三株柵藻屬藻株光合自養(yǎng)產(chǎn)油脂的比較研究

陳傳紅 吳洪 李青 尹順吉 羅少敬 崔春莉

（新奧科技發(fā)展有限公司 煤基低碳能源國家重點實驗室，廊坊 065001）

三株柵藻屬藻株光合自養(yǎng)產(chǎn)油脂的比較研究

陳傳紅 吳洪 李青 尹順吉 羅少敬 崔春莉

（新奧科技發(fā)展有限公司 煤基低碳能源國家重點實驗室，廊坊 065001）

通過柱式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)，比較研究三株柵藻（Scenedesmus sp簡寫S. sp、Scenedesmus deserticola、Scenedesmus dimorphus）的生長及油脂含量情況，得出3株藻生物量最高的是S. deserticola 為0.48 g/（L·d）；其次是S. sp為0.41 g/（L·d）；S. dimorphus產(chǎn)量最低為0.35 g/（L·d）。且培養(yǎng)后期經(jīng)尼羅紅染色清楚可見油脂分布，其中S. deserticola總脂含量達到了干重的55.3 %，總脂產(chǎn)量為0.29 g/（L·d）；S. dimorphus為46.7 %，0.18 g/（L·d）；S. sp為43.6 %，0.20 g/（L·d）。三株柵藻主要脂肪酸為C18和C16，占總脂肪酸組成的85 %以上，符合生物柴油的生產(chǎn)要求。綜合比較，S. deserticola是一株性能優(yōu)良的產(chǎn)油藻株。

柵藻；生長；尼羅紅；生物量；油脂

生物質(zhì)能源因其可再生、無污染已成為研究的熱點［1］，而微藻能源以其獨有特性在眾多生物質(zhì)能源中備受關(guān)注。微藻具有光合效率高、生長快、產(chǎn)油率高、不受養(yǎng)殖季節(jié)限制、不占用耕地農(nóng)田等優(yōu)勢，這是其它生物質(zhì)能源原料所不具備的。因此，利用微藻油脂生產(chǎn)生物燃料成為了潛在的替代能源研究熱點［2-4］。許多研究者以生產(chǎn)微藻生物燃料為目標(biāo)，對產(chǎn)油微藻進行了大量的篩選工作［5-8］。而柵藻作為一種單細胞微藻，具有生長快、環(huán)境適應(yīng)性強、油脂含量高等優(yōu)點，可能成為微藻生物燃料的候選微藻種類之一［1，9］。柵藻屬于綠藻門，綠球藻目，柵藻科，是淡水中極為常見的種類。目前對柵藻的研究主要集中在污水處理［10-12］、有機物或重金屬毒理及吸附等研究方面［13-15］。

本實驗對不同的柵藻藻株進行生長、油脂含量及分布情況研究，旨在獲得生長速度快，油脂含量高的柵藻藻株，建立柵藻生長和產(chǎn)油性能的基本評價方法，為柵藻生產(chǎn)生物燃料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藻 種：柵 藻（Scenedesmus sp， 簡 寫S. sp）、荒 漠 柵 列 藻（Scenedesmus deserticola， 簡 寫 S. deserticola）、雙形柵藻（Scenedesmus dimorphus，簡寫S. dimorphus）3株藻種，均由本公司藻種庫保存。

培養(yǎng)基：BG11培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將對數(shù)期的藻種接種到500 mL的三角瓶中通氣培養(yǎng)，達到一定的OD值后，轉(zhuǎn)接到Ф4 cm×60 cm柱式反應(yīng)器中進行生長和產(chǎn)油性能評價，初始OD750值在0.8左右。采用單根玻璃管通氣，所通入氣體為空氣和CO2混合氣（CO2含量：1.5%-2.0%），培養(yǎng)期間通氣不間斷。溫度（28±1）℃，光強約為200 μmol·m-2·s-1，24 h光照，pH值控制在7-9之間；定期取適量藻液，進行相應(yīng)參數(shù)的測定。

1.2.2 分析測試與計算

1.2.2.1 比生長速率 采用干重計算，利用公式：比生長速率μ=（LnNt-LnN0）/t，其中 N0為初始干重值，Nt為培養(yǎng)第t 天的干重值，t 為培養(yǎng)時間［16］。

1.2.2.2 葉綠素a含量 移取一定體積（V）的藻液放置在15 mL的離心管中，3 500 r/min轉(zhuǎn)離心5 min，去上清液；然后加入一定體積（U）的甲醇震蕩混勻留下的藻團，將離心管放置在70℃的水浴中加熱提取 5 min，3 500 r/min離心5 min，取上清液在665 nm 和750 nm下測定吸光值［17］。

葉 綠 素a含 量（mg/L）= 13.9（OD665-OD750）*U/V

1.2.2.3 細胞干重 ? 25 mm 或47 mm的Whatman（GF/F，GF/C）濾紙，空白濾紙事先烘干（105℃）稱重，移取一定體積的藻液（根據(jù)所培養(yǎng)的藻液的濃度來確定取樣的體積）真空抽濾，放置在105℃的烘箱中過夜烘干，取出放置在干燥器中冷卻后稱重。

1.2.2.4 尼羅紅染色 收集培養(yǎng)完成的藻液（0.5 mL），4 000 r/min離心5 min，去上清，并用去離子水洗滌2次，后用20% DMSO水溶液重懸浮至0.5 mL，加入尼羅紅，使尼羅紅的濃度為1 μg/L，35℃水浴10 min，后用去離子水洗滌一次，此時將染色的藻細胞置于熒光顯微鏡下觀察［18］。

1.2.2.5 油脂含量及脂肪酸組成測定

（1）總脂提取：參照文獻方法［19］，取50 mg或100 mg凍干藻粉（dw）放置在具Telfnon螺口瓶蓋的體積為15-20 mL的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4 mL 10% DMSO-Methanol 溶液，40℃砂?。ㄊ⑸暗臒胖煤銣丶訜岽帕嚢杵魃希? min；然后在4℃下磁力攪拌抽提30 min，3 500 r/min離心，轉(zhuǎn)移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚、正己烷4-8 mL 4℃下磁力攪拌抽提1 h，3500 r/min離心，轉(zhuǎn)移上清液到上述一小瓶中?？芍貜?fù)上述過程直到藻渣變白。在上述合并抽提液中加入純水使四者（水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷）體積比例為 1∶1∶1∶1，震蕩分相，移取有機相轉(zhuǎn)移到另一小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至成濃縮液，然后轉(zhuǎn)移到事先稱重過的1.5 mL塑料離心管（dw1）中，再用氮氣吹干至恒重（dw2）。

總脂含量（%）=（dw2-dw1）*100%/dw

總脂產(chǎn)量（g/（L·d））=總脂含量（%）*細胞干重（g/L）/培養(yǎng)時間（d）

（2）脂肪酸分析：參照文獻［20］方法，使用Agilent 6820氣相色譜儀進行氣相色譜分析（色譜條件為載氣：氮氣流量1 mL/min、氫氣流量30 mL/ min、空氣流量300 mL/min，進樣口溫度：280℃，檢測器溫度：280℃，檢測器類型：Agilent FID，色譜柱：Agilent DB-5毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），分流比：4∶1。分析方法：內(nèi)標(biāo)法GB/T 17377-1998（氣相色譜用氮氣作載氣，相當(dāng)于液相色譜的流動相）。

1.2.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用Excel和SPSS11軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析

2 結(jié)果

2.1 三株柵藻生長特性比較

三株柵藻在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)16 d，分別于2、4、6、8、10、13、16 d取樣測定OD值和生物量。結(jié)果（圖1）顯示，3株柵藻都經(jīng)過了在2-4 d的快速生長階段，而4 d后進入較緩慢的增長階段。在培養(yǎng)16 d中，S. deserticola生長最快，產(chǎn)量達到了0.48 g/（L·d）；其次是S. sp，產(chǎn)量為0.41 g/（L·d）；最后是S. dimorphus，產(chǎn)量為0.35 g/（L·d）。三株藻的生物量在16 d的培養(yǎng)中持續(xù)增加（圖2），S. deserticola的最高生物量為8.27 g/L；其次是S. sp為7.24 g/L；S. dimorphus生物量最低，為6.13 g/L。S. deserticola的最大生物量顯著高于S. sp（P<0.05），而極顯著高于S. dimorphus（P<0.01）。三株藻最大比生長速率出現(xiàn)在2-4 d，均達到了0.43 d-1以上；S. deserticola 16 d平均比生長速率為0.165 d-1，S. sp為0.153 d-1，S. dimorphus為0.145 d-1。上述結(jié)果表明，S. deserticola的生物量積累速度比其它兩株柵藻更快，同樣培養(yǎng)時間積累的生物質(zhì)更多。

圖1 三株柵藻OD750值的變化

圖2 三株柵藻生物量的變化

2.2 三株柵藻葉綠素a含量的變化

在培養(yǎng)過程中，3株柵藻的葉綠素a含量（圖3）在經(jīng)過4 d的快速增加后達到最高值：S. sp為63.0 mg/L，S. deserticola為 80.8 mg/L，S. dimorphus為66.3 mg/L。3株藻在0-4 d葉綠素a含量增長最快，S. sp和S. deserticola在4-10 d持續(xù)維持高值后分別下降54.4%和43.7%；而S. dimorphus在第4天達到最高值后即開始迅速下降，在16 d時僅為16.6 mg/L，與最高含量相比下降了74.9%。

圖3 三株柵藻葉綠素a含量的變化

2.3 三株柵藻細胞形態(tài)和油脂積累位置觀察

三株柵藻在經(jīng)過16 d的培養(yǎng)后進行了尼羅紅染色，結(jié)果（圖4）表明，3株柵藻從原來的綠色細胞轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色細胞，細胞的個體明顯增大，其中S. deserticola和S. sp的細胞由早期的卵形向圓形轉(zhuǎn)變，而S. dimorphus細胞長與寬的比值逐漸縮小，細胞形態(tài)由長梭形變化為橢圓形。同時，在3株柵藻的細胞質(zhì)內(nèi)積累了大量的油脂，并且3株柵藻油脂積累的部位存在差異，其中，S. deserticola和S. sp的油脂主要積累在細胞的一側(cè)，而S. dimorphus主要在細胞的兩端及細胞壁邊緣。

2.4 三株柵藻總脂含量及脂肪酸組成分析

在培養(yǎng)16 d后3株柵藻的總脂含量都超過了干重的40%（圖5-A），S. deserticola的總脂含量最高，達到55.3%，S. dimorphus為46.7%，S.sp為43.6%。S. deserticola的總脂含量顯著高于S. dimorphus（P<0.05），極顯著高于S. sp（P<0.01）。S. deserticola的16 d平均總脂產(chǎn)量最高，達到了0.29 g/（L·d），其次是S. sp為0.20 g/（L·d），最低為S. dimorphus，產(chǎn)量為0.18 g/（L·d）（圖5-B）。

對培養(yǎng)16 d時的脂肪酸組成分析結(jié)果（表1）顯示，3株柵藻的主要脂肪酸均為C18和C16，占總脂肪酸組成的85%以上。S. sp三種主要脂肪酸為C18∶1、C16∶0、C18∶2，占總脂肪酸的62.7%；S. deserticola三種主要脂肪酸為C18∶1、C16∶0、C18∶3α，占總脂肪酸的64.6%；S. dimorphus三種主要脂肪酸為C18∶1、C16∶0、C18∶4，占總脂肪酸的68.3%。3株柵藻的C20以上脂肪酸的總和均低于總脂肪酸組成的2%。

圖4 三株柵藻培養(yǎng)前期圖（a-1、b-1、c-1）和培養(yǎng)16 d的細胞形態(tài)（a-2、b-2、c-2）與油脂分布圖（a-3、b-3、c-3）

圖5 三株柵藻培養(yǎng)16 d時的總脂含量（A）以總脂產(chǎn)量（B）

表1 三株柵藻培養(yǎng)16 d時脂肪酸組成

3 討論

本研究對3株柵藻的生長特性進行了比較，在相同的接種濃度和培養(yǎng)條件下，3株柵藻在生長上能夠表現(xiàn)出不同的差異，S. deserticola的最大生物量顯著高于其它兩株，達到了8.27 g/L，比S. sp高出14.2%，比S. dimorphus高出34.9%。說明了相同屬的藻株，由于生長環(huán)境不同或藻株自身的特性差異等原因，藻株的生長速度和生物量積累能力存在差異，這與王元麗［21］對不同的真眼點藻的生長研究結(jié)果一致。同時，3株藻在葉綠素a含量的變化差異，與許多研究者結(jié)果類似［7，22］，其中展望［22］認為葉綠素a含量在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)的先上升后下降的趨勢，可能是由于細胞密度的增加使每個細胞接受到的光暗頻率下降，光照強度相對降低所造成的。

一般情況下，隨著藻類培養(yǎng)時間的延長，藻細胞在色素含量上發(fā)生變化，同時由于細胞濃度的不斷增加和營養(yǎng)鹽的減少，藻細胞的形態(tài)會發(fā)生改變，油脂也不斷積累，到培養(yǎng)后期達到較高的水平。尼羅紅作為一種脂溶性熒光燃料，常用于微生物的油脂含量的評估。當(dāng)藻細胞積累大量的油脂后，通過尼羅紅染色可以清楚觀察到油脂的分布及積累情況［23］。

用于生物柴油生產(chǎn)的原料油脂，其脂肪酸組成和含量將直接影響生物柴油的品質(zhì)。油脂中的三酰甘油酯是油脂加工的主要原料，故微藻中三酰甘油酯的脂肪酸組成和含量是評估該藻能否作為生物柴油生產(chǎn)藻株的重要因素。在生物柴油的生產(chǎn)中，要求作為原料的脂質(zhì)應(yīng)有較高含量的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，同時盡可能少的多不飽和脂肪酸含量［23，24］。在本研究中，三株柵藻的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量均在60%以上，且主要脂肪酸的C18和C16占總脂肪酸組成的85%以上，同時C20以上脂肪酸的總和均低于總脂肪酸組成的2%，表明這3株柵藻的油脂特性符合生物柴油生產(chǎn)的要求［25］。

4 結(jié)論

利用柱式反應(yīng)器在相同的培養(yǎng)條件下，通過對三株柵藻進行生長速率、生物量及油脂含量和組成等參數(shù)的測定和分析比較，建立了優(yōu)良產(chǎn)油柵藻藻種的性能評價方法。結(jié)果顯示，3株藻積累最高生物量的是S. deserticola 為8.27 g/L；其次是S. sp為7.24 g/L；S. dimorphus產(chǎn)量最低為6.13 g/L。S. deserticola總脂含量和產(chǎn)量分別為達到了55.3%，和產(chǎn)量為0.29 g/（L·d），S. dimorphus為46.7%，產(chǎn)量為和0.18 g/（L·d），S. sp為43.6%，產(chǎn)量為和0.20 g/（L·d）。3株柵藻的主要脂肪酸為C18和C16，占總脂肪酸組成的85%以上，C20以上脂肪酸的總和低于總脂肪酸組成的2%。綜合生物量、總脂產(chǎn)量和脂肪酸組成的比較結(jié)果，S. deserticola是三株柵藻中最優(yōu)良的產(chǎn)油藻株。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Lipid Production from the Photoautotrophy of Three Strains of Scenedesmus Species

CHEN Chuan-hong WU Hong LI Qing YIN Shun-ji LUO Shao-jing CUI Chun-li
（State Key Laboratory of Coal-based Low-carbon Energy，Xin’ao Scientific ＆ Technological Developmental Co.，Ltd.，Langfang 065001）

The growth and the lipid content of 3 strains of Scenedesmus were compared by column photobioreactor，and it was concluded that the strain of producing the highest biomass was Scenedesmus deserticola with 0.48 g/（L·d），followed by Scenedesmus sp（S. sp）0.41 g/（L·d），and the lowest by S. dimorphus with 0.35 g/（L·d）. In the late culture stage，the lipid distribution was clearly visible by Nile red staining. The total lipid content and the lipid productivity of S. deserticola were 55.3 % of DCW and 0.29 g/（L·d），respectively，followed by S. dimorphus in 46.7 % and 0.18 g/（L·d），S. sp in 43.6 % and 0.20 g/（L·d）. The main fatty acid composition of 3 Scenedesmus were C18 and C16，accounting for over 85% of total fatty acids，satisfying the requirements of biodiesel production. Comprehensive comparison revealed that the S. deserticola was a lipid-producing strain with high performance.

Scenedesmus species；growth；Nile red；biomass；lipid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.035

2015-09-30

國家“973”計劃重點項目（2012CB723606）

陳傳紅，女，碩士，助理研究員，研究方向：微藻藻種選育和微藻養(yǎng)殖等；E-mail：chench@enn.cn

吳洪，女，博士，研究方向：微藻藻種選育和高效養(yǎng)殖方式；E-mail：wuhong@enn.cn