• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于尼羅紅染色分析金藻總脂動態(tài)積累

    2014-05-27 08:07:30周文俊韓笑天鄭明剛張魁英崔志松
    水生生物學(xué)報(bào) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:總脂微藻油脂

    周文俊 鄭 立 韓笑天 鄭明剛 張魁英 高 偉 崔志松

    ?

    基于尼羅紅染色分析金藻總脂動態(tài)積累

    周文俊1鄭 立1韓笑天2鄭明剛1張魁英1高 偉1崔志松1

    (1. 國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心, 青島 266061; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266060)

    通過尼羅紅熒光染色對一株富油微藻金藻sp.CCMM5001建立和完善了一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量金藻油脂含量的方法, 利用該方法探索了不同培養(yǎng)條件對金藻生長和總脂積累的影響。結(jié)果表明: 經(jīng)尼羅紅染色后, 金藻的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度與其總脂含量呈良好的線性關(guān)系; 金藻最適生長的氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度分別為1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃; 最適總脂積累的氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度分別為441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃; 優(yōu)化培養(yǎng)條件并采用兩階段培養(yǎng)法后總脂含量和油脂產(chǎn)率都有大幅提高, 可分別高達(dá)63.3%和22 mg/(L·d)。

    金藻; 尼羅紅; 總脂; 熒光強(qiáng)度; 生長曲線

    近年來, 生物柴油因其來源廣泛、燃燒性能高、對環(huán)境污染低以及可再生等優(yōu)點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)。目前國際上主要以大豆、油菜籽、蓖麻籽、棕櫚種子以及動物脂肪等為原料生產(chǎn)生物柴油[1—3], 但這些原料尚不能滿足當(dāng)前經(jīng)濟(jì)發(fā)展對生物柴油的需求, 同時因其與糧食作物爭用耕地而可能導(dǎo)致世界糧食供應(yīng)問題[4], 對此, 科研人員提出用高油脂含量的微藻來替代傳統(tǒng)油料作物生產(chǎn)生物柴油[4—6]。以微藻為原料生產(chǎn)的生物柴油具有清潔環(huán)保、燃燒性能好以及可再生等優(yōu)點(diǎn), 一些微藻如[7]、sp.[8]、[9]、[10]和[11]等已被報(bào)道可以高效地生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物柴油。盡管如此, 這類適合應(yīng)用于生產(chǎn)生物柴油的微藻種類還很有限, 而如何快速有效地從大量的微藻種類中篩選高油脂含量的藻種, 并根據(jù)其油脂積累特點(diǎn)優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最高的油脂產(chǎn)率一直是微藻生物柴油研究需要解決的難題。傳統(tǒng)的油脂提取方法要預(yù)先收集足量的藻體并進(jìn)行凍干、研磨、反復(fù)萃取、離心以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等一系列繁瑣的步驟[12], 這不僅耗時耗力, 并且需要使用大量三氯甲烷和甲醇等化學(xué)試劑。因此, 亟待建立和完善一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量檢測微藻油脂含量的方法。

    尼羅紅是一種具有較強(qiáng)熒光特性的疏水性染料,它可與脂類物質(zhì)結(jié)合, 在特定波長的激發(fā)下發(fā)出強(qiáng)烈的橙黃色或紅色熒光, 但在水溶劑中, 其熒光性完全淬滅。目前, 尼羅紅已被廣泛應(yīng)用于對哺乳動物細(xì)胞、浮游動物、酵母菌以及微藻等的油脂進(jìn)行定性觀察和原位檢測[13—16]。研究發(fā)現(xiàn), 激發(fā)波長和散射波長分別為450—500 nm和>528 nm時, 經(jīng)尼羅紅染色的微藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity, FI)與細(xì)胞內(nèi)油脂(中性脂)含量顯著相關(guān)[17—19]。因此, 可通過即時測定熒光強(qiáng)度的大小來原位檢測微藻的油脂含量, 從而了解其油脂積累規(guī)律并確定最佳培養(yǎng)條件和收獲周期。與傳統(tǒng)的油脂含量測定方法相比, 尼羅紅法操作簡單, 所需微藻生物量小, 并且允許同時處理大批量的樣品。但研究也表明, 并非所有微藻都可被尼羅紅染色, 所以該方法只能針對合適的藻種開展油脂含量的測定研究。

    經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期的培育和研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)室篩選的一株金藻sp.CCMM5001細(xì)胞內(nèi)含有豐富的油脂資源, 其總脂含量可高達(dá)藻細(xì)胞干重的40%, 且適合制備生物柴油的C14-C18系脂肪酸含量為總脂肪酸含量的80%以上, 表現(xiàn)出作為一種生產(chǎn)生物柴油候選藻種的優(yōu)良特性, 但其油脂積累的動態(tài)規(guī)律及具有最高油脂產(chǎn)率的最佳培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步研究。值得一提的是該金藻無細(xì)胞壁, 極易被染色材料著色, 但利用尼羅紅對其進(jìn)行染色所開展的油脂含量的測定研究還未見報(bào)道。

    本文擬通過尼羅紅染色法建立一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量微藻油脂含量的方法, 并利用該方法探討不同氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度培養(yǎng)條件下金藻的油脂動態(tài)積累過程, 從而確定其生產(chǎn)油脂的最佳培養(yǎng)條件, 為進(jìn)一步對金藻進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物柴油奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 微藻來源及其培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)藻株金藻sp.CCMM5001由中國科學(xué)院海洋研究所提供, 培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)液配方[20], 光照強(qiáng)度92.5 μmol/(m2·s), 光暗比16h︰8h, 溫度(25±1)℃。

    1.2 儀器與試劑

    多功能酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200)、倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE2000-U)、氣相色譜-質(zhì)譜儀(Agilent GC7890A-MS5975C)。尼羅紅(Nile Red)購自J & K Scientific公司, 以丙酮為溶劑配制成 0.1 g/L母液, 于–20℃避光保存。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    微藻的尼羅紅染色 用血球計(jì)數(shù)板法測定藻細(xì)胞密度, 取1 mL細(xì)胞密度約為1×106cells/mL的藻液于小試管中, 添加0.01 mL尼羅紅母液使其終濃度為1 mg/L, 振蕩混勻, 于20℃避光染色10min, 用倒置熒光顯微鏡(藍(lán)光激發(fā))觀察藻細(xì)胞內(nèi)被染色油脂; 取96孔板, 每孔加入200 μL染色藻液, 用多功能酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長為480 nm時藻液在580 nm處的熒光強(qiáng)度, 并扣除未染色藻液在該波長處的熒光強(qiáng)度即為凈熒光值, 染色處理組和空白對照組均設(shè)置3個平行, 重復(fù)測定3次。

    單細(xì)胞熒光值和油脂含量關(guān)系的建立 在1.1培養(yǎng)條件下于不同生長階段分別測定藻液熒光強(qiáng)度和細(xì)胞密度, 并離心收集藻體, 冷凍干燥至恒重, 取0.1 g干藻粉采用三氯甲烷-甲醇提取法測定總脂含量(%細(xì)胞干重)。將單細(xì)胞熒光強(qiáng)度和總脂含量進(jìn)行線性擬合獲得二者線性關(guān)系。

    不同培養(yǎng)條件下油脂動態(tài)積累的檢測 不同氮濃度(以硝酸鈉為氮源)、光照強(qiáng)度、溫度等培養(yǎng)條件列于表1中, 其他培養(yǎng)條件同1.1。將處于指數(shù)生長期的藻液按照10%的接種量分別接種到不同培養(yǎng)條件的f/2海水培養(yǎng)基中, 每隔一天測定藻細(xì)胞密度和熒光強(qiáng)度, 并由上述所得線性關(guān)系計(jì)算總脂含量。

    表1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001的不同培養(yǎng)條件

    油脂產(chǎn)率的計(jì)算與脂肪酸組成的分析 取100 mL藻液, 抽濾于事先稱重的0.45 μm濾膜上, 冷凍干燥后稱重, 并根據(jù)上述步驟中所得相應(yīng)的總脂含量進(jìn)行計(jì)算即可獲得油脂產(chǎn)率。將干藻粉用三氯甲烷-甲醇溶液進(jìn)行提取, 經(jīng)過皂化和甲酯化處理后用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行脂肪酸組成分析, 色譜柱型號為HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件: 載氣為氦氣, 流速為1 mL/min, 進(jìn)樣口溫度280℃, 傳輸線溫度為280℃; 升溫程序?yàn)? 初溫50℃, 保持2min, 以6℃/min升到300℃, 保持15min; 不分流進(jìn)樣, 進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件: 離子源為EI, 倍增器電壓1200V, 離子源溫度為230℃, 四級桿溫度150℃, Scan方式檢測。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行, 取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Mean±SD)。用OriginPro 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 微藻尼羅紅染色鏡檢結(jié)果與單細(xì)胞熒光值-總脂含量線性關(guān)系

    將染色后的藻液用藍(lán)光激發(fā)于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖1), 藻細(xì)胞整體呈紅色, 細(xì)胞內(nèi)被染色油脂體呈明亮的黃色。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn), 藻細(xì)胞內(nèi)油脂體的大小和數(shù)目隨藻液所處生長階段的不同而有所差異。處于對數(shù)生長期的藻細(xì)胞其油脂體形狀較小, 直徑約為0.5 μm, 且數(shù)目較少。進(jìn)入穩(wěn)定期后油脂體逐漸變大, 直徑可達(dá)1 μm左右, 數(shù)目亦有所增加。

    圖1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001經(jīng)尼羅紅染色后的熒光顯微鏡鏡檢圖

    由以上觀察結(jié)果可知, 金藻在不同的生長階段其油脂含量有所不同, 經(jīng)尼羅紅染色后的熒光強(qiáng)度也隨之發(fā)生變化。為確定總脂含量與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系, 用三氯甲烷-甲醇提取法測定不同生長階段微藻的總脂含量, 并將其與相應(yīng)的單細(xì)胞熒光值進(jìn)行線性擬合, 可獲得如圖2所示線性擬合圖(2= 0.9572), 油脂含量與單細(xì)胞熒光強(qiáng)度具有良好的線性相關(guān)性, 單細(xì)胞熒光值隨著油脂含量的增加而增大。

    2.2 在不同培養(yǎng)條件下微藻生長曲線與總脂動態(tài)積累

    實(shí)驗(yàn)測定了不同氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度培養(yǎng)條件下金藻的生長曲線以及不同生長階段尼羅紅染色的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度, 并根據(jù)2.1中所得線性關(guān)系, 獲得了微藻總脂的動態(tài)積累過程。

    在不同氮濃度培養(yǎng)條件下, 金藻的生長狀況和總脂動態(tài)積累過程均受顯著影響。當(dāng)?shù)獫舛取?323 μmol/L時, 藻細(xì)胞密度隨著氮濃度的增加而增大, 并在1323 μmol/L培養(yǎng)11d時獲得最大藻密度2.7×107cells/mL; 當(dāng)?shù)獫舛壤^續(xù)增加到1764 μmol/L時, 藻細(xì)胞密度大幅降低(圖3A)。微藻總脂主要在對數(shù)生長期后期以及穩(wěn)定期積累, 隨著氮濃度從 441 μmol/L增加到1764 μmol/L, 總脂含量逐漸降低, 在培養(yǎng)13d時882 μmol/L的氮濃度可獲得最高總脂含量51.2%; 另外, 不同氮濃度的總脂主要積累期隨氮濃度的增加而依次有所延后, 即隨著藻密度的增加, 氮逐漸被消耗到較低水平時總脂開始積累(圖3B)。

    圖2 單細(xì)胞熒光值與總脂含量的線性關(guān)系(R2 = 0.9572)

    光照強(qiáng)度對金藻的生長有較大影響, 但對其總脂的積累影響較小。當(dāng)光照強(qiáng)度過低[37 μmol/(m2·s)]或過高[148 μmol/(m2·s)]時均不利于微藻的生長, 但隨著藻密度的增加, 藻液透光度降低, 此時高光照強(qiáng)度下的藻密度迅速增大并可獲得最大藻密度2.6×107cells/mL (圖4A)。光照強(qiáng)度對總脂的含量影響較小, 高光照強(qiáng)度時的油脂含量略低于中、低光照強(qiáng)度時的油脂含量(圖4B)。

    溫度對金藻的生長狀況和總脂動態(tài)積累過程具有顯著影響。當(dāng)溫度過低(15℃)或過高(35℃)時, 微藻生長緩慢, 可獲得的最大藻細(xì)胞密度也遠(yuǎn)低于25℃培養(yǎng)條件下的藻密度2.4×107cells/mL (圖5A)。微藻總脂含量隨著溫度的升高逐漸降低, 當(dāng)溫度為15℃時總脂迅速積累, 并在培養(yǎng)7d時即可獲得最大的總脂含量50.8% (圖5B)。

    由微藻總脂的積累趨勢可以看出, 不同培養(yǎng)條件下穩(wěn)定期的總脂含量均比對數(shù)期時有所增加, 但并未像尼羅紅染色鏡檢時油滴的數(shù)目和大小所增加的那樣大幅提高, 這可能是因?yàn)樵寮?xì)胞內(nèi)所含總脂除了以油滴形態(tài)存在外, 還以溶解態(tài)以及與膜結(jié)合的形式等存在。

    圖3 不同氮濃度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

    2.3 微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化與結(jié)果檢測

    由2.2中培養(yǎng)結(jié)果可知, 當(dāng)?shù)獫舛葹?323 μmol/L時金藻生長最快, 收獲時藻密度最大, 但總脂含量并非最高; 培養(yǎng)初期以92.5 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度進(jìn)行培養(yǎng), 當(dāng)藻密度達(dá)到約1×107cells/mL時適度提高光照強(qiáng)度有利于收獲更高的藻生物量; 25℃培養(yǎng)時有利于微藻生長, 但總脂積累較緩慢, 15℃培養(yǎng)時總脂積累迅速且含量較高, 但生長緩慢, 所以可先于25℃下培養(yǎng)一段時間獲得一定生物量之后再于15℃下培養(yǎng)5—7d使其總脂得到積累。

    為盡可能收獲較高的生物量與總脂含量, 根據(jù)金藻在不同培養(yǎng)條件下的生長特征和總脂積累特點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩階段培養(yǎng)法對其進(jìn)行培養(yǎng)(表2)。

    對兩階段培養(yǎng)的金藻的藻密度和總脂含量進(jìn)行檢測(圖6), 將其與常規(guī)培養(yǎng)條件[氮濃度1323 μmol/L,光照強(qiáng)度92.5 μmol/(m2·s), 溫度25℃]下的金藻進(jìn)行比較, 可以看出: 由于溫度的降低, 第二階段微藻的生長略有減緩, 但最終所能收獲的最大細(xì)胞密度亦可高達(dá)2.5×107cells/mL; 在第二階段, 總脂迅速積累, 培養(yǎng)11d時總脂含量可高達(dá)63.3%, 遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)時所能達(dá)到的最大總脂含量44.2%。將兩階段培養(yǎng)法所能獲得的最大油脂產(chǎn)率和其他不同培養(yǎng)條件下所能獲得的最大油脂產(chǎn)率進(jìn)行對比(圖7), 可以看出: 當(dāng)?shù)獫舛葹?82 μmol/L時可獲得最高油脂產(chǎn)率, 氮濃度繼續(xù)增大時油脂產(chǎn)率反而降低; 油脂產(chǎn)率隨光照強(qiáng)度的增大而增大, 當(dāng)光照強(qiáng)度≥92.5 μmol/(m2·s)時油脂產(chǎn)率不再明顯增大; 當(dāng)溫度為25℃時可獲得最高油脂產(chǎn)率, 溫度過高或過低都會降低油脂產(chǎn)率; 在未進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化前, 金藻的油脂產(chǎn)率普遍在15 mg/(L·d)左右, 經(jīng)過優(yōu)化并采用兩階段培養(yǎng)法后其油脂產(chǎn)率大幅提高45%以上, 可高達(dá)22 mg/(L·d)。為確定經(jīng)條件優(yōu)化后的金藻的油脂成分是否仍具有生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良特性, 實(shí)驗(yàn)利用GC-MS進(jìn)一步分析研究了其脂肪酸組成。結(jié)果顯示(表3), 相比常規(guī)培養(yǎng)時的脂肪酸組成, 優(yōu)化的兩階段培養(yǎng)法所含的C14:0、C16:0等飽和脂肪酸含量有所降低, C18:1等不飽和脂肪酸含量有所增加, C14-C18系脂肪酸含量并無明顯變化, 均可高達(dá)總脂肪酸的88%以上, 保持了其生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良特性。另外, 不飽和脂肪酸總含量的顯著提高也增加了金藻對保健品開發(fā)利用的附加產(chǎn)值。

    圖4 不同光照強(qiáng)度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

    圖5 不同溫度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

    圖6 普通培養(yǎng)法和兩階段培養(yǎng)法對金藻Isochrysis sp.CCMM5001生長曲線和總脂積累的影響對比

    表2 金藻Isochrysis sp.CCMM5001兩階段培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件

    3 討論

    3.1 微藻的尼羅紅熒光染色

    本實(shí)驗(yàn)利用尼羅紅對金藻進(jìn)行染色并測定其熒光強(qiáng)度, 發(fā)現(xiàn)該熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞內(nèi)總脂含量呈線性關(guān)系, 這與Alonzo和Mayzaud[13]對浮游動物的脂類進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度與脂類濃度呈線性關(guān)系的結(jié)果類似。尼羅紅染色受諸多因素影響, 如尼羅紅濃度、染色時間以及藻細(xì)胞密度等[17]。Chen,.的研究結(jié)果表明, 尼羅紅的終濃度在0.25—2 mg/L之間時, 染色效果較佳, 染色時間則以10min最佳[21]。本研究在之前進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)藻株金藻的藻細(xì)胞密度在一定范圍內(nèi)(0—1.075×107cells/mL)與其熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系(2=0.9912), 當(dāng)藻密度大于1.075×107cells/mL時熒光強(qiáng)度逐漸降低(圖8)。并不是所有微藻都適用于尼羅紅染色, 因?yàn)榇蠖鄶?shù)微藻細(xì)胞具有細(xì)胞壁, 限制了尼羅紅進(jìn)入藻細(xì)胞與脂類結(jié)合產(chǎn)生熒光, 如Chen,.對勞氏角毛藻()、赫氏圓石藻()、寇氏隱甲藻()、微綠球藻(sp.)以及小球藻(sp.)等藻類進(jìn)行尼羅紅染色時發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞壁的藻細(xì)胞很難被有效染色, 而在經(jīng)過液氮研磨、高溫、甲醇、DMSO、丙酮、乙醇以及異丙醇等各種處理之后藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng), 其中以25%的DMSO處理效果最好[21]。本實(shí)驗(yàn)所用的金藻不具有細(xì)胞壁, 因此可以直接被尼羅紅染色。

    圖7 不同培養(yǎng)條件下金藻Isochrysis sp.CCMM5001的油脂產(chǎn)率

    表3 普通培養(yǎng)法和兩階段培養(yǎng)法對金藻Isochrysis sp.CCMM5001主要脂肪酸組成的影響對比

    圖8 金藻Isochrysis sp.CCMM5001藻細(xì)胞密度對熒光強(qiáng)度的影響

    以往尼羅紅對微藻染色的研究只限于通過熒光強(qiáng)度的大小來定性或粗略地描述脂類的相對含量[17—19, 22], 而未見對其絕對含量進(jìn)行研究的報(bào)道。本論文在建立單細(xì)胞熒光值與總脂含量線性關(guān)系的基礎(chǔ)上, 通過簡單的計(jì)算即可獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下不同生長階段時總脂的絕對含量, 與傳統(tǒng)的測定絕對含量的化學(xué)提取法相比, 該方法操作簡單、所需樣品量少(化學(xué)提取法需0.2 g干藻粉), 并可即時監(jiān)測總脂的動態(tài)積累過程, 另外, 多功能酶標(biāo)儀和96孔板在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用也使得同時處理大批量的樣品變得快速可行。

    3.2 微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    本實(shí)驗(yàn)研究了不同氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度培養(yǎng)條件下金藻的生長狀況和總脂動態(tài)積累過程, 并優(yōu)化了培養(yǎng)條件使其具有最高的油脂產(chǎn)率。研究結(jié)果表明, 金藻的細(xì)胞密度在一定的氮濃度范圍內(nèi)隨氮濃度的增加而提高, 這與王學(xué)魁等和尹翠玲等的研究結(jié)果一致[23, 24]; 當(dāng)?shù)獫舛壤^續(xù)增加時細(xì)胞密度反而降低, 這可能是由于氮的增加改變了培養(yǎng)液的N/P比, 從而限制了藻細(xì)胞的生長。光照強(qiáng)度對微藻生長的影響表現(xiàn)為光照過強(qiáng)或過弱都將限制微藻的生長, 但隨著藻密度的增加藻液透光性降低, 適當(dāng)增大光照強(qiáng)度更有利于微藻生長。溫度是另一個影響微藻生長的重要因素, 一般而言, 低溫時微藻生命活動不活躍, 生長遲緩, 溫度較高時則生長旺盛, 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳生長溫度為25℃。

    不同培養(yǎng)條件對金藻總脂的積累也有明顯的影響。王學(xué)魁等認(rèn)為金藻的總脂含量隨氮濃度的增加而提高[23], 但本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相反, 這可能是氮缺乏導(dǎo)致其他代謝路徑的改變, 從而促進(jìn)了細(xì)胞脂質(zhì)的合成[25]。孫利芹和楊林濤報(bào)道稱金藻在高光照條件下總脂含量會相對提高[26], 但本研究結(jié)果顯示高光照強(qiáng)度[148 μmol/(m2·s)]條件下反而不利用總脂的積累, 這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)后期高光照強(qiáng)度條件下的微藻仍處于活躍分裂狀態(tài), 蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)的含量相對較高, 而作為儲能物質(zhì)的脂類含量則相對較低。溫度對微藻總脂積累的影響表現(xiàn)為: 低溫有利于總脂尤其是不飽和脂肪酸的積累, 而高溫時總脂含量則相對較低[27—29], 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳總脂積累溫度為15℃。

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 微藻最佳生長條件與最佳總脂積累條件并不相符。為了獲取較高的油脂產(chǎn)出, 本實(shí)驗(yàn)首次采用兩階段培養(yǎng)法對金藻sp.CCMM5001進(jìn)行培養(yǎng), 即先在最適生長條件下培養(yǎng)一段時間以獲得較大生物量然后調(diào)節(jié)至最適總脂積累條件以獲得較高的總脂含量, 從而大幅提高了其油脂產(chǎn)率。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)利用尼羅紅染色法研究發(fā)現(xiàn)了金藻sp.CCMM5001的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度與其總脂含量具有良好的線性關(guān)系, 并通過該方法探索了不同培養(yǎng)條件對金藻生長和總脂積累的影響。結(jié)果表明, 最適金藻sp.CCMM5001生長和總脂積累的氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度分別為: 1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃和441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃。采用兩階段培養(yǎng)法后總脂含量和油脂產(chǎn)率都大幅提高, 可分別高達(dá)63.3%和22 mg/(L·d)。

    [1] Felizardo P, Correia M J N, Raposo I,.Production of biodiesel from waste frying oils [J]., 2006, 26(5): 487—494

    [2] Kulkarni M G, Dalai A K. Waste cooking oil-an economical source for biodiesel: A review [J]., 2006, 45(9): 2901—2913

    [3] Song D H, Fu J J, Shi D J. Exploitation of oil-bearing microalgae for biodiesel [J]., 2008, 24(3): 341—348

    [4] Schenk P M, Thomas-Hall S R, Stephens E,. Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production [J]., 2008, 1(1): 20—43

    [5] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]., 2007, 25(3): 294—306

    [6] Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E,.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances [J]., 2008, 54(4): 621—639

    [7] Miao X L, Wu Q Y. Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil [J]., 2006, 97(6): 841—846

    [8] Hossain A B M S, Salleh A, Boyce A N,. Biodiesel fuel production from algae as renewable energy [J]., 2008, 4(3): 250—254

    [9] Liu J, Huang J C, Fan K W,. Production potential ofas a feedstock for biodiesel [J]., 2010, 101(22): 8658—8663

    [10] Razon L F, Tan R R. Net energy analysis of the production of biodiesel and biogas from the microalgae:and[J]., 2011, 88(10): 3507—3514

    [11] Tang H Y, Abunasser N, Garcia M E D,. Potential of microalgae oil fromas a feedstock for biodiesel [J]., 2011, 88(10): 3324—3330

    [12] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method for total lipid extraction and purification [J]., 1959, 37(8): 911—917

    [13] Alonzo F, Mayzaud P. Spectrofluorometric quantification of neutral and polar lipids in zooplankton using Nile red [J]., 1999, 67(3—4): 289—301

    [14] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence [J]., 2004, 56(3): 331—338

    [15] Genicot G, Leroy J L M R, Soom A V,. The use of a ?uorescent dye, Nile red, to evaluate the lipid content of single mammalian oocytes [J]., 2005, 63(4): 1181—1194

    [16] Elsey D, Jameson D, Raleigh B,. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids [J]., 2007, 68(3): 639—642

    [17] Cooksey K E, Guckert J B, Williams S A,. Fluorometric-determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red [J].,1987, 6(6): 333—345

    [18] Lee S J, Yoon B D, Oh H M. Rapid method for the determination of lipid from the green alga[J]., 1998, 12(7): 553—556

    [19] de la Jara A, Mendoza H, Martel A,. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate,[J]., 2003,15(5): 433—438

    [20] Borowitzka M A, Borowitzka L J. Micro-algal Biotechnology [M]. Cambridge: Cambridge University Press.1988, 457—465

    [21] Chen W, Zhang C W, Song L R,. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae [J]., 2009, 77(1): 41—47

    [22] Wang J N, Yan X J, Zhou C X,. Screening of oil-producing microalgae and detecting dynamics of neutral lipid accumulation [J]., 2010, 26(6): 472—480 [王金娜, 嚴(yán)小軍, 周成旭, 等. 產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測. 生物物理學(xué)報(bào), 2010, 26(6): 472—480]

    [23] Wang X K, Wang Y S, Sun Z N,. Effects of NaNO3concentration on growth and fatty acids composition of[J]., 2006, 16(1): 61—63 [王學(xué)魁, 王云生, 孫之南, 等. NaNO3濃度對球等鞭金藻生長及所含脂肪酸的影響. 生物技術(shù), 2006, 16(1): 61—63]

    [24] Yin C L, Liang Y, Zhang Q F. Effects of nitrogen concentrations on chlorophyll fluorescence and growth in alga3011 and 8701 [J]., 2008, 27(1): 27—31 [尹翠玲, 梁英, 張秋豐. 氮濃度對球等鞭金藻3011和8701葉綠素?zé)晒馓匦约吧L的影響. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(1): 27—31]

    [25] Huang W C, Hu H H. Study on the salinity tolerance and oil accumulation in[J]., 2013, 37(2): 383—387 [黃偉超, 胡晗華. 微擬球藻屬對鹽度的耐受及其產(chǎn)油特性分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(2): 383—387]

    [26] Sun L Q, Yang L T. The effect of environment factors on composition and content of fatty acids ofcell [J]., 2006, 27(5): 11—13 [孫利芹, 楊林濤. 環(huán)境因子對球等鞭金藻脂肪酸含量和組成的影響. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(5): 11—13]

    [27] Stadler T. Algal Biotechnology [M]. London: Elsevier Applied Science. 1988, 303—314

    [28] de Oliveira M A C L, Monteiro M P C, Robbs P G,. Growth and chemical composition ofandbiomass at different temperatures [J]., 1999, 7(4): 261—275

    [29] Jing H M, Zhai J, Zhang Y Y,. Influences of temperature on the growth and fatty acid composition in marine microalgae [J]., 2005, 26(6): 9—12 [蔣漢明, 翟靜, 張媛英, 等. 溫度對海洋微藻生長及脂肪酸組成的影響. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(6): 9—12]

    Research on the dynamic accumulation of lipids insp. CCMM5001 based on the lipid analysis by Nile Red method

    Zhou Wen-jun1, Zheng Li1, Han Xiao-tian2, Zheng Ming-gang1, Zhang Kui-ying1, Gao Wei1and Cui Zhi-song1

    (1. Research Center for Marine Ecology, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China; 2. Key Laboratory of Marine Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266060, China)

    Some species of microalgae are considered as an ideal resource for biodiesel production because they contain high level of lipids. The traditional method to quantify the lipids level includes the solvent extraction and gravimetric determination based on a chloroform-methanol-water system. This method has the disadvantage of being time consuming and inefficient. Here we used Nile Red, a lipid-soluble fluorescent probe, to establish a novel method to determinate the level of lipids in microalgae rapidly and accurately. We applied the Nile Red method to investigate the dynamic accumulation of lipids insp.CCMM5001 under different culture conditions. The results showed that there was a linear correlation between the lipids level and the cellular fluorescence of stained microalgal cells, therefore the former can be accurately indicated by the latter. Low nitrogen concentrations and low temperatures were suitable for accumulating of lipids. The level of lipids was reduced if the illumination intensity was overly high or low. On one hand the optimal conditions for the growth were: N concentration at 1323 μmol/L, illumination intensity at 148.0 μmol/(m2·s), and the temperature at 25℃. On the other hand for the maximal accumulation of the lipids, the optimal values of the parameters above were 441 μmol/L, 92.5 μmol/(m2·s), and 15℃ respectively. The culture condition was optimized and a two-stage cultivation was carried out to increase both the level and the production rate of lipids, the former reaching a high concentration of 63.3% and the latter reaching 22 mg/(L·d).

    sp; Nile red; Total lipicls; Fluoresence intensity; Growth Curve

    2013-01-21;

    2013-12-16

    海洋公益性行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目(200805039); 海洋可再生能源專項(xiàng)(GHME2001SW02); 國家自然科學(xué)基金(41076108, 41106148, 30870247); 山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2011GHY11533)資助

    周文俊(1987—), 男, 甘肅武威人; 碩士; 主要從事海洋微藻生物燃料的研究。E-mail: 86zwj@163.com

    鄭立, 副研究員, 博士; E-mail:zhengli@fio.org.cn

    Q949.2; Q-33

    A

    1000-3207(2014)02-0312-08

    10.7541/2014.45

    猜你喜歡
    總脂微藻油脂
    《中國油脂》征訂啟事
    代食品運(yùn)動中微藻的科研與生產(chǎn)
    微擬球藻總脂提取方法的研究
    A taste of Peking duck
    溫、光、鹽對硅藻STR01生長、總脂、脂肪酸的影響
    中國油脂
    歡迎訂閱2019年《中國油脂》
    絮凝法采收生物燃料微藻的研究進(jìn)展
    磷酸香草醛法測定不同培養(yǎng)條件下四尾柵藻(Scenedesmusobliquus)總脂含量
    中國油脂(2017年7期)2017-09-16 04:28:48
    二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂、EPA及PUFA含量的影響
    中國油脂(2017年2期)2017-05-15 13:28:39
    身体一侧抽搐| 男女那种视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 亚洲国产最新在线播放| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 草草在线视频免费看| 天堂中文最新版在线下载 | 熟女电影av网| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲人成网站高清观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美3d第一页| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久九九精品影院| 久久久久久国产a免费观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 女人久久www免费人成看片| 男人添女人高潮全过程视频| 国产69精品久久久久777片| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产男人的电影天堂91| 国产精品福利在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品一区二区在线观看99| 天天一区二区日本电影三级| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩电影二区| 成人一区二区视频在线观看| 精品一区二区三卡| av黄色大香蕉| 香蕉精品网在线| a级毛色黄片| 水蜜桃什么品种好| videossex国产| 嫩草影院入口| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩av免费高清视频| xxx大片免费视频| 免费av毛片视频| 国产一区二区在线观看日韩| 只有这里有精品99| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 黄色配什么色好看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 97超碰精品成人国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产成人精品一,二区| 亚洲av不卡在线观看| 久热久热在线精品观看| 国产 精品1| 下体分泌物呈黄色| 97热精品久久久久久| av国产久精品久网站免费入址| 免费观看性生交大片5| av在线播放精品| 好男人视频免费观看在线| 青青草视频在线视频观看| 777米奇影视久久| 美女主播在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热国产这里只有精品6| 精品国产三级普通话版| 国产亚洲91精品色在线| 免费电影在线观看免费观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久久久久久国产电影| 中文字幕免费在线视频6| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久精品国产亚洲网站| 51国产日韩欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美精品专区久久| 久久久午夜欧美精品| 国产精品一区二区性色av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜福利高清视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 街头女战士在线观看网站| 国产精品成人在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 蜜臀久久99精品久久宅男| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 男女边摸边吃奶| 一区二区三区精品91| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av国产免费在线观看| 99久久精品热视频| 精品午夜福利在线看| 有码 亚洲区| 2018国产大陆天天弄谢| 九色成人免费人妻av| 欧美国产精品一级二级三级 | 伊人久久国产一区二区| 在线观看人妻少妇| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本熟妇午夜| 国产午夜福利久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 高清av免费在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品一区www在线观看| 99热全是精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜精品一区二区三区免费看| 中国美白少妇内射xxxbb| 伊人久久精品亚洲午夜| h日本视频在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费福利视频在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 男人舔奶头视频| 精品久久久久久久久亚洲| 爱豆传媒免费全集在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲欧洲日产国产| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久九九精品影院| 国产美女午夜福利| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产乱人偷精品视频| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品不卡视频一区二区| 国产黄片美女视频| 国产黄片美女视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲熟女精品中文字幕| 99久久中文字幕三级久久日本| 一级a做视频免费观看| 黄色怎么调成土黄色| videossex国产| 亚洲人与动物交配视频| 超碰97精品在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 午夜免费观看性视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 大话2 男鬼变身卡| 制服丝袜香蕉在线| 久久久午夜欧美精品| 街头女战士在线观看网站| 日韩制服骚丝袜av| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品久久久久久av不卡| 久热久热在线精品观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 熟女av电影| 成年女人看的毛片在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩伦理黄色片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看国产h片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线 av 中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 又爽又黄无遮挡网站| 又爽又黄a免费视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人精品福利久久| av.在线天堂| 午夜福利高清视频| 日韩伦理黄色片| 国产精品三级大全| av国产精品久久久久影院| 国精品久久久久久国模美| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产久久久一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 岛国毛片在线播放| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 99热网站在线观看| 男女国产视频网站| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲高清免费不卡视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇熟女欧美另类| 久久久a久久爽久久v久久| 人妻一区二区av| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品视频女| 亚洲精品成人久久久久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 韩国av在线不卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久国产网址| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品成人在线| xxx大片免费视频| av在线播放精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜精品一区二区三区免费看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av欧美aⅴ国产| 色吧在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 欧美极品一区二区三区四区| 精品人妻一区二区三区麻豆| a级一级毛片免费在线观看| 在线a可以看的网站| 国产高潮美女av| 久久99热这里只有精品18| 欧美国产精品一级二级三级 | 免费大片黄手机在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久久久午夜电影| 性插视频无遮挡在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品色激情综合| 97热精品久久久久久| 亚洲久久久久久中文字幕| 特级一级黄色大片| 午夜福利在线在线| 丰满乱子伦码专区| 日本欧美国产在线视频| 又爽又黄a免费视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一级毛片电影观看| 黄色视频在线播放观看不卡| tube8黄色片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 777米奇影视久久| 精品久久久精品久久久| 午夜精品国产一区二区电影 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品一区二区免费观看| 男女国产视频网站| 简卡轻食公司| 高清在线视频一区二区三区| 黄色一级大片看看| 日本色播在线视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 老司机影院成人| 久久精品国产a三级三级三级| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级a做视频免费观看| 亚洲最大成人手机在线| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕av成人在线电影| 国产男女内射视频| 久久久久网色| 日本一本二区三区精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜日本视频在线| 男女边吃奶边做爰视频| 热99国产精品久久久久久7| 欧美极品一区二区三区四区| 尾随美女入室| 免费高清在线观看视频在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人一区二区视频在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 大码成人一级视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说 | 一级毛片久久久久久久久女| 秋霞在线观看毛片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美成人午夜免费资源| 少妇人妻久久综合中文| 国产成人精品久久久久久| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 秋霞伦理黄片| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av免费在线观看| 最近手机中文字幕大全| 在线观看人妻少妇| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 久久影院123| 色视频www国产| 内射极品少妇av片p| av播播在线观看一区| 91久久精品国产一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 久久久欧美国产精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品综合一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 青春草视频在线免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 一区二区三区免费毛片| 直男gayav资源| 日本免费在线观看一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 好男人视频免费观看在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲四区av| 久久久久久久国产电影| 看十八女毛片水多多多| 精品久久久久久电影网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品一区二区在线观看99| 99久久精品热视频| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本免费在线观看一区| 黑人高潮一二区| 亚洲高清免费不卡视频| 直男gayav资源| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一级毛片 在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产高潮美女av| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产黄片视频在线免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 免费大片黄手机在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 直男gayav资源| 网址你懂的国产日韩在线| av免费在线看不卡| 五月天丁香电影| 人妻 亚洲 视频| 日韩欧美精品v在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲成人av在线免费| 国产成年人精品一区二区| 简卡轻食公司| 人妻一区二区av| 亚洲国产av新网站| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 激情五月婷婷亚洲| 美女高潮的动态| 久久久久国产网址| 久久久久久伊人网av| 国产片特级美女逼逼视频| 色5月婷婷丁香| 国产精品av视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美一区二区亚洲| av线在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 久久久久久国产a免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 成人免费观看视频高清| 777米奇影视久久| 一级黄片播放器| www.av在线官网国产| 亚洲国产精品专区欧美| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲在久久综合| 最新中文字幕久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品无大码| 97热精品久久久久久| 久久这里有精品视频免费| 免费看a级黄色片| 日韩制服骚丝袜av| 久久韩国三级中文字幕| 国产综合懂色| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 欧美成人a在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品国产av成人精品| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲熟女精品中文字幕| 大香蕉97超碰在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人黄色视频免费在线看| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 午夜福利视频精品| 可以在线观看毛片的网站| 欧美日韩视频精品一区| 最后的刺客免费高清国语| 人妻 亚洲 视频| 成人国产麻豆网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 看十八女毛片水多多多| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美极品一区二区三区四区| 日本-黄色视频高清免费观看| 色视频在线一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 高清午夜精品一区二区三区| 日韩强制内射视频| 亚洲人成网站在线播| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产综合精华液| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产高潮美女av| 国产高清有码在线观看视频| 精品一区二区三卡| 精品久久久久久久久亚洲| 日本欧美国产在线视频| 内射极品少妇av片p| 丰满人妻一区二区三区视频av| 97精品久久久久久久久久精品| 色综合色国产| av一本久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 22中文网久久字幕| 嫩草影院新地址| 一级爰片在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久九九精品影院| 熟女av电影| 精品午夜福利在线看| 极品教师在线视频| 国产高潮美女av| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久久性生活片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 在线观看国产h片| 亚洲图色成人| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚州av有码| 女人被狂操c到高潮| 神马国产精品三级电影在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产日韩欧美在线精品| 久久99蜜桃精品久久| 伦理电影大哥的女人| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品一二三区在线看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费大片18禁| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品国产三级普通话版| 久久精品夜色国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 中国国产av一级| 男女无遮挡免费网站观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久久久精品性色| 色网站视频免费| 国产综合精华液| 午夜免费观看性视频| 亚洲国产精品专区欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲综合色惰| 免费看日本二区| av网站免费在线观看视频| 好男人视频免费观看在线| 尾随美女入室| 一级片'在线观看视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲最大成人中文| 久久精品综合一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 少妇丰满av| 嘟嘟电影网在线观看| 22中文网久久字幕| 99久久精品国产国产毛片| 国产成人freesex在线| 久久久精品欧美日韩精品| 在线观看人妻少妇| 美女主播在线视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 永久网站在线| 欧美成人a在线观看| 国产成人一区二区在线| 夫妻午夜视频| 在线观看一区二区三区激情| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 韩国av在线不卡| 日韩人妻高清精品专区| 在线 av 中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 在线观看免费高清a一片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品精品国产色婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 日韩伦理黄色片| 免费看日本二区| av免费观看日本| 久久99热6这里只有精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久影院123| 国产午夜精品一二区理论片| 一级a做视频免费观看| 精品一区二区三卡| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 高清毛片免费看| 五月伊人婷婷丁香| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩av在线免费看完整版不卡| 在线免费十八禁| 欧美性感艳星| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜激情久久久久久久| 老女人水多毛片| 亚洲av.av天堂| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美 日韩 精品 国产| 精品人妻视频免费看| 久久久久网色| 成年女人看的毛片在线观看| 一本久久精品| 国产高清不卡午夜福利| 好男人视频免费观看在线| h日本视频在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 人妻一区二区av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人妻 亚洲 视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久亚洲国产成人精品v| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美日本视频| 深爱激情五月婷婷| 伦精品一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| av在线亚洲专区| 亚洲av一区综合| 中文资源天堂在线| 国产综合精华液| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 岛国毛片在线播放| 国产免费视频播放在线视频| www.av在线官网国产| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品一二三| 国产高清国产精品国产三级 | 欧美 日韩 精品 国产| 久久久午夜欧美精品| 免费黄色在线免费观看| 日日啪夜夜撸| 日本黄色片子视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品无大码| 国产精品久久久久久久久免| 深夜a级毛片| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产久久久一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜激情久久久久久久| 成人综合一区亚洲| 久久久精品94久久精品| 日韩成人伦理影院| 天美传媒精品一区二区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 大片免费播放器 马上看| 少妇高潮的动态图|