大腸桿菌topA－細(xì)胞中tetA－cfaABCE的高效轉(zhuǎn)錄促進(jìn)DNA凝集*

趙舒怡，張臻峰，黃熙泰

(1.國(guó)家電網(wǎng)技術(shù)學(xué)院泰山校區(qū)，山東泰安271000;2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物前期開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101;3.南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)院，天津300071)

DNA是細(xì)胞內(nèi)最主要的遺傳物質(zhì)，其三維結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄等生理活動(dòng)有非常大的影響。因此，研究DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式及其包裝方式具有非常重要的意義。DNA超螺旋對(duì)于細(xì)胞活性來(lái)說(shuō)是必需的，因此在細(xì)胞內(nèi)是受到嚴(yán)密調(diào)控的［1］。胞內(nèi)超螺旋程度受特定酶 (DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和旋轉(zhuǎn)酶)的控制，它們可以在DNA分子上引入或者去除超螺旋［2－5］。

基因的轉(zhuǎn)錄也對(duì)DNA的超螺旋狀態(tài)也有很大的影響。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體前方和后方DNA分別生成數(shù)量相當(dāng)?shù)恼菪拓?fù)超螺旋。而這些超螺旋可以通過(guò)多種途徑進(jìn)行消除，包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，DNA雙螺旋與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)使正超螺旋和負(fù)超螺旋互補(bǔ)消除等［6］。轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，在特定的拓?fù)洚悩?gòu)酶失活的情況下，如果DNA雙螺旋鏈與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)同時(shí)也被阻止或者被限制，那么就會(huì)積累相應(yīng)的超螺旋。因此，在拓?fù)洚悩?gòu)酶I缺失的菌株中，tetA的共轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)使其產(chǎn)物的氨基端的膜插入?yún)^(qū)結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜上，或者其他某些DNA結(jié)合蛋白 (如LacⅠ)結(jié)合到DNA雙鏈上［7］，均可阻止DNA鏈和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)，在旋轉(zhuǎn)酶 (gyrase)的作用下，引入負(fù)超螺旋，最終導(dǎo)致高度負(fù)超螺旋的產(chǎn)生［8－9］。通過(guò)對(duì) pBR322質(zhì)粒 DNA 詳細(xì)的研究，Liu和Wang［10］認(rèn)為這種負(fù)超螺旋增加是由于DNA模板在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的分子操作造成的，進(jìn)而提出了“孿生超螺旋結(jié)構(gòu)域”模型。而且孿生結(jié)構(gòu)域?qū)е碌母叨蓉?fù)超螺旋的形成依賴(lài)于膜結(jié)合蛋白如tetA蛋白，同時(shí)也依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的數(shù)量以及轉(zhuǎn)錄的相對(duì)方向［8，10］。另外，Drolet和 Liu等［11］又提出了R－loop模型，即在轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中形成的新生RNA鏈在轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后方與其模板鏈形成RNA－DNA雜交雙螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致了后續(xù)的超螺旋的產(chǎn)生，而高濃度的RNase H(特異性的降解RNA－DNA雜交鏈中的RNA)可以消除轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中產(chǎn)生的負(fù)超螺旋［12－13］。在該假說(shuō)中，DNA負(fù)超螺旋的形成依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄的延伸，并且DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在穩(wěn)定該種結(jié)構(gòu)方面起著重要的作用。R－loop可以穩(wěn)定負(fù)超螺旋，同時(shí)高度的負(fù)超螺旋又促進(jìn)R－loop的形成。

近十幾年來(lái)，多個(gè)課題組利用體外［7，14］或體內(nèi)［15－18］的轉(zhuǎn)錄體系證明，在體系中存在旋轉(zhuǎn)酶(Gyrase)而缺失拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)時(shí)高效的轉(zhuǎn)錄可以促進(jìn)質(zhì)粒DNA負(fù)超螺旋的積累并形成高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu) (Hypernegatively supercoiled DNA)。然而，需要指出的是這些研究中使用的均為單一的、相對(duì)較短的轉(zhuǎn)錄單元。而在細(xì)菌染色體上存在很多大的基因或基因簇，它們的轉(zhuǎn)錄單位通常都很大，這種長(zhǎng)距離的轉(zhuǎn)錄可能會(huì)對(duì)DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更大的影響。為了研究這種影響，我們使用pJGX15A作為報(bào)告質(zhì)粒。該質(zhì)粒的構(gòu)建是直接將含有結(jié)構(gòu)基因簇cfaABCE的DNA片段直接插入到tetA基因的下游［19］。由于插入片段上不帶有啟動(dòng)子，該基因簇與tetA基因共轉(zhuǎn)錄并形成一個(gè)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄單位。此前的研究已證明在兩種菌株中CFA/I均可以很好的表達(dá)并組裝形成菌毛［19］。本課題的研究結(jié)果表明，在大腸桿菌topA－細(xì)胞中，tetA－cfaABCE的高效轉(zhuǎn)錄可以促使pJGX15A形成一種部分高度凝集的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在氯喹－瓊脂糖凝膠電泳具有較高的遷移率并表現(xiàn)為“彌散”狀態(tài)。原子力顯微鏡的觀察結(jié)構(gòu)表明這種質(zhì)粒DNA分子中含有不同程度的凝集結(jié)構(gòu)且其結(jié)構(gòu)參數(shù)明顯有別于超螺旋質(zhì)粒DNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 溶菌酶、SDS、PEG6000、溴化乙錠(EB)、氯喹等購(gòu)自Sigma公司。胰蛋白胨、酵母提取物以及瓊脂糖購(gòu)自O(shè)xoid公司。Tris、EDTA、NaOH、NaCl、MgCl2等常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自上海生工，PCR引物由上海生工合成。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌 HB101(topA+，gyrB+)與DM800(topA－，gyrB225)均由紐約公共衛(wèi)生研究所Dr.Drlica提供，質(zhì)粒pJGX15A(圖1)則由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院徐建國(guó)教授提供［19］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒提取 挑取大腸桿菌單菌落至5 mL LB試管中，37℃，200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后將菌液接種到200 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)菌液在600 nm處的光吸收值。本研究中所有培養(yǎng)基中均添加了100 μg/mL氨芐青霉素;并根據(jù)需要分別添加0、6、12 μg/mL的四環(huán)素。當(dāng)培養(yǎng)至所需的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期后，離心 (6000 r/min，5 min)收集菌體，并提取質(zhì)粒DNA。為避免菌體裂解過(guò)程中堿性試劑對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的損傷，采用溫和的清亮裂解方法提取質(zhì)粒 DNA［20］。

圖1 質(zhì)粒pJGX15A的限制圖Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pJGX15A

1.2.2 氯喹－瓊脂糖凝膠電泳 鑒于pJGX15A質(zhì)粒較大，因此采用w=0.6%的瓊脂糖凝膠電泳分析其DNA超螺旋狀態(tài)。制備凝膠前，1×TAE緩沖液中加人適量的氯喹母液 (10 mg/mL)使其達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的濃度，再加人瓊脂糖，加熱制膠。電泳緩沖液中氯喹濃度應(yīng)與瓊脂糖凝膠中一致。電泳電壓為75 V，時(shí)間為 12 h。電泳結(jié)束后，在 10 mmol/L MgCl2中脫色30 min，在0.5 μg/mL EB 溶液中染色1 h，再脫色30 min后，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照。在所有實(shí)驗(yàn)中，上樣孔中均無(wú)殘留DNA。

1.2.3 原子力顯微鏡成像 本實(shí)驗(yàn)利用二價(jià)離子將DNA橋聯(lián)吸附在帶負(fù)電的云母表面。將DNA樣品稀釋到1 μg/mL，向其中加入MgCl2至終濃度為1 mmol/L。取15 μL樣品滴加到新剝離的云母片上，室溫吸附5 min。100 μL去離子水潤(rùn)洗3遍，去除未吸附的DNA，然后用氮?dú)獯蹈? min。使用Nanoscope Ⅲ a Multimode－AFM instrument(Digital Instruments)在室溫下利用輕敲模式 (Tapping mode)下進(jìn)行掃描。探針使用共振頻率為106 kHz的 Super－sharp silicon tips(Silicon－MDT Ltd.)，掃描速度為1～2 Hz。開(kāi)始掃描后調(diào)整設(shè)定的參數(shù)值以確保將干擾降至最低并保持圖像清晰。

DNA分子的長(zhǎng)度利用軟件 ImageJ Ver1.33u(Wayne Rasband，National Institute of Health，USA)進(jìn)行測(cè)量;高度與寬度則使用原子力顯微鏡自帶的軟件進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 pJGX15 A在兩種宿主中的超螺旋水平

在添加了100 μg/mL氨芐青霉素和12 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，將含有pJGX15A的大腸桿菌HB101與DM800菌株分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)前期(A600約為0.4)和中期 (A600約為0.8)，提取質(zhì)粒DNA，并對(duì)其進(jìn)行氯喹－瓊脂糖凝膠電泳分析其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖2中A、B、C分別表示電泳體系中氯喹濃度逐漸增加時(shí)質(zhì)粒pJGX15A的電泳情況。隨著氯喹濃度的增加，質(zhì)粒DNA的負(fù)超螺旋水平由于氯喹嵌入的逐漸增加而逐漸降低，產(chǎn)生從負(fù)超螺旋—松弛—正超螺旋的轉(zhuǎn)變。

圖2 質(zhì)粒pJGX15A在HB101與DM800細(xì)胞中的超螺旋水平Fig.2 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A DNA in the presence of 5 μg/mL(A)，20 μg/mL(B)or 35 μg/mL(C)chloroquine The plasmid DNA samples were isolated from cells cultured in LB mediums containing 12 μg/mL tetracycline to the early－or mid－exponential phase.Lane 1:pJGX15A from HB101 cells in the early－exponential phase;lane 2:pJGX15A from HB101 cells in the mid－exponential phase;lane 3:pJGX15A from DM800 cells in the early－exponential phase;lane 4:pJGX15A from DM800 cells in the mid－exponential phase.OC/R:open circular or relaxed plasmid DNA;Sc:supercoiled plasmid DNA

結(jié)果顯示，宿主DM800中的pJGX15A拓?fù)洚悩?gòu)體分布范圍較廣，而宿主HB101中的pJGX15A的拓?fù)洚悩?gòu)體則比較集中。這是由于DM800存在topA缺失以及gyrB225的補(bǔ)償突變，使得其對(duì)胞內(nèi)DNA超螺旋水平的控制能力較差所造成的。圖2A中結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度氯喹 (5 μg/mL)中HB101和 DM800中的pJGX15A均為負(fù)超螺旋狀態(tài)，且DM800中的pJGX15A泳動(dòng)速度較快。圖3B中結(jié)果顯示，提高氯喹質(zhì)量濃度至20 μg/mL時(shí)，HB101中pJGX15A大部分拓?fù)洚悩?gòu)體由于氯喹的嵌入使其DNA結(jié)構(gòu)接近于松弛環(huán)形DNA;而DM800中pJGX15A則仍有部分拓?fù)洚悩?gòu)體保持較高的負(fù)超螺旋水平，因而泳動(dòng)速度較快。圖3C中結(jié)果顯示，提高氯喹質(zhì)量濃度至35 μg/mL時(shí)，兩種宿主中pJGX15A大拓?fù)洚悩?gòu)體由于氯喹的嵌入均變?yōu)檎菪?，而DM800中pJGX15A部分拓?fù)洚悩?gòu)體則形成高程度的正超螺旋，泳動(dòng)速度較快。但需要注意的是，每個(gè)DNA樣品中各拓?fù)洚悩?gòu)體DNA的含量呈正態(tài)分布，因此比較種宿主質(zhì)粒DNA拓?fù)洚悩?gòu)體主體的超螺旋狀態(tài)可以發(fā)現(xiàn)pJGX15A在二者中的平均超螺旋狀態(tài)基本一致。綜合以上結(jié)果，pJGX15A在宿主DM800中既含有高度負(fù)超螺旋的結(jié)構(gòu)同時(shí)也含有低負(fù)超螺旋的結(jié)構(gòu)，但其平均超螺旋水平與HB101中的質(zhì)粒DNA相當(dāng)。

2.2 DM800 菌株中pJGX15 A的特殊結(jié)構(gòu)形式

早先的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)攜帶四環(huán)素抗性基因tetA的質(zhì)粒pBR322在大腸桿菌topA－菌株DM800中具有高度的負(fù)超螺旋水平［8］，這一點(diǎn)與我們上述的結(jié)果并不完全吻合。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加高濃度四環(huán)素后攜帶pJGX15A質(zhì)粒的兩種宿主菌均生長(zhǎng)變緩，而攜帶pBR322質(zhì)粒的宿主菌的生長(zhǎng)則沒(méi)有明顯變化 (數(shù)據(jù)未給出)，推測(cè)這一點(diǎn)可能是導(dǎo)致兩種質(zhì)粒DNA在DM800中的超螺旋水平有區(qū)別的原因，因此我們嘗試降低培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度并重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。圖3中的結(jié)果顯示，當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度降低到 6 μg/mL時(shí)，pJGX15A在DM800菌株中的超螺旋水平明顯高于HB101菌株;而當(dāng)培養(yǎng)基中不添加四環(huán)素時(shí)，pJGX15A在DM800菌株中的超螺旋水平不僅明顯高于HB101菌株，而且對(duì)數(shù)前期DM800細(xì)胞中提取的pJGX15A在電泳中表現(xiàn)出典型的“負(fù)超螺旋—高度負(fù)超螺旋”模式 (圖3:3泳道)。仔細(xì)分析圖3中pJGX15A的拓?fù)洚悩?gòu)體在電泳中的分布模式可以發(fā)現(xiàn)，DM800細(xì)胞中的pJGX15A在電泳中不能被分離為清晰的拓?fù)錀l帶，而是表現(xiàn)為泳動(dòng)速度較快的“彌散”條帶。這一點(diǎn)與高質(zhì)量濃度四環(huán)素培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果形成了鮮明的對(duì)比。這些結(jié)果表明，在四環(huán)素質(zhì)量濃度較低時(shí)對(duì)數(shù)期DM800細(xì)胞中的pJGX15A形成了特殊的結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)有別于通常意義的超螺旋結(jié)構(gòu)，可能是一種新的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式。

圖3 DM800細(xì)胞中質(zhì)粒pJGX15A形成特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A DNA in the presence of 5 μg/mL chloroquineThe plasmid DNA samples were isolated from cells in the early－(lanes 1，3，5 and 7)or mid－exponential phase(lanes 2，4，6 and 8).OC/R，open circular or relaxed plasmid DNA;Sc，supercoiled plasmid DNA;(－－)，hypernegatively supercoiled plasmid DNA

2.3 四環(huán)素質(zhì)量濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)pJGX15A特殊結(jié)構(gòu)的影響

進(jìn)一步對(duì)比圖3中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)前期與中期的HB101細(xì)胞中的pJGX15A的結(jié)構(gòu)基本一致，然而DM800細(xì)胞中提取的pJGX15A的結(jié)構(gòu)在兩個(gè)時(shí)期則有明顯的不同——對(duì)數(shù)前期的pJGX15A超螺旋水平更高，也更易于形成“彌散”條帶。這一點(diǎn)也促使我們進(jìn)一步探討細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)pJGX15A拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響。在不同四環(huán)素質(zhì)量濃度下培養(yǎng)HB101與DM800，分別收集對(duì)數(shù)期以及靜止期的細(xì)胞并提取質(zhì)粒DNA，然后利用氯喹－瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (如圖4所示)。結(jié)果顯示，四環(huán)素質(zhì)量濃度與生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)pJGX15A在DM800中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均具有顯著的影響。

當(dāng)培養(yǎng)基中不添加四環(huán)素時(shí)，從DM800對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞和靜止期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品之間有很大的區(qū)別 (圖4:泳道3、4)。首先，從DM800對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA的超螺旋程度很高，其中大部分都表現(xiàn)為類(lèi)似高度負(fù)超螺旋的狀態(tài)。其次，從DM800對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品中的拓?fù)洚悩?gòu)體不能被電泳分離，但靜止期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品那樣。在topA突變體中tetA基因的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)被證實(shí)可以形成高度負(fù)超螺旋［9］，然而，這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的形成說(shuō)明串聯(lián)基因tetA－cfaABCE長(zhǎng)距離的轉(zhuǎn)錄能夠促使DNA產(chǎn)生更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的形成同樣受到培養(yǎng)基中四環(huán)素質(zhì)量濃度的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)提高培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度時(shí)，質(zhì)粒DNA的超螺旋程度隨之下降;并且當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度達(dá)到12 μg/mL時(shí)，不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不能形成。由于四環(huán)素是一種轉(zhuǎn)錄抑制劑，因此可能是由于轉(zhuǎn)錄速度下降導(dǎo)致不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不能形成。

圖4 四環(huán)素質(zhì)量濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)pJGX15A結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A in the presence of 5 μg/mL chloroquineThe plasmid DNA samples were then isolated from cells in the exponential(E)or stationary(S)phase.OC/R，open circular or relaxed plasmid DNA;Sc，supercoiled plasmid DNA;(－－)，hypernegatively supercoiled plasmid DNA.

2.4 AFM觀察pJGX15 A的特殊結(jié)構(gòu)

為深入了解pJGX15A在DM800細(xì)胞中形成的特殊結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特征及其與超螺旋DNA的區(qū)別，我們選擇在不添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期及靜止期的DM800細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA樣品，利用原子力顯微鏡技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察與分析。其中使用的Mg2+濃度 (1 mmol/L)在細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度的范圍內(nèi)，正如之前討論過(guò)的一樣，在這種Mg2+濃度下AFM可以給出可信的圖片［21］。如圖5所示，兩種樣品中幾乎所有的DNA分子均為閉合環(huán)狀分子，表明樣品制備并未破壞DNA的結(jié)構(gòu)。圖5A中顯示了DM800靜止期細(xì)胞中提取的pJGX15A，DNA的結(jié)構(gòu)非常均一，不含有復(fù)雜結(jié)構(gòu);大部分DNA分子呈現(xiàn)松弛或者1～2次互纏式結(jié)構(gòu)，這可能是由于其超螺旋水平較低的緣故。而與此相反，DM800對(duì)數(shù)期細(xì)胞中提取的pJGX15A則表現(xiàn)出非常高的結(jié)構(gòu)多樣性 (圖5B)。幾乎所有DNA分子均表現(xiàn)出不同程度的凝集，大部分分子含有多個(gè)扭結(jié) (圖5B中箭頭)，甚至有些DNA分子完全壓縮成了一團(tuán) (圖5B中白色三角)。這種形態(tài)的多樣性可能正是導(dǎo)致這些拓?fù)洚悩?gòu)體不能被氯喹瓊脂糖凝膠電泳分離形成梯狀條帶的原因。

圖5 AFM觀察超螺旋與凝集pJGX15A的結(jié)構(gòu)Fig.5 AFM images of supercoild(A)and condensed(B)pJGX15A from DM800 cells Grayscale represents 5 nm

圖 6B－E中展示了幾個(gè)凝集程度不同的pJGX15A分子，與圖6A中的超螺旋DNA分子的結(jié)構(gòu)相比較可以發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)生凝集的DNA分子尺寸小于超螺旋DNA分子。圖6A中超螺旋DNA分子的長(zhǎng)度為2756 nm，與其理論計(jì)算長(zhǎng)度2779 nm非常接近。而圖6B－D中所示DNA分子的展開(kāi)部分的鏈的長(zhǎng)度則分別為2710、2640以及1394 nm;圖6E中的結(jié)構(gòu)不含有展開(kāi)的DNA鏈且被完全壓縮成了一團(tuán)。這些數(shù)據(jù)表明，質(zhì)粒DNA分子中的部分DNA雙鏈確實(shí)在不同程度上被壓縮成凝集結(jié)構(gòu)，而且凝集程度越高，DNA分子的表觀長(zhǎng)度則越小。進(jìn)一步對(duì)這些分子的高度進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果顯示所有DNA分子中展開(kāi)的雙鏈DNA的高度基本一致，約為1.1～1.3 nm，然而凝集部分的高度則有很大區(qū)別。圖6E中的結(jié)構(gòu)的平均高度約為3.8 nm，與圖6D中DNA分子的凝集部分的高度(約為3.9 nm)相似，但是卻大于圖6C中DNA分子的凝集部分的高度 (約為2.1 nm)同時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于圖6A中DNA鏈的高度 (約為1.2 nm)。

圖6 幾種典型的pJGX15A分子的結(jié)構(gòu)Fig.6 AFM images of representative supercoiled(A)or condensed(B－E)structures of plasmid pJGX15A from DM800 Grayscale represents 5 nm

3 討論

轉(zhuǎn)錄對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響已經(jīng)研究了很長(zhǎng)時(shí)間了。Liu 和 Wang［8，10］提出了轉(zhuǎn)錄的孿生結(jié)構(gòu)域模型，而Drolet等［11－12］則提出DNA模板的高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形成是與R－loop(s)的形成緊密聯(lián)系在一起的。這些假說(shuō)解釋了轉(zhuǎn)錄是如何刺激DNA模版的高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的積累的，同時(shí)闡述了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I以及旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用。然而，tetA基因的轉(zhuǎn)錄單位只有1190 bp，不足以促使DNA形成更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用大質(zhì)粒pJGX15A來(lái)研究長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)錄對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響。該質(zhì)粒包含一個(gè)tetA－cfaABCE共轉(zhuǎn)錄單位，這個(gè)共轉(zhuǎn)錄單位由tetA啟動(dòng)，并且新生的tetA多肽同樣可以錨定在細(xì)胞膜上，這一點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄所引起的結(jié)構(gòu)變化是非常重要的［22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 pJGX15A在大腸桿菌topA－菌株DM800中形成一種特殊的凝集結(jié)構(gòu)。這種凝集結(jié)構(gòu)在氯喹－瓊脂糖凝膠電泳中有著很高的遷移率而且表現(xiàn)為類(lèi)似“彌散”的條帶，這一點(diǎn)與正常超螺旋結(jié)構(gòu)有很大的區(qū)別。AFM照片也顯示這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不包含超螺旋。相反，它們包含分枝狀的、高度凝集的結(jié)構(gòu) (圖5B中箭號(hào)所示)，部分分子甚至完全凝集成為一團(tuán) (圖5B中三角所示)。這也許是這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)有著很高的電泳遷移率并且拓?fù)洚悩?gòu)體不能被電泳分離的原因。與此前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pBR322所形成高負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)相比，pJGX15A在DM800細(xì)胞中形成的凝集結(jié)構(gòu)更加的復(fù)雜，說(shuō)明長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄單元對(duì)DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大的影響。

本實(shí)驗(yàn)中這種凝集結(jié)構(gòu)在大腸桿菌HB101細(xì)胞中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明pJGX15A凝集結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生是依賴(lài)于拓?fù)洚悩?gòu)酶I的缺陷的。同時(shí)，這種凝集結(jié)構(gòu)的形成在很大程度上受到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)基中四環(huán)素質(zhì)量濃度的影響:①該凝集結(jié)構(gòu)僅在DM800對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中形成，而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入靜止期時(shí)，pJGX15A表現(xiàn)為超螺旋結(jié)構(gòu);②pJGX15A的凝集結(jié)構(gòu)僅在低四環(huán)素質(zhì)量濃度 (小于6 μg/mL)培養(yǎng)的DM800細(xì)胞中產(chǎn)生，高四環(huán)素質(zhì)量濃度培養(yǎng)時(shí)，對(duì)數(shù)期與靜止期DM800細(xì)胞中的pJGX15A均表現(xiàn)為超螺旋結(jié)構(gòu)。由于進(jìn)入靜止期和增加培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度都會(huì)降低轉(zhuǎn)錄的效率，因此推測(cè)這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的生成依賴(lài)于高效的轉(zhuǎn)錄。

此前有實(shí)驗(yàn)室從大腸桿菌 HB101(topA+，gyrB+)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了某種可變的不規(guī)則結(jié)構(gòu)［23］，具有這種結(jié)構(gòu)的DNA同樣不能被電泳分開(kāi)成梯狀拓?fù)洚悩?gòu)體條帶。AFM的結(jié)果顯示該結(jié)構(gòu)中也含有凝集的結(jié)構(gòu)，與本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)有相似之處。但進(jìn)一步比較二者的結(jié)構(gòu)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)這種不規(guī)則結(jié)構(gòu)與本研究中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)相比，其凝集程度明顯較低。這一點(diǎn)也與其超螺旋水平明顯低于本研究中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)這一結(jié)果相符合。這些結(jié)果說(shuō)明DNA凝集結(jié)構(gòu)可以在大腸桿菌野生株中產(chǎn)生，而拓?fù)洚悩?gòu)酶I的缺失可能促進(jìn)了DNA凝集的累積。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶I缺失時(shí)，長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄單元的高效轉(zhuǎn)錄可能促使質(zhì)粒DNA形成高度凝集的結(jié)構(gòu) (highly condensed structure)而非高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu) (hypernegative supercoiled structure)。鑒于細(xì)菌染色體上存在很多大的基因或基因簇，這種結(jié)構(gòu)的形成有可能參與細(xì)菌染色體DNA的組織包裝。

［1］TSE－DINH Y C，QI H，MENZEL R.DNA supercoiling and bacterial adaptation:thermotolerance and thermoresistance［J］.Trends in Microbiology，1997，5:323－326.

［2］CHRISTIANSEN K，WESTERJAARD O.Characterization of intra－and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I［J］.Journal of Biological Chemistry，1994，269:721－729.

［3］FROELICH－AMMON S J，GALE K C，OSHEROFF N，et al.Site－specific cleavage of a DNA hairpin by topoisomerase II［J］.Journal of Biological Chemistry，1994，269:7719－7727.

［4］GLLERT M，MIZUUCHI K，O’DEA M H，et al.DNA gyrase:an enzyme that introduces superhelical turns into DNA［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，1976，73:3872－3876.

［5］PRUSS G J.DNA topoisomerase I mutants:increased heterogeneity in linking number and other replicon－dependent changes in DNA supercoiling［J］.Journal of Molecular Biology，1985，185:51－63.

［6］THOMAS B，NIELSEN P E.In vitro transcription of a torsionally constrained template［J］.Nucleic Acids Research，2002，30:803－809.

［7］LENG Fenfei，MCMACKEN R.Potent stimulation of transcription－coupled DNA supercoiling by sequence－specific DNA－bingding proteins［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，2002，99:9139－9144.

［8］LODGE J K，KAZIC T，BERG D E.Formation of supercoiling domains in plasmid pBR322［J］.The Journal of Bacteriology，1989，171:2181－2187.

［9］PHOENIX P，RAYMOND M A，MASSE E，et al.Roles of DNA Topoisomerases in the Regulation of R－loop formation in vitro［J］.Journal of Biological Chemistry，1997，272:1473－1479.

［10］LIU L F，WANG J C.Supercoiling of the DNA template during transcription［J］.Proceedings of the National A－cademy of Sciences USA，1987，84:7024－7027.

［11］MASSé E，DROLET M.R－loop－dependent hypernegative supercoiling in Escherichia coli topA mutants preferentially occurs at low temperatures and correlates with growth inhibition［J］.Journal of Molecular Biology，1999，294:321－332.

［12］USONGO V，NOLENT F，SANSCARTIER P，et al.Depletion of RNase HI activity in Escherichia coli lacking DNA topoisomerase I leads to defects in DNA supercoiling and segregation［J］.Molecular Microbiology，2008，69:968－981.

［13］BAAKLINI I，USONGO V，NOLENT F，et al.Hypernegative supercoiling inhibits growth by causing RNA degradation［J］.The Journal of Bacteriology，2008，190:7346－56.

［14］LENG Fenfei，AMADO L，MCMACKEN R.Coupling DNA supercoiling to transcription in defined protein systems［J］.Journal of Biological Chemistry，2004，279:47564－47571.

［15］BROCCOLI S，RALLU F，SANSCARTIER P，et al.Effects of RNA polymerase modifications on transcription－induced negative supercoiling and associated R－loop formation［J］.Molecular Microbiology，2004，52:1769－1779.

［16］SAMUL R，LENG Fenfei.Transcription－coupled hypernegative supercoiling of plasmid DNA by T7 RNA polymerase in Escherichia coli topoisomerase I－deficient strains［J］.Journal of Molecular Biology，2007，374(4):925－935.

［17］ZHI Xiaoduo，LENG Fenfei.Dependence of transcription－coupled DNA supercoiling on promoter strength in Escherichia coli topoisomerase I deficient strains［J］.Gene，2013，514:82－90.

［18］DING Yue，MANZO C，F(xiàn)ULCRAND G，et al.DNA supercoiling:a regulatory signal for the λ repressor［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences U S A，2014，111:15402－15407.

［19］張臻峰，于春風(fēng)，萬(wàn)慶，等.產(chǎn)毒性大腸桿菌CFA/Ⅰ基因表達(dá)與DNA超螺旋狀態(tài)的關(guān)系［J］.南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，37:7－12.

［20］HUANG Xitai，CHEN Xin.Supercondensed structure of plasmid pBR322 DNA in an Escherichia coli DNA topoisomerase II mutant［J］，Journal of Molecular Biology，1990，216:195－199.

［21］ZHANG Pingcheng，BAI Chunli，CHENG Yingjun，et al，Study on the topological structure of pBR322 DNA by AFM［J］.Science in China(Series C:Life Sciences)，1996，39:1－7.

［22］LYNCH A S，WANG J C.Anchoring of DNA to the baterial cytoplasma memberane through cotranscriptional synthesis of polypeptide encoding membrane protein or proteins for export－a mechanism of plasmid hypernegative supercoiling in mutants deficient in DNA topoisomerase I［J］.The Journal of Bacteriology，1993，175:1645－1655.

［23］ADAM?íK J，VíGLASKY V，VALLE F，et al，Effect of bacteria growth temperature on the distribution of supercoiled DNA and its thermal stability［J］.Electrophoresis，2002，23:3300－3309.