DHP-半乳糖復(fù)合體制備多孔生物載體及其在人體肝細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

吳晨曦謝益民，2葉哲孜王鵬，2樂喜

（1. 湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙工程學(xué)院，武漢 430068；2. 湖北工業(yè)大學(xué)綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

DHP-半乳糖復(fù)合體制備多孔生物載體及其在人體肝細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

吳晨曦1謝益民1，2葉哲孜1王鵬1，2樂喜1

（1. 湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙工程學(xué)院，武漢 430068；2. 湖北工業(yè)大學(xué)綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

為了使木素脫氫聚合物（DHP）與人體肝細(xì)胞之間有更好的生物相容性，使用DHP和D-半乳糖進(jìn)行接枝共聚，通過水凝膠的方法制備醫(yī)用多孔生物載體。利用紅外光譜、核磁共振波譜、比表面積測定儀及掃描電子顯微鏡對多孔生物載體的主要成分含量、物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)以及表面形態(tài)進(jìn)行分析，并對體外培養(yǎng)中的肝細(xì)胞形態(tài)與代謝活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，以DHP與D-半乳糖的接枝共聚產(chǎn)物作為原料可以制備性能良好的多孔生物載體，比表面積為6.013 m2/g。使用此多孔生物載體對人體肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，人體肝細(xì)胞能夠健康地附著在DHP多孔生物載體上生長增殖。根據(jù)含半乳糖的生物載體白蛋白分泌和葡萄糖代謝結(jié)果，最大值分別為：9.85 g/（d·L）、16.134 mmol/（d·L），說明肝細(xì)胞在培養(yǎng)階段中具有較高的代謝活性，DHP與D-半乳糖的接枝共聚產(chǎn)物制備的多孔生物載體具有良好的生物相容性。

DHP；生物載體；人體肝細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；生物相容性

肝臟是人體的重要器官，它是人體的物質(zhì)代謝中心，負(fù)責(zé)人體的代謝、排毒、循環(huán)調(diào)節(jié)身體的功能。然而肝臟疾病對人體危害極大甚至導(dǎo)致死亡，威脅著人類的身體健康，肝組織工程支架材料已經(jīng)成為了醫(yī)學(xué)與科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究。肝組織工程是一門新興學(xué)科，其核心是使肝細(xì)胞與生物載體材料形成三維體外活體組織，以病損組織重建或永久替代［1］。根據(jù)來源不同，可將原材料分為天然高分子材料和人工合成高分子材料［2，3］。

木素碳水化合物（lignin-carbonhydrate complex，簡稱LCC）是由木素和聚糖通過共價(jià)鍵形成的不均一高分子，是良好的生物材料［4，5］。李金玲等［6］發(fā)現(xiàn)，LCC具有良好的動物細(xì)胞相容性，所含聚糖部分具有細(xì)胞識別能力，能與細(xì)胞上的糖受體發(fā)生吸附［7］。然而，動物細(xì)胞對木素與多糖的親和性不同，天然LCC具有一定局限性，若能夠使用木素脫氫聚合物（dehydogenation polymer，簡稱DHP）及其衍生物與聚糖進(jìn)行聚合，將能夠靈活的滿足不同細(xì)胞需求。

1960年，F(xiàn)erudenberg等［8］對木質(zhì)素的合成進(jìn)行了研究，使用松伯醇合成一種叫做脫氫聚合物的人工合成木素，它的結(jié)構(gòu)與天然木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)十分相似。1995年，Terashima等［9］將甘露糖和果膠視為碳水化合物與木質(zhì)素進(jìn)行復(fù)合，以松伯醇葡萄糖苷作為木質(zhì)素的前驅(qū)化合物在過氧化物酶體系下合成了DHP與多糖的復(fù)合體，這種復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與磨木木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似。 Seo等［10］利用木材聚半乳糖葡萄糖甘露糖側(cè)鏈上的半乳糖單元，使肝細(xì)胞能夠在基質(zhì)上良好的粘附并形成肝細(xì)胞聚集體。肝細(xì)胞是一種依賴貼壁性的細(xì)胞，其表面存在去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）［11］，又稱為半乳糖受體，主要表達(dá)與肝細(xì)胞表面，可以與半乳糖產(chǎn)生特異性作用。采用DHP與D-半乳糖復(fù)合制備多孔生物水凝膠［12］載體，可以模仿天然LCC在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，其具有一定的溶脹率［13］，可以提高載體的比表面積并使載體孔隙增大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和代謝物質(zhì)的清理，肝細(xì)胞在孔內(nèi)生長也能受到保護(hù)，更接近于正常形態(tài)。良好的生物相容性及三維結(jié)構(gòu)，使體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)和培養(yǎng)環(huán)境更加接近體內(nèi)狀態(tài)［14，15］，代謝活性比單層培養(yǎng)細(xì)胞有所提高［16，17］。

本研究利用人工合成的DHP與D-半乳糖為原材料，通過與縮水甘油醚的交聯(lián)形成DHP-半乳糖復(fù)合體，制備具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔生物載體水凝膠。利用紅外光譜分析儀、核磁共振波譜儀和孔隙率測定儀測定載體化學(xué)結(jié)構(gòu)及多孔性能，并對體外培養(yǎng)中肝細(xì)胞代謝活性進(jìn)行檢測，旨在解決天然LCC制備生物載體中糖的種類與含量不可控的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

醋酸鈉、醋酸、過氧化物酶、乙醇、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、聚乙二醇縮水甘油醚；白蛋白試劑盒、葡萄糖試劑盒，南京建成生物研究所；胎牛血清，杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胰蛋白酶消化液，谷歌生物；人體肝細(xì)胞L-02，武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。

FT-IR型紅外光譜儀Thermofisher Nicolet 6700型；冷凍干燥機(jī)Labconco 195型；掃描電子顯微鏡JSM-5610LV，日本電子株式會社；紫外可見分光光度計(jì)Shimadizu UV-2550型；全自動比表面和孔隙度分析儀BELSORP-MiniⅡ型。

1.2 方法

1.2.1 DHP多孔生物載體材料的制備

1.2.1.1 人工合成DHP 將松柏醇-β-D葡萄糖苷溶解在醋酸鈉/醋酸緩沖溶液（pH4.6）中，在無菌條件下將含有辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶和β-葡萄糖苷酶的混合溶液加入三口瓶中，使用恒流泵將松柏醇-β-D葡萄糖苷溶液滴加到含酶的緩沖溶液中，三口瓶始終保持無菌狀態(tài)在恒溫水浴鍋（30℃）中，并持續(xù)經(jīng)過活性炭和棉花凈化通入空氣，當(dāng)松柏醇-β-D葡萄糖苷溶液滴加完后，等待反應(yīng)1 d后，繼續(xù)加入酶的混合溶液，繼續(xù)反應(yīng)7 d。反應(yīng)結(jié)束后將溶液離心分離，保留固體物質(zhì)，使用蒸餾水清洗固體物質(zhì)5次以上保證將殘留的酶、水溶性的LCC以及未參加反應(yīng)的起始物清洗干凈，冷凍干燥后得到粗產(chǎn)物，向粗產(chǎn)物中加入二氯乙烷/乙醇（2/1，V/V）溶液，室溫下攪拌4 h后離心分離，收集溶解部分在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將所得的固體殘留物放入減壓真空干燥箱中干燥2 d得到DHP。

1.2.1.2 DHP-半乳糖復(fù)合體及多孔生物載體制備 將50 mg DHP與100 μL NaOH（3.3 mol/L）放入小試管中，利用磁轉(zhuǎn)子進(jìn)行混合攪拌4 h后，向試管中添加100 μL聚乙二醇縮水甘油醚，含糖載體需再加入占總組分1%的D-半乳糖，攪拌均勻后封口，放入50℃水浴鍋中反應(yīng)24 h后接枝共聚成為DHP-半乳糖復(fù)合體，并得到成型的水凝膠材料，其具有一定強(qiáng)度。使用蒸餾水對水凝膠進(jìn)行浸泡，每12 h更換一次蒸餾水，直至蒸餾水澄清且pH7，可將水凝膠材料取出。放入冷凍干燥機(jī)脫水24 h后取出，兩種多孔生物載體制備完成。將載體于-20℃條件下進(jìn)行保存，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 生物載體的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

1.2.2.1 比表面積和孔隙度分析 采用BELSORPMiniⅡ型全自動比表面積和孔隙度分析儀對多孔生物載體的比表面積和孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，將載體樣品于250℃預(yù)處理4 h，然后在-198℃條件下使用N2吸附與脫附，測定樣品在不同P/P0下N2的凝聚量，得到樣品的吸脫附曲線與孔徑分布曲線，從而得出樣品的比表面積，并通過電鏡圖觀測多孔生物載體的孔隙度。

1.2.2.2 紅外光譜分析 取2 mg多孔生物載體材料樣品與300 mg的無水KBr混合，研磨均勻后，取少量倒入壓片模具中壓片，采用Thermofisher Nicolet公司6700型紅外光譜儀用透過法測定FT-IR光譜圖。

1.2.2.3 多孔生物載體的糖分析 取多孔生物載體樣品50 mg，移入小試管中，加入72%硫酸500 μL，攪拌均勻后在常溫下水解60 min，將水解液移至250 mL滅菌瓶中，加入洗滌水及蒸餾水14 mL，將酸稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。將滅菌瓶移入高壓滅菌鍋中，在121℃下滅菌45 min。采用質(zhì)量恒定的G3砂芯坩堝抽濾，取濾液3 mL，使用BaCO3調(diào)節(jié)pH值至7，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用HPLC對過濾后的液體進(jìn)行測試。HPLC分離條件：色譜柱Aminex HPX-87P 300 mm×7.8 mm；柱溫85℃；蒸餾水流動相；流速0.6 mL/min；最大壓力10.3 MPa，檢測器為差示折光檢測器；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2.4 固體13C NMR分析 采用Bruker公司的AVANGE DRX-500超導(dǎo)核磁共振波譜儀，在100.6 MHz下對多孔生物載體進(jìn)行13C連續(xù)掃描，得到樣品的固體13C NMR譜圖。實(shí)驗(yàn)條件：溫度300 K，氘帶POM（聚甲醛）轉(zhuǎn)子（轉(zhuǎn)速6.0 kHz），3 ms接觸時(shí)間，0.05 s接受時(shí)間，脈沖寬度為12.8 μs，脈沖遲滯3 s。每個(gè)樣品掃描越3 000次以提高信噪比。

1.2.2.5 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 將體外培養(yǎng)后的多孔生物載體收集，使用鋨酸后固定技術(shù)，使附著在載體表面的肝細(xì)胞產(chǎn)生良好的的反差，繼續(xù)使用梯度乙醇（50%，60%，70%，80%，90%，100%）脫水，真空干燥后將固定好的多孔生物載體材料置于硅片上，真空噴濺金離子，用掃描電子顯微鏡觀察多孔生物載體材料的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 生物載體材料在人體細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用

1.2.3.1 人體肝細(xì)胞L-02的培養(yǎng) 各取含糖與不含糖多孔生物載體15 mg在電熱烘箱中170℃，滅菌2 h。將人體肝細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL接種在加有多孔生物載體的6孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔中加入1 mL的RPMI-1640（含20%的新生胎牛血清）培養(yǎng)基，放入37℃，5% CO2，100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h更換一次培養(yǎng)液，并用倒置相差顯微鏡觀察每天的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞在生物載體表面的粘附情況。

1.2.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 在人肝細(xì)胞L-02培養(yǎng)的第1-6天，在超凈工作臺上，每天分別取出實(shí)驗(yàn)組與對照組的代謝液，之后用2 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗孔洞2次，用2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化液消化8 min，棄去消化液，加入1 mL的RPMI-1640（含20%的新生胎牛血清）培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞從孔壁上吹打下來制備成細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液，加入等量的0.4%臺盼藍(lán)溶液染色，使兩者混合均勻，然后吸取適量混合液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下數(shù)出四大格中被染色的細(xì)胞的數(shù)量，按公式計(jì)算出細(xì)胞總數(shù)。

1.2.3.3 代謝活性的檢測 利用溴甲酚綠法測定白蛋白含量。取10 μL蒸餾水、白蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣（34.8 g/L）和實(shí)驗(yàn)過程中每天收集的細(xì)胞代謝液，分別加入小試管中，每個(gè)試管中都滴加2.5 mL溴甲酚綠溶液，室溫下混勻反應(yīng)10 min。 利用雙蒸水在628 nm下將紫外分光光度計(jì)調(diào)零后，對以上試管進(jìn)行測定得到各試管的吸光度A空白、A標(biāo)準(zhǔn)和A樣品，白蛋白含量計(jì)算公式：

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定葡萄糖含量。取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖（5.55 mmol/L）和實(shí)驗(yàn)過程中每天收集的細(xì)胞代謝液，分別加入小試管中，之后每支試管中加入含葡萄糖氧化酶（10 U/mL）、過氧化物酶（1 U/mL）磷酸緩沖溶液（pH7）、苯酚（10.6 mmol/L）和4-氨基安替比林（70 mmol/L）的混合溶液1 mL，混勻后在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min，使用雙蒸水在505 nm波長處將紫外分光光度計(jì)調(diào)零后，測定標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管的吸光度A標(biāo)準(zhǔn)、A樣品，葡萄糖含量計(jì)算公式：

2 結(jié)果

2.1 生物載體的形態(tài)觀察與化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 半乳糖復(fù)合體掃描電鏡圖 通過測定所得含糖生物載體的比表面積為6.013 m2/g，從圖1中可測量出含糖生物載體的平均孔徑20 μm，孔隙率為60%，內(nèi)部孔隙相互連通，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散及代謝物質(zhì)的排出。

圖1 DHP-半乳糖復(fù)合體的表面形態(tài)

2.1.2 FT-IR光譜圖 以DHP為原材料的多孔生物載體的紅外光譜如圖2、表1所示。從圖2可看出3438 cm-1處羥基峰、1087 cm-1處的C-O-C和醇基C-O的振動峰，表明其中存在糖結(jié)構(gòu)，圖2-B中加入1%的D-半乳糖，從差譜圖2-C可觀察到這兩處峰強(qiáng)有所加強(qiáng)。圖2-A與圖2-B都具有來自木質(zhì)素芳香核的1 510.01 cm-1和1 420.79 cm-1的吸收峰，表明兩種材料都具有木質(zhì)素結(jié)構(gòu)。圖2-B材料不僅具有剛性疏水的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，還有柔性親水的糖結(jié)構(gòu)，使其具備生物載體的基本要求。

圖2 多孔生物載體的FT-IR光譜圖

表1 多孔生物載體的紅外光譜圖信號分析

2.1.3 生物載體糖分析結(jié)果 根據(jù)不同糖的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，使用高壓液相色譜法測定多孔生物載體中的糖含量。測試結(jié)果顯示，加入1%組分D-半乳糖的多孔生物材料中含有0.95%的D-半乳糖和部分葡萄糖，說明合成含糖多孔生物載體時(shí)，D-半乳糖基本按照預(yù)期所加含量與原材料進(jìn)行結(jié)合，說明可以控制生物載體內(nèi)的糖含量，得到最適宜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以保證多孔生物材料具有良好的生物相容性。

2.1.4 固體13C NMR譜圖 在脂肪族碳原子區(qū)（δ0-110），δ79.5來自半乳糖與DHP以苯甲醚鍵連接結(jié)構(gòu)的α-C與β-C（NO.8），δ69.9-72.1來自半乳糖與DHP以酯鍵連接結(jié)構(gòu)的α-C。從差譜圖中觀察到δ79.5、δ69.9-72.1處有一定波動，表明圖3樣品A中DHP與半乳糖發(fā)生連接，形成水凝膠生物載體。各材料共振信號的基團(tuán)歸屬見表2。

圖3 多孔生物載體的13C NMR譜圖

表2 多孔生物載體的13C NMR信號分析

2.1.5 體外培養(yǎng)中載體掃描電鏡（SEM） 從圖4中可以觀察到，兩種生物載體表面的孔洞相互交錯，都具有一定強(qiáng)度，且孔洞數(shù)量較多，提高比表面積，細(xì)胞能在孔內(nèi)生長，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)擴(kuò)散暢通，提升了肝細(xì)胞生長的三維空間和營養(yǎng)輸送。圖4-A標(biāo)記處能夠看到有肝細(xì)胞附著在其上，圖4-B中載體上無肝細(xì)胞附著。表明含糖多孔載體具有良好生物相容性，可以提供人體肝細(xì)胞適宜生長環(huán)境。

2.2 多孔生物載體在人體肝細(xì)胞體外培養(yǎng)中的觀測

2.2.1 細(xì)胞形態(tài) 將人體肝細(xì)胞L-02接種在制作好的多孔生物載體上，對細(xì)胞進(jìn)行靜態(tài)觀察。每天將細(xì)胞培養(yǎng)孔板取出，置于倒置顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的生長情況與形態(tài)。圖5所示為含半乳糖的多孔生物載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)圖，從圖5中可以觀察到隨著天數(shù)增加，細(xì)胞生長情況越來越好，細(xì)胞數(shù)增多，并且能觀察到細(xì)胞黏附在多孔生物載體周圍進(jìn)行生長且形態(tài)良好。圖6所示為不含糖的多孔生物載體細(xì)胞培養(yǎng)圖，圖6中細(xì)胞前期有部分增加，但總體細(xì)胞數(shù)不多，第5、6天時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)減少趨勢。由此證明含半乳糖的載體具有良好的生物相容性。

2.2.2 人體肝細(xì)胞生長曲線 在倒置生物相差顯微鏡下使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，對培養(yǎng)的人體肝細(xì)胞L-02的第1-6天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果如圖7所示。從圖7中可看出，制作的不含半乳糖的DHP多孔生物載體所培養(yǎng)的人體肝細(xì)胞生長情況比不上空白樣（Blank）。而加入D-半乳糖組分占1%的DHP多孔生物載體與空白對照組所培養(yǎng)的肝細(xì)胞生長良好，第1-5天細(xì)胞保持增長狀態(tài)，第5天的生長速率最大，細(xì)胞總數(shù)到達(dá)最大值。DHP含糖載體的細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)總體高于空白對照組，表明加入一定D-半乳糖的DHP多孔生物載體具有良好的生物相容性。

圖4 人工合成DHP多孔生物載體的掃描電鏡圖

圖5 人體肝細(xì)胞L-02在含糖多孔生物載體上的生長情況

圖6 人體肝細(xì)胞L-02在不含半乳糖多孔生物載體上的生長情況

圖7 人肝細(xì)胞生長曲線

2.2.3 人體肝細(xì)胞的代謝活性 肝細(xì)胞的代謝活性的兩項(xiàng)重要指標(biāo)白蛋白分泌與葡萄糖代謝如圖8所示。從圖8可清晰看出，加入1%D-半乳糖的復(fù)合體材料在體外培養(yǎng)的6 d中，肝細(xì)胞L-02代謝活性始終保持較好狀態(tài)，好于空白對照組與不加D-半乳糖的多孔生物載體，表明其具有良好的生物相容性，有利于對肝細(xì)胞的培養(yǎng)。

圖8 肝細(xì)胞代謝活性

3 討論

天然LCC可以作為良好的生物載體材料，尤其是從銀杏等木材提取的LCC由于含有適量的半乳糖聚合物［6］，能為人肝細(xì)胞的半乳糖受體（galactose receptor）所感知到［18］，從而促進(jìn)體外培養(yǎng)過程中人肝細(xì)胞在LCC基生物載體上的黏附、生長、繁殖、分化，因此LCC基生物載體具有良好的生物相容性。但因天然LCC中半乳糖的含量根據(jù)植物纖維材料的種類而變化，選擇具有最適合人肝細(xì)胞的半乳糖含量的植物纖維原料受到較大的限制。本研究為了解決此問題，使用DHP與D-半乳糖進(jìn)行聚合，能夠靈活地調(diào)節(jié)LCC基多孔生物水凝膠載體中D-半乳糖的含量。從生物載體的差示光譜的分析結(jié)果（圖2）可知，含1%糖載體在1 086 cm-1處的C-O-C彎曲振動信號明顯增強(qiáng)，表明DHP上成功地接枝了D-半乳糖。從差示譜圖（圖3）上發(fā)現(xiàn)79.4 ppm處的信號（No.8）和69.9-72.1 ppm處的信號（No.9）分別來自半乳糖結(jié)構(gòu)單元中的C1和C4，進(jìn)一步闡明了本研究合成的DHP-半乳糖復(fù)合體中半乳糖結(jié)構(gòu)單元的存在。 通過水凝膠的方法制備醫(yī)用多孔生物載體，比表面積為達(dá)到6.013 m2/g，適合人肝細(xì)胞的培養(yǎng)。因此，無論是生物載體化學(xué)組分還是多孔性及表面形態(tài)方面，以DHP與D-半乳糖的接枝共聚產(chǎn)物作為原料可以制備性能良好的多孔生物載體。

在體外培養(yǎng)中與肝細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬天然LCC在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。對所制備的含糖與不含糖DHP生物載體進(jìn)行電鏡觀察，兩者都具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，由于使用了含半乳糖的生物載體，使肝細(xì)胞能夠更好的附著在含糖載體表面進(jìn)行生長，分析體外培養(yǎng)中肝細(xì)胞的生長情況及代謝活性，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果得出采用含半乳糖與不含糖的載體時(shí)細(xì)胞數(shù)最大值分別為16.5×105/mL、2.375×105/mL，表明D-半乳糖的加入可以有效提高載體誘導(dǎo)人肝細(xì)胞的增殖的能力。使用以DHP-半乳糖復(fù)合體為原料制備的生物載體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，白蛋白分泌和葡萄糖代謝值最大值分別為：9.85 g/（d·L）、16.134 mmol/（d·L），遠(yuǎn)高于不含半乳糖的載體。以上結(jié)果表明DHP復(fù)合體材料結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞生長，具有良好的生物相容性。

本研究創(chuàng)新的使用了DHP與聚糖進(jìn)行接枝共聚制備生物載體，此方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以對聚糖的種類及含量進(jìn)行控制，更加靈活的滿足各種細(xì)胞的需求。但缺點(diǎn)在于人工合成DHP-聚糖復(fù)合體的分子量較低，使得后期載體的制備步驟較為繁瑣，周期較長，并且聚糖的最佳含量也需要反復(fù)試驗(yàn)，才能得到具有良好性質(zhì)的生物載體。本研究尚未得出對于肝細(xì)胞D-半乳糖的最佳含量。在今后的研究中，將繼續(xù)探索DHP多孔生物載體的不同制備方法，以實(shí)現(xiàn)快速、高效的載體制備，并針對不同細(xì)胞的需求，對所添加聚糖的種類及含量進(jìn)行研究，使DHP多孔生物載體能夠更好的投入到組織工程的應(yīng)用中。

4 結(jié)論

使用人工合成DHP制作的水凝膠多孔生物載體，具有良好的三維結(jié)構(gòu)，平均孔徑為20 μm，比表面積為6.013 m2/g。

利用DHP與D-半乳糖合成的接枝共聚產(chǎn)物制作的水凝膠多孔生物載體，比沒有加入D-半乳糖的載體具有更好的生物相容性，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果得出含半乳糖與不含糖細(xì)胞數(shù)最大值分別為：16.5×105/mL、2.375×105/mL，表明D-半乳糖的加入可以有效提高載體的生物相容性。

將水凝膠多孔生物載體用于人肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)，肝細(xì)胞能夠附著在其表面且生長良好，根據(jù)代謝活性結(jié)果，含半乳糖與不含糖的白蛋白分泌最大值分別為：9.85 g/（d·L）、4.01 g/（d·L），葡萄糖代謝最大值分別為：16.134 mmol/（d·L）、6.095 mmol/（d·L），肝細(xì)胞同時(shí)具有較高的代謝活性，以上表明用DHP-半乳糖接枝共聚產(chǎn)物制作的載體具有良好的生物相容性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation of Porous Biological Carrier with DHP-galactose Complex and Its Application in Culture of Human Hepatocytes

WU Chen-xi1XIE Yi-min1，2YE Zhe-zi1WANG Peng1，2LE Xi1
（1. School of Pulp & Paper Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan 430068；2. Hubei Provincial Key Laboratory of Green Materials for Light Industry，Hubei University of Technology，Wuhan 430068）

In order to enhance the biocompatibility of dehydrogenation polymer（DHP）with human hepatocytes，the DHP was copolymerized with D-galactose，by which a porous biological carrier for medical use was prepared using the method of hydrogel. Fourier transform infrared spectrometer（FT-IR），nuclear magnetic resonance（NMR）spectroscopy，BET specific surface area determination，and scanning electron microscope（SEM）were applied to elucidate the main composition，chemical and physical structure，and morphology of the porous biological carrier. Inverted microscope and albumin and glucose kits were used to check the morphology and metabolic activity of cultured hepatocytes. The results indicated that the porous biological carrier with excellent performance was prepared with co-polymer of DHP and D-galactose as raw material，and the specific surface area was 6.013 m2/g. The human hepatocytes healthily adhered on the porous biological carrier to grow and proliferate while the carriers were used to culture human hepatocytes. The maximum values of albumin secretion and glucose consumption using biological carrier containing galactose were 9.85 g/（d·L）and 16.134 mmol/（d·L），respectively，demonstrating that the hepatocytes presented high metabolic activity during culturing，and the porous biological carrier prepared with DHP-galactose complex had a great biocompatibility.

DHP；biological carrier；human hepatocytes；culture；biocompatibility

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.037

2015-12-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370574，31300494），湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（Q20131402），湖北工業(yè)大學(xué)高層次人才基金資助（BSQD12037），綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金［省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科（2013）2號-面上］

吳晨曦，男，碩士，研究方向：植物纖維資源化學(xué)；E-mail：wuchenxi276@163.com

謝益民，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物纖維資源化學(xué)；E-mail：ppymxie@163.com