似性鑒定及序列注釋 利用序列比對工具BLAST，在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對融合魏斯氏菌質(zhì)粒pQJ012的測序結(jié)果，檢索該質(zhì)粒與已知魏斯氏菌質(zhì)粒的同源性。利用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder（Open reading frame finder）尋找該質(zhì)?？赡艽嬖诘拈_放閱讀框（ORF）。利用DNAMAN（V6）軟件標注該質(zhì)粒的重要酶切位點。

1.2.6 復(fù)制方式推定 通過分析質(zhì)粒pQJ012的Rep以及dso和sso保守序列，推導(dǎo)pQJ012復(fù)制方式所屬家族及其可能的復(fù)制方式。

2 結(jié)果

2.1 魏斯氏菌的分離鑒定

從樣本中分離出一株魏斯氏菌，在MRS平板培養(yǎng)基上，魏斯氏菌形成透明的小菌落，呈微隆起圓狀輪廓；革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌呈革蘭氏陽性，短桿狀，將其命名為QJ012。QJ012菌株的16S rDNA基因擴增片段長1 631 bp，序列比對結(jié)果表明，融合魏斯氏菌（W.confusa Inje LM S-338）的16S rDNA序列（GenBank：DQ321751.1）是與擴增片段最相似的序列，相似性為99.9%，1 569 bp中有2個堿基不同；其次是魏斯氏菌（Weissella sp. MMZ50B，GenBank：EU157913.1），相似性為99.7%，1 546 bp中有5個堿基不同。QJ012菌株的16S rDNA基因同與其最相似的融合魏斯氏菌的16S rDNA基因差異僅為0.01 %，可判斷QJ012菌株為融合魏斯氏菌。

2.2 生化試驗驗證

融合魏斯氏菌QJ012的生化試驗結(jié)果為不產(chǎn)生過氧化氫酶，不能利用L-阿拉伯糖，發(fā)酵葡萄糖、纖維二糖、半乳糖和麥芽糖均產(chǎn)酸，符合魏斯氏菌屬和融合魏斯氏菌種的生化特征。生化試驗結(jié)果符合分子鑒定的結(jié)論。

2.3 質(zhì)粒提取與序列測定

融合魏斯氏菌QJ012質(zhì)粒提取液電泳結(jié)果（圖1）顯示該提取液有2個條帶，分別為1.5 kb和14.5 kb，提示QJ012可能攜帶兩個質(zhì)粒。將較小的條帶代表的質(zhì)粒命名為pQJ012，分離純化該質(zhì)粒，委托廣州艾基生物有限公司進行測序。測序后發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒大小為1 489 bp，測序結(jié)果提交GenBank，登錄號為：KR973434。

2.4 酶切鑒定

通過DNAMAN軟件對pQJ012序列的酶切位點分析顯示其能被HindⅢ和Nhe I切開。兩個酶切位點相距347個堿基，雙酶切后，質(zhì)粒將被切為347 bp和1 142 bp兩個線性片段。融合魏斯氏菌質(zhì)粒提取液經(jīng)雙酶切后電泳結(jié)果（圖1）顯示有0.3 kb、1.1 kb、1.2 kb、2 kb和13 kb共5條條帶，其中0.3 kb與1.1 kb條帶應(yīng)為pQJ012被切開后產(chǎn)生的條帶，1.2 kb、2 kb和13 kb條帶應(yīng)為14.5 kb條帶所代表質(zhì)粒被切開后產(chǎn)生的條帶。

圖1 融合魏斯氏菌質(zhì)粒pQJ012酶切鑒定電泳圖

2.5 質(zhì)粒相似性鑒定及序列注釋

質(zhì)粒pQJ012的G+C含量為42.8%，BLAST比對結(jié)果顯示，該質(zhì)粒的核苷酸序列與食竇魏斯氏菌中已被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pJY33（2 365 bp）、pKLCA（1 490 bp）最為相似，與pJY33（GenBank number：KF879106.1）的相似性為93%，1 454 bp中相似序列長度為1 354 bp；與pKLCA（GenBank number：AY188776.1）的相似性為92%，1 498 bp中相似序列長度為1 364 bp。目前，pJY33與pKLCA在PubMed尚無文獻可供查閱。通過ORF搜索，pQJ012有5個ORF，ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的蛋白，從593 bp到1 441 bp，應(yīng)為該質(zhì)粒的復(fù)制蛋白（Rep）（圖2）；其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白。該Rep的氨基酸序列與pJY33和pKLCA的Rep氨基酸序列同源性分別為91%和85%。 該質(zhì)粒沒有編碼影響菌株表型的蛋白，應(yīng)歸為隱蔽質(zhì)粒。

圖2 質(zhì)粒pQJ012的物理圖譜

2.6 復(fù)制方式推定

滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒必須攜帶dso和sso位點，并編碼相關(guān)復(fù)制蛋白，根據(jù)dso和復(fù)制蛋白的不同，滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒至少被分為7大家族：pT181、pC194/pUB110、pE194/pLS1、pSN2、pGA1、pG13和pTX14［12］。pT181家族的復(fù)制蛋白的保守結(jié)構(gòu)域是pfam02486，dso位點有三項特征：復(fù)制蛋白切開位點nic區(qū)的保守序列為TAATAG［13］；圍繞nic區(qū)有3個反向重復(fù)序列［14］；dso位點位于復(fù)制蛋白編碼區(qū)的N端。pT181家族的sso位點為ssoA，其保守序列是TAGCGA/T［13］。經(jīng)過序列分析，pQJ012的復(fù)制蛋白具有保守結(jié)構(gòu)域pfam02486；其dso位點具有pT181家族的三項特征（圖3-A，圖4）。pQJ012的 sso位點吻合ssoA的特征（圖3-B）。綜上，我們推定pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于pT181家族。

圖3 質(zhì)粒pQJ012 dso（A）和pQJ012 ssoA（B）序列比對圖

圖4 質(zhì)粒pQJ012復(fù)制起始點示意圖

3 討論

魏斯氏菌屬于益生菌，能產(chǎn)生β-葡糖苷酶、胞外多糖，具有食品防腐性能等優(yōu)勢，在醫(yī)藥與食品加工方面具有極大的開發(fā)潛力和商業(yè)價值。魏斯氏菌質(zhì)粒的研究是在分子基因水平改造魏斯氏菌的基礎(chǔ)，新質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，對于微生物的遺傳學(xué)研究和構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的表達載體都具有重要意義。目前，魏斯氏菌質(zhì)粒的研究還非常有限，魏斯氏菌中已被發(fā)現(xiàn)并對其序列進行了分析研究的質(zhì)粒有pKLCA、pKLCB、pKLCC［7］和pKW2124［9］。以上被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒中，只有pKW2124的復(fù)制方式已被驗證為θ復(fù)制，同時pKW2124已被成功構(gòu)建為表達載體［9］，而且以上已被分析的魏斯氏菌中的質(zhì)粒均分離自食竇魏斯氏菌。本研究中pQJ012為融合魏斯氏菌中首次被分離報道的質(zhì)粒，pQJ012同食竇魏斯氏菌中已發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pJY33（2 365 bp）和pKLCA（1 490 bp）最相似。這兩個質(zhì)粒在GenBank中有供查詢的序列，但在PubMed尚無文獻可供直接查閱。

分析pQJ012、pJY33和pKLCA的基本元件，即復(fù)制起點和復(fù)制蛋白，發(fā)現(xiàn)他們都屬于滾環(huán)復(fù)制pT181家族。pQJ012、pJY33與pKLCA的質(zhì)粒復(fù)制雙鏈啟動位點dso都符合滾環(huán)復(fù)制pT181家族的特征，nic區(qū)都含有保守序列TAATAG，圍繞nic區(qū)都有3個反向重復(fù)序列。只是3個質(zhì)粒的反向重復(fù)序列的堿基序列雖然相同，但間距有所不同。3個質(zhì)粒的質(zhì)粒復(fù)制單鏈啟動位點sso都是ssoA。3個質(zhì)粒的推定復(fù)制蛋白（Rep）的氨基酸序列同源性很高，都有滾環(huán)復(fù)制蛋白保守結(jié)構(gòu)域pfam02486。

4 結(jié)論

本研究首次從融合魏斯氏菌中發(fā)現(xiàn)一個隱蔽質(zhì)粒pQJ012，其核苷酸序列同食竇魏斯氏菌中的pJY33和pKLCA的同源性分別為93%和92%。ORF1編碼復(fù)制蛋白（Rep），該復(fù)制蛋白氨基酸序列與質(zhì)粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%和85%。推斷pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于滾環(huán)復(fù)制pT181家族成員，質(zhì)粒pQJ012可能構(gòu)建為良好的表達載體。

［1］Nam H, Ha M, Bae O, et al. effect of Weissella confusa strain pl9001 on the adherence and growth of helicobacter pylori［J］. Appl Environ Microbiol, 2002, 68（9）：4642-4645.

［2］ Lee KW, Han NS, Kim JH. Purification and characterization of betaglucosidase from Weissella cibaria 37［J］. J Microbiol Biotechnol, 2012, 22（12）：1705-1713.

［3］Baek E, Kim H, Choi H, et al. Antifungal activity of Leuconostoc citreum and Weissella confusa in rice cakes［J］. J Microbiol, 2012, 50（5）：842-848.

［4］Tingirikari JM, Kothari D, Goyal A . Superior prebiotic and physicochemical properties of novel dextran from Weissella cibaria JAG8 for potential food applications［J］. Food Funct, 2014, 5（9）：2324-2330.

［5］Galle S, Schwab C, Arendt E, et al. Exopolysaccharide-forming Weissella strains as starter cultures for sorghum and wheat sourdoughs［J］. J Agric Food Chem, 2010, 58（9）：5834-5841.

［6］ Masuda Y, Zendo T, Sawa N, et al. Characterization and identification of weissellicin Y and weissellicin M, novel bacteriocins produced by Weissella hellenica QU 13［J］. J Appl Microbiol, 2012, 112（1）：99-108.

［7］Ku HJ, Park MS, Lee JH. Characterization of a minimal pKW2124 replicon from Weissella cibaria KLC140 and its application for the construction of the Weissella expression vector pKUCm1［J］. Front Microbiol, 2015, 6：35

［8］Jin HX, Yang XY, Cheng WY. Isolation and identification of Weissella containing endogenous plasmid from kimchi［J］. China Brewing, 2012, 1：77-79.

［9］ Kim SY, Oh CG, Lee YJ, et al. Sequence analysis of a cryptic plasmid pKW2124 from Weissella cibaria KLC140 and construction of a surface display vector［J］. J Microbiol Biotechnol, 2013, 23（4）：545-554.

［10］Pan Q, Cong YG, Hou R, et al. Purification and characterization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Lactobacillus acidophilus［J］. J Immun, 2009, 25（4）：461-464.

［11］Zhan JL, Wang YF, Hu P. Identification and characterization of Lactobacillus curvatus LAB26 with antioxidant potential from sour meat of the dong minority［J］. Meat Research, 2014, 28（6）：1-4.

［12］Funnell BE, Phillips GJ. Plasmid Biology［M］. Washington：ASM Press, 2004：60-61.

［13］del Solar G, Giraldo R, Ruiz-Echevarria MJ, et al. Replication and control of circular bacterial plasmids［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 1998, 62（2）：434-464.

［14］Balson DF, Shaw WV. Nucleotide sequence of the rep gene of staphylococcal plasmid pcw7［J］. Plasmid, 1990, 24（1）：74-80.

（責(zé)任編輯 李楠）

Complete DNA Sequence Analysis of a Cryptic Plasmid Isolated from Weissella confusa

WANG Hai-juan1DAI Yu-ke2SU Sen-sen1WANG Ying3PAN Qu1
（1. Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. School of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；3. Department of Kidney Disease，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610500）

A cryptic plasmid isolated from Weissella confusa QJ012，designated as pQJ012，was sequenced and characterized，and it was a 1489 bp circular molecule with a 42.8% G+C content. The result of BLAST showed that nucleotide sequence of pQJ012 was in homology with pJY33（93%）and pKLCA（92%）. ORF1 encoded a 282 amino acid residue Rep protein that was 91% identical to pJY33 and 85% identical to pKLCA in homology. Sequence analysis indicated that plasmid pQJ012 belonged to pT181 family of rolling-circle replication（RCR）. The pQJ012 may be constructed as a promising expression vector.

Weissella confuse；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.029

2015-08-13

國家自然科學(xué)基金項目（31170007），四川省教育廳科技基金重點項目（14ZA0219），成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科建設(shè)項目（CYXK2012005）

王海娟，女，研究方向：病原生物與感染性疾病研究；E-mail：934147264@qq.com

潘渠，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原生物與感染性疾病研究，E-mail：ppqlove@126.com；王英，E-mail：renshicu123456@163.com