重組谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的工藝條件優(yōu)化

黃燕 宿玲恰 吳敬

（江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室 生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

重組谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的工藝條件優(yōu)化

黃燕 宿玲恰 吳敬

（江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室 生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

谷氨酸脫羧酶，一種磷酸吡哆醛（PLP）依賴性酶，能專一、不可逆地催化L-谷氨酸脫羧得到γ-氨基丁酸（GABA）。構(gòu)建了產(chǎn)Lactobacillus brevis WJH3 谷氨酸脫羧酶重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）/pET-24a-gad，以此作為菌種進行搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵過程中一次性添加0.05 mmol/L PLP培養(yǎng)24 h，破壁上清酶活達81.7 U/mL，是不添加PLP對照酶活的1.8倍。對酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉生成GABA反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化體系不添加PLP的情況下，底物谷氨酸鈉濃度為250 g/L，反應(yīng)初始pH5.0，溫度37℃，加酶量60 U/g 底物，轉(zhuǎn)速200 r/min，在此條件下反應(yīng)18 h，GABA轉(zhuǎn)化率達到100%，為γ-氨基丁酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

谷氨酸脫羧酶；酶轉(zhuǎn)化；磷酸吡哆醛；谷氨酸鈉；γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），一種非蛋白質(zhì)氨基酸，以自由態(tài)形式廣泛存在于自然界中，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)［1］。GABA具有多種生理功能，如鎮(zhèn)靜神經(jīng)［2］、降血氨［3］、健肝利腎［4］及治療癲癇［5］等。此外，研究表明GABA可以作為工業(yè)上合成N-甲基吡咯烷酮［6］、生物塑料及尼龍［7，8］等含氮化學制品的環(huán)保型前體物質(zhì)。因此GABA正被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保健、化工及農(nóng)業(yè)等行業(yè)。

GABA天然存在量很低，很難從天然組織中大量分離，阻礙了它的工業(yè)生產(chǎn)。目前，GABA的制備方法有化學合成法、植物富集法和微生物合成法。相比而言，化學合成GABA安全性差、環(huán)境污染嚴重，植物富集GABA含量較低，而微生物合成生產(chǎn)法因具有條件溫和、成本低，能耗低，產(chǎn)量高等優(yōu)點而成為主要的生產(chǎn)方法。微生物合成法的原理是采用谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD；EC4.1.1.15）專一、不可逆地催化L-谷氨酸裂解為GABA和CO2。

Li等［9］采用Lactobacillus brevis NCL912野生菌發(fā)酵48 h時，發(fā)酵液中GABA濃度達到102.78± 5.30 g/L，無谷氨酸鈉殘留。根據(jù)Plokhov等［10］報道，在大腸桿菌基因來源的Escher-ichia coli BL21（DE3）重組菌發(fā)酵過程中添加0.02 mmol/L的PLP，能使GAD產(chǎn)量提高2倍，同時又有文獻報道短乳桿菌GAD與輔酶PLP緊密結(jié)合，經(jīng)破壁、蛋白純化等步驟均不會丟失［11，12］，因此我們猜想如果在發(fā)酵過程中添加一定量的PLP，所得到的短乳桿菌的粗酶液應(yīng)該可以用于在不添加輔酶的條件下生產(chǎn)GABA，以達到節(jié)約成本的目的。為探索出一種重組谷氨酸脫羧酶無需輔酶PLP轉(zhuǎn)化合成GABA的生產(chǎn)工藝，本研究從實驗室現(xiàn)有菌株短乳桿菌（Lactobacillus brevis WJH3）［13］PCR獲得GAD基因并連接到表達載體pET-24a（+），進行重組表達，并在此基礎(chǔ)上，對酶轉(zhuǎn)化過程中不添加輔酶PLP的酶轉(zhuǎn)化工藝進行優(yōu)化，以期獲得高效生產(chǎn)GABA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 短乳桿菌（Lactobacillus brevis WJH3）：實驗室篩選獲得，保藏編號為CCTCC M2014150；E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）：本實驗室保藏；克隆載體pMD18-T Simple vector：購自TaKaRa公司；表達載體pET-24a（+）：購自Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS，LB，TB，SOB，SOC 培養(yǎng)基：細菌常規(guī)通用培養(yǎng)基；重組大腸桿菌培養(yǎng)基中添加終濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

1.1.3 主要試劑和儀器 基因組試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準、核酸分子量標準及瓊脂糖購自TaKaRa公司；氨芐那霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自于生工生物工程（上海）有限公司；γ-氨基丁酸、鄰苯二甲醛購自Sigma 公司；蛋白胨、酵母粉購自英國Oxoid公司；其他所用試劑購自于中國國藥集團。

主要儀器：PCR 儀、UVP 凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型核酸電泳儀購自北京六一儀器廠；高效液相色譜儀購自Agilent公司；細胞破碎儀購自北京科實興業(yè)科技有限公司；紫外可見光分光光度計購自日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構(gòu)建 提取Lactobacillus brevis WJH3的基因組DNA，并以此為模板PCR擴增目的基因gad。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94℃ 45 s，60℃45 s，72℃ 130 s，循環(huán) 30次，72℃ 10 min。PCR引物如下：P1（5'-3'）：CGCCATATGGCTATGTTGTATGGAAA（正向引物）；P2（5'-3'）：CCC0AAGCTTAGTGCGTGAACCCGTATTT（反向引物）。P1、P2 分別含NdeⅠ和Hind Ⅲ的限制性酶切位點。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后連接至克隆載體pMD18-T，連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細胞，在含100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆在含100 μg/mL Amp液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10 h，抽提質(zhì)粒得到pMD18-T-gad，并采用酶切電泳和測序鑒定。序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

將pMD18-T-gad經(jīng)NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后回收目的片段，再與同樣處理酶切處理的表達達載體pET-24a（+）用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細胞中，在含30 μg/mL 卡那霉素（Kan）平板培養(yǎng)過夜，挑取單克隆在含30 μg/mL Kan液體LB中37℃培養(yǎng)8-10 h，提取得到重組質(zhì)粒pET-24a（+）-gad。將重組質(zhì)粒雙酶切驗證，驗證正確后轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)過夜，保存甘油管。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GAD 將-80℃保藏的重組菌Ecoli BL21/pET-24a（+）-gad從甘油管中接入種子培養(yǎng)基，初始pH7.0-7.2，回轉(zhuǎn)恒溫搖床37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h后，按 5%的接種量接種至TB中，37℃培養(yǎng)2 h后加入一定量濃度的 IPTG和0.05 mmol/L PLP，降溫至25℃進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)24 h后，每隔3 h取樣、離心收集菌體。當OD600低于5.0時直接用50 mmol/L pH 5.5 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液懸浮菌體，當菌體生長至OD600大于5.0時，采用緩沖液稀釋至5.0，超聲破碎后離心，破壁上清即為GAD粗酶液，單位體積酶活根據(jù)相應(yīng)體積發(fā)酵液菌體稀釋倍數(shù)折算得出。

1.2.3 GAD活性測定 取40 μL GAD粗酶液加入360 μL底物（底物體系：采用50 mmol/L pH4.8 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液溶解0.15 mmol/L PLP和0.1 mol/L 谷氨酸），于37℃恒溫水浴反應(yīng)4 min，然后用600 μL 0.2 mol/L pH10硼酸緩沖液終止反應(yīng)。采用HPLC-OPA柱前衍生法測量GABA生成量。酶活單位定義為在酶活測量體系下，在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化生成1 μmol GABA的酶量。

1.2.4 GABA的制備及含量測定 用pH5.0 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制濃度為250 g/L的谷氨酸鈉溶液，與一定量的粗酶液（上述1.2.2添加輔酶PLP發(fā)酵所得菌體經(jīng)濃縮高壓勻漿破壁所得）充分混勻后在37℃、200 r/min水浴搖床中控制反應(yīng)pH 5.0，反應(yīng)4 h后，每隔2 h補加50 g/L谷氨酸鈉固體至相應(yīng)底物濃度反應(yīng)18 h，酶轉(zhuǎn)化過程中反應(yīng)體系未添加PLP，轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液加入等體積的三氯乙酸后，靜置2 h，12 000 r/min離心10 min，取上清進行分析。產(chǎn)物采用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。

轉(zhuǎn)化率定義為：生成的GABA的摩爾數(shù)/L-谷氨酸的摩爾數(shù)*100%。

1.2.5 HPLC-OPA柱前衍生法測量GABA 利用HPLC-OPA柱前衍生法進行氨基酸分析的色譜 條 件 是：Agilent 1200 HPLC色 譜 儀（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），Agilent自 動進樣器，XDB-C18（4.6 mm × 150 mm）色譜柱，Agilent紫外檢測器（338 nm）；流動相 A：醋酸鈉4.52 g/L，200 μL/L 三乙胺，5 mL/L四氫呋喃，醋酸調(diào)節(jié)pH7.2。流動相B：醋酸鈉 22.6 g/L /乙腈/甲醇= 1∶2∶2（體積比）。二元梯度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫40℃［14］。

2 結(jié)果

2.1 GAD重組菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pET-24a（+）-gad 的構(gòu)建 以提取的Lactobacillus brevis WJH3基因組為模板，PCR擴增得到目的基因gad，其長度大小經(jīng)凝膠電泳驗證為1.4 kb。將gad 基因片段插入pMD18-T simple 質(zhì)粒中，測序后發(fā)現(xiàn)gad 基因所編碼的氨基酸序列與Lactobacillus brevis NCL912 同源性99%。純化回收目的基因后與同樣酶切、純化回收的pET-24a（+）連接，連接后轉(zhuǎn)入E.coli JM109，培養(yǎng)重組菌并抽提質(zhì)粒進行雙酶切驗證，如圖1所示，分別在5 300 bp和1 400 bp附近有明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期相符，表明重組表達載體pET-24a（+）-gad構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pET-24a（+）-gad酶切驗證

2.1.2 重組菌E.coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-gad的構(gòu)建及培養(yǎng) 將重組質(zhì)粒pET-24a（+）-gad轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)并同時添加0.05 mmol/L PLP發(fā)酵培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，超聲破碎后離心得到GAD粗酶液。結(jié)果如圖2所示，隨著時間的推移，重組GAD酶活不斷增加，誘導(dǎo)15 h胞內(nèi)酶活達到81.7 U/mL，是不添加PLP對照酶活的1.8倍。SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3，從圖3可見在54 kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與理論GAD分子量相符，表明GAD在E.coli BL21（DE3）中成功表達。

圖2 重組菌在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)酶曲線

圖3 谷氨酸脫羧酶SDS-PAGE分析

2.2 重組GAD制備GABA工藝優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)pH對GABA合成的影響 以250 g/L的谷氨酸鈉作為底物，加酶量80 U/g底物，溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，分別控制在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0轉(zhuǎn)化環(huán)境中反應(yīng)18 h。產(chǎn)物用HPLCOPA衍生法進行檢測。結(jié)果如圖4所示，當pH為5.0時，GABA轉(zhuǎn)化率為100%。與文獻報道短乳桿菌的GAD最適轉(zhuǎn)化pH范圍4.8接近［13］。當pH低于5.0時，谷氨酸鈉容易以谷氨酸形式析出形成白色乳濁液，不利于酶催化反應(yīng)；當pH大于5.0時不利于酶活性中心的賴氨酸殘基以shifft-堿與輔酶（PLP）、底物結(jié)合，從而不利于GABA的合成［15］。因此過酸或過堿對酶促反應(yīng)都不利，在pH為5.0時GABA轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.2 反應(yīng)溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響 以250 g/L的谷氨酸鈉作為底物，加酶量80 U/g底物，pH5.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，分別在30℃、37℃、40℃、50℃和60℃反應(yīng)18 h。產(chǎn)物用HPLC-OPA衍生法進行檢測。如圖5所示，反應(yīng)溫度37-40℃時，GABA轉(zhuǎn)化率達到100%，與其他大部分來源GAD的最適酶轉(zhuǎn)化溫度一致［13，16，17］。隨著溫度的升高或下降，GABA轉(zhuǎn)化率下降。60℃條件下，GABA轉(zhuǎn)化率只有12.4%，這可能是在高溫下酶與輔酶的不穩(wěn)定，從而影響GABA 的產(chǎn)率。為了與其他文獻對比，我們采用37℃為最佳轉(zhuǎn)化溫度。

圖4 反應(yīng)pH對酶轉(zhuǎn)化的影響

圖5 反應(yīng)溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響

2.2.3 加酶量對酶轉(zhuǎn)化的影響 以250 g/L的谷氨酸鈉作為底物，加入不同量的GAD，加酶量分別為每克底物20、40、60、80、100 U/g，pH 5.0，反應(yīng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min反應(yīng)18 h。產(chǎn)物用HPLCOPA衍生法進行檢測。如圖6所示，隨著加酶量的增多，GABA轉(zhuǎn)化率逐漸增大，在60 U/g時轉(zhuǎn)化率達到100%，之后加酶量增加，轉(zhuǎn)化率不變，轉(zhuǎn)化時間縮短?？紤]到經(jīng)濟性因素，選擇加酶量為60 U/g。2.2.4 底物濃度對GABA酶轉(zhuǎn)化的影響 通過溫度、pH等優(yōu)化結(jié)果顯示，當?shù)孜餄舛葹?50 g/L時轉(zhuǎn)化率已達到100%，為繼續(xù)提高反應(yīng)強度，嘗試提高初始谷氨酸鈉濃度，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，當?shù)孜餄舛却笥?50 g/L時谷氨酸鈉將以谷氨酸形式析出形成白色乳濁液，不利于反應(yīng)進行，且對酶及輔酶穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。為進一步提高反應(yīng)強度，我們嘗試分批補料添加一定量的谷氨酸鈉固體以提高底物濃度。

初始谷氨酸鈉濃度為250 g/L，加酶量60 U/g，控制pH 5.0，溫度37℃，置于200 r/min的恒溫水浴搖床中反應(yīng)4 h后，每隔2 h補加50 g/L的谷氨酸鈉固體至相應(yīng)底物濃度（400或500 g/L），反應(yīng)18 h后終止反應(yīng)，產(chǎn)物采用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。如圖7所示，谷氨酸濃度為250 g/L時，GABA轉(zhuǎn)化率達到100%。隨著谷氨酸鈉濃度的增加，GABA轉(zhuǎn)化率逐漸降低，當谷氨酸鈉濃度為400 g/L時，GABA轉(zhuǎn)化率為88.4%，GABA產(chǎn)量達到247.8 g/L。繼續(xù)增加谷氨酸濃度到500 g/L時，GABA轉(zhuǎn)化率下降為74.3%，GABA產(chǎn)量達到255.7 g/L。補料添加GABA產(chǎn)率比一次性添加的175.2 g/L有所提高，但綜合考慮產(chǎn)品中GABA的比例和產(chǎn)率，本著節(jié)省資源，降低工業(yè)成本的原則，選擇250 g/L 濃度。

圖6 加酶量對酶轉(zhuǎn)化的影響

圖7 分批補料濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響

3 討論

目前國內(nèi)外關(guān)于生產(chǎn)GABA的報道集中于從傳統(tǒng)食物中篩選產(chǎn)量較高的野生菌進行發(fā)酵生產(chǎn)GABA。Binh等［18］從泡菜中篩選得到一株Lactobacillus brevis，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，GABA終濃度達到4.2 g/L，轉(zhuǎn)化了達到99.7%。Shi等［19］從采用Lactobacillus brevis CGMCC No.3414菌株發(fā)酵結(jié)束后添加50 g/L谷氨酸，反應(yīng)4 h后轉(zhuǎn)化率達到93.15%。夏江等［20］篩選了一株Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306，其GABA 的最大產(chǎn)量已達到76.4 g/L。Li等［21］從泡茶中分離得到一株Lactobacillus brevis NCL912，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，GABA產(chǎn)量高達103.6 g/L，發(fā)酵液中無谷氨酸殘留。但是野生菌谷氨酸脫羧酶的表達量很低，無法滿足生產(chǎn)需要。另外，由于發(fā)酵液是一個復(fù)雜的多相體系，除了目的產(chǎn)物GABA，還含有蛋白質(zhì)、殘?zhí)羌盁o機鹽等雜質(zhì)，使得GABA分離純化步驟變得十分復(fù)雜，因此，利用分子生物學技術(shù)高效表達GAD并優(yōu)化酶制備工藝得到該領(lǐng)域?qū)W者、專家的關(guān)注。但是，目前報道中的短乳桿菌GAD產(chǎn)量都比較低，最高僅有12.7 U/mL［22］，且關(guān)于采用短乳桿菌GAD酶法合成工藝的報也很少。因此，本實驗在E.coli BL21（DE3）中成功表達了來源于Lactobacillus brevis WJH3的GAD，且在發(fā)酵過程中一次性添加0.05 mmol/L PLP培養(yǎng)24 h，破壁上清酶活達81.7 U/mL，是不添加PLP對照酶活的1.8倍。我們還分別考察了該重組酶制備GABA的應(yīng)用，考察了pH、溫度、加酶量、底物濃度等對酶轉(zhuǎn)化的影響，在最優(yōu)條件下能將250 g/L 的L-谷氨酸鈉完全轉(zhuǎn)化成GABA。下一步的研究重點是將該重組菌在3 L發(fā)酵罐中進行優(yōu)化，獲得更高表達量的酶液，為工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了表達GAD的重組E.coli BL21（DE3）菌株，初步實驗表明在發(fā)酵過程中添加0.05 mmol/L的輔酶PLP重組菌破壁上清液中GAD酶活可達81.7 U/mL，較空白提高1.8倍。采用該重組GAD粗酶液優(yōu)化了酶法生產(chǎn)GABA的工藝條件。結(jié)果表明，底物谷氨酸鈉濃度為250 g/L，反應(yīng)pH 5.0，溫度37℃，加酶量60 U/g 底物，轉(zhuǎn)速200 r/min，轉(zhuǎn)化時間18 h，GABA轉(zhuǎn)化率可達100%；采用GAD粗酶液不添加輔酶PLP合成GABA的方法操作簡單、節(jié)約成本、利于提取。

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（責任編輯 李楠）

Optimization of γ-aminobutyric Preparation by Recombinant Glutamate Decarboxylase

HUANG Yan SU Ling-qia WU Jing
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Glutamate decarboxylase（GAD），a pyridoxal 5'-phosphate（PLP）-dependent enzyme，irreversibly catalyzes the decarboxylation of L-glutamate to be the valuable food additive γ-aminobutyric acid（GABA）. In this study，a recombinant Escherichia coli BL21（DE3）/pET-24a-gad producing Lactobacillus brevis WJH3 GAD was constructed as strain in the flask culturing of fermentation and induction. The activity of GAD produced in the supernatant of culturing for 24 h medium supplemented one-time with 0.05 mmol/L PLP was 81.7 U/mL，and this was 1.8-fold of that without PLP supplementation. Furthermore，the condition for GABA preparation by enzymatic conversion was optimized；under the condition of 250 g/L monosodium glutamate（MSG），pH5.0，37℃，60 U GAD per gram substrate incubated for 18 hours，and rotation rate 200 r/min，100% of the MSG was transformed into GABA. These results establish the utility of PLP supplementation and lay the foundation for large-scale enzymatic production of GABA.

glutamate decarboxylase；enzymatic conversion；pyridoxal 5'-phosphate；monosodium glutamate；γ-aminobutyric

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.029

2015-09-17

國家杰出青年基金項目（31425020），111計劃（111-2-06）

黃燕，女，碩士研究生，研究方向：重組酶的制備和應(yīng)用；E-mail：18206180508@163.com

吳敬，女，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品與發(fā)酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn