嗜熱四膜蟲兩類不同金屬硫蛋白的功能補(bǔ)償分析

盧劍功 許 靜 張鵬幸 王 偉

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嗜熱四膜蟲兩類不同金屬硫蛋白的功能補(bǔ)償分析

盧劍功 許 靜 張鵬幸 王 偉

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所, 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030006)

為了分析嗜熱四膜蟲兩類金屬硫蛋白之間的關(guān)系, 研究分別構(gòu)建了13和24的基因敲除載體, 通過同源重組獲得敲除大核13和24的兩種嗜熱四膜蟲突變體細(xì)胞株△13和△24。兩種突變體細(xì)胞株暴露在Cd2+、Cu2+和H2O2的生長表現(xiàn)出顯著不同, △13突變體細(xì)胞對Cd2+的耐受性顯著下降, 而△24突變體細(xì)胞對Cu2+和H2O2的耐受性均顯著下降。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同突變體中其他基因的表達(dá)變化, 在△24突變體細(xì)胞株中,5的表達(dá)水平下調(diào), 在500 μmol/L Cu2+處理后, △24突變體細(xì)胞中1、3和5表達(dá)相對野生型分別上調(diào)6.1、9.5和8.5倍。在△13突變體細(xì)胞中,2、4和5的表達(dá)水平下調(diào), 當(dāng)5 μmol/L Cd2+處理后, △13突變體細(xì)胞株5表達(dá)水平相對野生型上調(diào)2.9倍, 而2和4表達(dá)水平相對野生型分別下降了4.9倍和2.5倍。結(jié)果表明嗜熱四膜蟲中的金屬硫蛋白MTT1、MTT3和MTT5主要參與細(xì)胞的重金屬解毒功能; 而MTT2和MTT4主要參與細(xì)胞內(nèi)正常的新陳代謝功能, 不同的金屬硫蛋白基因之間的表達(dá)存在相互調(diào)控和功能補(bǔ)償。

嗜熱四膜蟲; 金屬硫蛋白; 基因敲除; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

金屬硫蛋白MT(Metallothionein)是一類低分子量(6—7 kD)、富含半胱氨酸并能夠螯合金屬離子的蛋白[1]。MT可以通過螯合重金屬離子(Cd、Hg等)保護(hù)機(jī)體, 解除毒害[2], 同時(shí)參與調(diào)節(jié)體內(nèi)必需金屬元素(Cu、Zn等)的正常新陳代謝[3], 金屬硫蛋白還具有清除體內(nèi)自由基的功能[4]。當(dāng)MT無金屬離子結(jié)合時(shí), 其高級結(jié)構(gòu)呈無序狀態(tài), 而當(dāng)有金屬離子被其結(jié)合后就會折疊為有序的結(jié)構(gòu)[5]。MT普遍存在于人、動(dòng)植物和微生物等不同的生物體中, 同一種生物體中含有不同的異構(gòu)體[6]。動(dòng)物的s基因?qū)俣嗷蚣易? 具有基本相似的結(jié)構(gòu)[7]。哺乳動(dòng)物中主要的金屬硫蛋白亞型為MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ, 它們分布于體內(nèi)不同器官, 能被多種金屬所誘導(dǎo), 行使不同功能[5]。

金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)在高等真核生物中存在較高的保守性, 但在原生動(dòng)物細(xì)胞中, 金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)卻存在較大的差異, 目前對原生動(dòng)物金屬硫蛋白的研究主要集中在四膜蟲和草履蟲中。嗜熱四膜蟲()是一種單細(xì)胞真核模式生物, 細(xì)胞無細(xì)胞壁, 對于外源環(huán)境污染物脅迫敏感, 具有快速的細(xì)胞響應(yīng)機(jī)制, 因此被認(rèn)為是毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究良好的模式生物之一[8—10]。嗜熱四膜蟲中已被鑒定的金屬硫蛋白有5種(MTT1、MTT2、MTT3、MTT4、MTT5), 其中MTT1、MTT3和MTT5屬于7a亞家族(Cd-MT), MTT2和MTT4屬于7b亞家族(Cu-MT)[11]。兩類金屬硫蛋白基因在正常的生長條件和對外源的應(yīng)激條件下均表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。盡管對兩類金屬硫蛋白的誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究, 但對兩類金屬硫蛋白在體內(nèi)的相互關(guān)系及功能補(bǔ)償機(jī)制仍不清楚。

本研究通過基因敲除的方法分別獲得敲除13和24的嗜熱四膜蟲突變體細(xì)胞株, 檢測了兩種突變體細(xì)胞株暴露在Cd2+、Cu2+和H2O2脅迫下的耐受性, 分析兩類金屬硫蛋白在嗜熱四膜蟲體內(nèi)的相互補(bǔ)償作用, 結(jié)果表明兩類金屬硫蛋白存在相互調(diào)節(jié)和功能補(bǔ)償。

1 材料與方法

1.1 嗜熱四膜蟲的培養(yǎng)

嗜熱四膜蟲B2086株由美國康奈爾大學(xué)Peter J. Bruns教授惠贈(zèng), pNeo4由羅徹斯特大學(xué)Martin A. Gorovsky教授惠贈(zèng)。嗜熱四膜蟲在SPP培養(yǎng)基(1% proteose peptone、0.2% glucose、0.1% yeast extract和0.003% EDTA ferric sodium salt)中30℃培養(yǎng)[12]。

1.2 敲除載體pN-MTT1-3和pN-MTT2-4的構(gòu)建

從四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ciliate.org)中分析1、、和基因序列, 設(shè)計(jì)特異引物, 以嗜熱四膜蟲大核基因組為模板, 引物MTT3-3′-F和MTT3-3′-R擴(kuò)增3基因的3側(cè)翼序列, 長度713 bp。該片段與pMD18-T載體連接, 獲得pMD18-T-3-3′重組質(zhì)粒。pMD18-T-3-3′和載體pNeo4分別用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后獲得的目的片段連接, 得到重組構(gòu)建體pN-1-3。

以嗜熱四膜蟲大核基因組為模板, 引物MTT2- 5′-F和MTT2-5′-R擴(kuò)增2基因的5′側(cè)翼序列, 長度915 bp; 以MTT4-3′-F和MTT4-3′-R擴(kuò)增4基因的3′側(cè)翼序列, 長度708 bp。獲得的目的片段分別與pMD18-T載體連接, 獲得pMD18-T-2-5′和pMD18-T-4-3′ 重組質(zhì)粒。pMD18-T-2-5′和載體pNeo4分別用Ⅰ和Ⅰ雙酶切, 目的片段連接獲得p2-5′-Neo4, 然后p2-5′-Neo4和pMD18-T-4-3′分別用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后獲得的目的片段連接, 得到重組構(gòu)建體pN-2-4。

1.3 嗜熱四膜蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

將敲除載體pN-1-3和pN-2-4分別用Ⅰ和Ⅰ雙酶切使其線性化?；驑屴Z擊法[13]將敲除載體轉(zhuǎn)化入嗜熱四膜蟲體中進(jìn)行基因同源重組。對轉(zhuǎn)化后的嗜熱四膜蟲逐步提高SPP中巴龍霉素(Paromomycin)的濃度, 通過細(xì)胞表型分配進(jìn)行篩選[14]。根據(jù)嗜熱四膜蟲1基因啟動(dòng)子的上游序列和3側(cè)翼序列的下游序列設(shè)計(jì)一對引物△13-F和△13-R, 通過PCR擴(kuò)增篩選和鑒定13的敲除細(xì)胞株。根據(jù)嗜熱四膜蟲2基因5′側(cè)翼上游序列和4序列設(shè)計(jì)一對引物△24-1-F和△24-1-R; 根據(jù)4序列和4基因3′側(cè)翼下游序列設(shè)計(jì)另一對引物△24-2-F和△24-2-R, PCR擴(kuò)增證實(shí)4的重組位點(diǎn)正確。

分別提取△13和△24突變體細(xì)胞中的總RNA, 分光光度計(jì)檢測所提總RNA的260/280在1.8—2.0。以總RNA為模板, 使用PrimeScript?RT Master Mix Kit (TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。qRT-PCR(ABI StepOnePlus)分析△13和△24中s的轉(zhuǎn)錄水平。內(nèi)參17S rRNA以及1、2、3和4的引物見表1。采用相對CT法對qRT-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[15, 16]。

1.4 △MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4細(xì)胞株在Cd2+、Cu2+和H2O2脅迫下的生長比較

30℃無菌培養(yǎng)野生型B2086、△13和△24細(xì)胞至平臺期, 將三株細(xì)胞分別轉(zhuǎn)至新的SPP培養(yǎng)基中, 每一組含三個(gè)平行, 使其初始濃度同為1×104cell/mL, 用于Cd2+、Cu2+和H2O2的濃度梯度處理實(shí)驗(yàn)。Cd2+處理終濃度為0、2.5、5、10、20、30、45、60 μmol/L; Cu2+處理終濃度為0、50、200、350、500、650、1000、1500 μmol/L; H2O2處理終濃度為0、100、200、350、500、650、800、1000 μmol/L。24h后, 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.5 四膜蟲突變體細(xì)胞中MTT1、MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的表達(dá)分析

分別提取不同細(xì)胞的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA。以野生型四膜蟲細(xì)胞為對照, 對△13和△24細(xì)胞株中保留的其他基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。內(nèi)參17S rRNA以及1-5的引物見表1, 每個(gè)樣本做3個(gè)平行, 結(jié)果通過儀器自帶的StepOne Software讀取及采用相對CT法處理分析。統(tǒng)計(jì)方法采用檢驗(yàn),0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜熱四膜蟲MTT家族基因的序列分析

從嗜熱四膜蟲大核基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. ciliate.org)分析發(fā)現(xiàn), 在嗜熱四膜蟲大核基因組上,1和3串聯(lián)排列, 兩者之間1708 bp,1和3基因編碼序列全長均為489 bp, 其預(yù)測編碼氨基酸序列一致性74.69%。2和4串聯(lián)排列, 兩者之間1255 bp,2和4基因編碼序列全長均為327 bp, 其預(yù)測編碼氨基酸序列一致性98.15%。5編碼序列全長300 bp, 獨(dú)立的位于不同的染色體上。嗜熱四膜蟲全基因microarray表達(dá)譜(http://tfgd.ihb.ac.cn)分析發(fā)現(xiàn),1和3具有相似的表達(dá)模式2和4具有相似的表達(dá)模式[9], 因此1和32和4可能分別是進(jìn)化中同一基因復(fù)制的產(chǎn)物, 并執(zhí)行相似的功能。為了分析兩類不同金屬硫蛋白的功能, 在本研究中我們同時(shí)敲除串聯(lián)的兩個(gè)同源基因。

表1 引物序列

2.2 △MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4突變體細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定

由于敲除載體中的4含有1的啟動(dòng)子序列[17], 所以在構(gòu)建敲除載體pN-1-3時(shí), 只需設(shè)計(jì)敲除13的3′同源臂(圖1A)。在逐步篩選△13單克隆細(xì)胞株過程中, 當(dāng)巴龍霉素濃度為80 mg/mL時(shí), 未正確重組細(xì)胞株生長遲緩至裂解, 同源重組成功的細(xì)胞株生長良好。以△13基因組為模板, △13-F和△13-R擴(kuò)增獲得3000 bp特異片段, 與預(yù)期相符, 對照以基因組為模板, 獲得4600 bp片段(圖1B)。qRT-PCR檢測△13株中1和3的表達(dá), 顯示均無信號, 證實(shí)1和3均無轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)(圖1C), 結(jié)果表明獲得體細(xì)胞核中完全敲除1和3突變體細(xì)胞株△13。

在逐步篩選△24單克隆細(xì)胞株過程中, 當(dāng)巴龍霉素濃度為50 mg/mL時(shí), 同源重組成功的細(xì)胞株生長良好而未正確重組細(xì)胞株生長遲緩至裂解。在2和4敲除鑒定的過程中, 由于敲除構(gòu)建體與被置換的區(qū)域具有相似的DNA片段大小, 因此無法一步鑒定。以2和4敲除細(xì)胞株的基因組為模板, △24-1-F和△24-1-R為鑒定引物PCR擴(kuò)增獲得2281 bp特異片段, △24-2-F和△24-2-R擴(kuò)增獲得1981 bp特異片段,基因組為模板PCR擴(kuò)增均無特異條帶(圖1D、E), 表明4正確重組到2和4位點(diǎn)。qRT-PCR檢測△24株中2和4均無信號, 證實(shí)2和4均無轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)(圖1F), 表明獲得體細(xì)胞核中完全敲除2和4的突變體細(xì)胞株△24。

2.3 △MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4突變體細(xì)胞在Cd2+、Cu2+和H2O2下的增殖比較

野生型(WT)、△13和△24細(xì)胞初始濃度為1×104cell/mL, 加入不同濃度的Cd2+、Cu2+和H2O2, 檢測細(xì)胞的耐受性。結(jié)果表明隨著Cd2+濃度遞增, △13突變體細(xì)胞增殖顯著下降, 其半數(shù)效應(yīng)濃度(50Cd)介于5—10 μmol/L, 小于WT細(xì)胞的50Cd(27 μmol/L[20])。在10 μmol/L Cd2+的濃度下, 細(xì)胞增殖停滯, 而WT與△24在30 μmol/L Cd2+的濃度下仍能生長(圖2A)。在不同濃度梯度的Cu2+脅迫后, △24與WT相比細(xì)胞增殖抑制明顯, 而△13與WT相比不存在顯著差異。△24的50Cu介于500—650 μmol/L, 小于WT細(xì)胞的50Cu(1500 μmol/L)(圖2B)。在不同濃度的H2O2處理后, WT與△13的生長趨勢一致, 但△24的生長受到顯著抑制(圖2C)。

圖1 嗜熱四膜蟲△MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4突變體細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定

A．1和3基因敲除載體的構(gòu)建和重組示意圖; B．△13突變體重組位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳; M為λ-T14 digest DNA Marker; 泳道1為3000 bp 的重組基因片段; 泳道2為4600 bp的野生型DNA片段; C．1和3轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析; D．2和4基因敲除載體的構(gòu)建和重組示意圖; E．△24突變體重組位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳; M為Trans2KTMPlusⅡ DNA Marker; 泳道1為野生型基因組擴(kuò)增; 泳道2為2281 bp重組DNA片段; 泳道3為野生型基因組擴(kuò)增; 泳道4為1981 bp重組DNA片段; F．2和4轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析

A. Schematic representation for generating1 and3 knockout strain; B. PCR products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis; M: λ-EcoT14 digest DNA Marker; Lane 1: 3000 bp recombination DNA fragment, Lane 2: 4600 bp WT DNA fragment; C. Analysis of relative expression of1and3by qRT-PCR; D. Schematic representation for generating2and4 knockout strain; E. PCR products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis; M. Trans2KTMPlusⅡ DNA Marker; Lane 1. WT control, Lane 2. 2281 bp recombination DNA fragment, Lane 3. WT control, Lane 4. 1981 bp recombination DNA fragment; F. Analysis of relative expression of2and4by qRT-PCR

2.4 兩類MTT家族基因在△MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4突變體細(xì)胞中的表達(dá)變化

在嗜熱四膜蟲中5種金屬硫蛋白基因都不含有內(nèi)含子, 因此對外源環(huán)境變化能夠快速響應(yīng)。在24基因敲除突變體細(xì)胞中,5的表達(dá)水平相對野生型下調(diào);1和3表達(dá)水平則無顯著變化。當(dāng)野生型細(xì)胞株和△24突變體分別在500 μmol/L Cu2+處理后,1、3和5的表達(dá)水平均上調(diào), 但△24突變體比WT細(xì)胞株對于Cu2+的響應(yīng)更顯著, △24突變體細(xì)胞株中1、3和5表達(dá)相對野生型分別上調(diào)6.1、9.5和8.5倍(圖3 A、B、C)。

當(dāng)1-3基因敲除后,2、4和5的表達(dá)水平相對野生型下調(diào)。在5 μmol/L Cd2+處理后,2、4和5的表達(dá)水平相對未誘導(dǎo)顯著上調(diào);5的表達(dá)水平相對同等處理?xiàng)l件下的野生型上調(diào)2.9倍, 但是2和4的表達(dá)水平相對同等處理?xiàng)l件下的野生型下調(diào)4.9倍和2.5倍(圖3 D、E、F)。

3 討論

原生動(dòng)物金屬硫蛋白分為7a (CdMTs)和7b (CuMTs)兩個(gè)亞家族[11]。兩個(gè)亞家族的金屬硫蛋白在金屬誘導(dǎo)類型(Cd/Zn或Cd)和半胱氨酸殘基(Cys)排列方式存在不同[11, 18]。嗜熱四膜蟲1和3、2和4的序列分析表明它們可能是基因在進(jìn)化過程中基因復(fù)制的結(jié)果, 并存在功能冗余性[19]。MTT1和MTT2中半胱氨酸殘基含量百分比一致(29.6%), 但半胱氨酸殘基的排列方式卻不同。MTT1的半胱氨酸殘基排列方式主要為Cys- Cys-Cys和Cys-Cys, 與人金屬硫蛋白的α-domain相似; MTT2的半胱氨酸殘基排列方式主要為Cys-X-Cys, 與人金屬硫蛋白的β-domain相似[20]。在哺乳動(dòng)物中, 人金屬硫蛋白的α-domain優(yōu)先結(jié)合Cd2+, 而β-domain優(yōu)先結(jié)合Cu2+。四膜蟲兩個(gè)亞家族的金屬硫蛋白的啟動(dòng)子不僅對不同的誘導(dǎo)物具有不同的響應(yīng)機(jī)制, 而且對相應(yīng)誘導(dǎo)物的結(jié)合表現(xiàn)出較高的親和力。本研究通過基因敲除, 分析兩種嗜熱四膜蟲突變體細(xì)胞株△1-3和△24的應(yīng)激耐受性的變化, 結(jié)果顯示△13和△24對Cd2+、Cu2+和H2O2脅迫的耐受性顯著不同,1和3的敲除顯著降低了細(xì)胞對Cd2+的耐受性; 而2和4的敲除降低了細(xì)胞對Cu2+和H2O2的耐受性, 表明不同類型的金屬硫蛋白在細(xì)胞中執(zhí)行不同的功能。然而低濃度的離子即可誘導(dǎo)金屬硫蛋白的高效表達(dá), 暗示金屬硫蛋白不僅參與細(xì)胞的解毒功能, 同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)其他應(yīng)激響應(yīng)途徑。

圖2 △MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4突變體細(xì)胞在Cd2+、Cu2+和H2O2脅迫下的增殖比較

細(xì)胞初始濃度均為1×104cell/mL, Cd2+, Cu2+and H2O2應(yīng)激處理下培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。星號表明不同處理組之間存在顯著性差異, *<0.05, **<0.01, 每個(gè)樣本的測定設(shè)有三個(gè)平行樣; A．WT、△13和△24三種細(xì)胞株在Cd2+脅迫下的增殖; B. WT、△13和△24三種細(xì)胞株在Cu2+脅迫下的增殖; C. WT、△13和△24三種細(xì)胞株在H2O2脅迫下的增殖

Initiation concentration of the cells is 1×104cell/mL, cell number is counted under Cd2+, Cu2+and H2O2stress after 24h cultivation, star indicate significant difference between groups, Data are the mean ± standard deviation from three independent experiments,*<0.05, **<0.01; A. Proliferation of WT,△1-3 and △24 strains under Cd2+stress; B. Proliferation of WT,△1-3 and △24 strains under Cu2+stress; C. Proliferation of WT,△1-3 and △24 strains under H2O2stress

圖3 在不同條件下WT、△MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4細(xì)胞株中MTT基因的相對表達(dá)水平

星號表明不同處理組之間存在顯著性差異, *<0.05, **<0.01, 每個(gè)樣本的測定設(shè)有三個(gè)平行樣; A．在正常生長條件和Cu2+脅迫下WT和△24細(xì)胞株中1的相對表達(dá)水平; B．在正常生長條件和Cu2+脅迫下WT和△24細(xì)胞株中3的相對表達(dá)水平; C．在正常生長條件和Cu2+脅迫下WT和△24細(xì)胞株中5的相對表達(dá)水平; D．在正常生長條件和Cd2+脅迫下WT和△13細(xì)胞株中2的相對表達(dá)水平; E．在正常生長條件和Cd2+脅迫下WT和△13細(xì)胞株中4的相對表達(dá)水平; F．在正常生長條件和Cd2+脅迫下WT和△13細(xì)胞株中5的相對表達(dá)水平

Star indicate significant difference between groups, Data are the mean ± standard deviation from three independent experiments *<0.05, **<0.01; A. Relative expression level of1 in WT and △24 strains under normal growth condition and Cu2+induction, respectively; B. Relative expression level of3 in WT and △24 strains under normal growth condition and Cu2+induction, respectively; C. Relative expression level of5 in WT and △24 strains under normal growth condition and Cu2+induction, respectively; D. Relative expression level of2 in WT and △13 strains under normal growth condition and Cd2+induction, respectively; E. Relative expression level of4 in WT and △13 strains under normal growth condition and Cd2+induction, respectively; F. Relative expression level of5 in WT and △13 strains under normal growth condition and Cd2+induction, respectively

Diaz,.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對1、3和5進(jìn)行不同誘導(dǎo)物處理?xiàng)l件下基因轉(zhuǎn)錄水平的研究表明多種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)了1、3和5基因的轉(zhuǎn)錄, 其中Cd2+顯著上調(diào)了1、3和5基因的轉(zhuǎn)錄水平[11]。對2和4進(jìn)行不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)下基因轉(zhuǎn)錄水平的研究表明2和4的最強(qiáng)誘導(dǎo)物是Cu2+, Hg2+、Zn2+和Cd2+也能使其表達(dá)量上調(diào), 但H2O2處理后其表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢[21]。La3+同樣能夠誘導(dǎo)1和2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[22]。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)△24細(xì)胞株中,5表達(dá)水平下調(diào), 這可能是由于MTT2和MTT4的缺失, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)金屬離子代謝失衡, 使得轉(zhuǎn)錄因子活性下降, 導(dǎo)致MTT5的本底表達(dá)受到影響。在Cu2+的應(yīng)激條件下, △24細(xì)胞株中1、3和5的表達(dá)水平比野生型細(xì)胞更高, 表明在缺乏MTT2和MTT4的條件下, MTT1、MTT3和MTT5能夠補(bǔ)償前者的功能。MTT1可以結(jié)合16個(gè)Cd2+, MTT2可以結(jié)合11個(gè)Cd2+[23]。Cu2+不能替代已結(jié)合至MTT1上的Cd2+, 卻可以置換MTT2中的Cd2+, 表明MTT1對Cd2+具有更強(qiáng)的親和力, 而MTT2對Cu2+具有更強(qiáng)的親和力[20]。在正常的生長條件下,2和4有較高的表達(dá)水平, 表明MTT2和MTT4參與細(xì)胞內(nèi)正常的新陳代謝[20]。在重金屬離子應(yīng)激條件下,2和4表達(dá)上調(diào), 表明MTT2和MTT4同時(shí)參與了細(xì)胞的解毒功能。本研究發(fā)現(xiàn)缺乏2和4的表達(dá),1、3和5表達(dá)上調(diào), 以此補(bǔ)償2和4缺失所影響的細(xì)胞內(nèi)代謝和解毒功能。在△13的細(xì)胞中,2、4和5的表達(dá)水平下調(diào)。這些結(jié)果表明, 盡管1和3在正常生長條件下僅有較低水平的表達(dá), 但它們?nèi)钥赡軈⑴c了2、4和5的表達(dá)調(diào)節(jié)。在Cd2+存在時(shí), △13突變體細(xì)胞株中5表達(dá)相對野生型中誘導(dǎo)后的表達(dá)水平上調(diào)2.9倍, 但2和4表達(dá)水平相對野生型沒有上調(diào)。該研究結(jié)果進(jìn)一步表明, 類似MTT1和MTT3, MTT5主要參與細(xì)胞內(nèi)的重金屬解毒功能, 而MTT2和MTT4并不主要參與細(xì)胞內(nèi)重金屬解毒, 主要維持細(xì)胞內(nèi)正常的代謝功能綜上所述, 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明單細(xì)胞嗜熱四膜蟲中的MTT1、MTT3和MTT5主要參與細(xì)胞在重金屬應(yīng)激條件下的解毒功能; 而MTT2和MTT4則主要參與離子在細(xì)胞內(nèi)正常的新陳代謝功能。但是不同金屬硫蛋白之間也存在相互調(diào)節(jié)和功能上的補(bǔ)償, 以此適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化。

[1] Kagi J H, Valee B L. Metallothionein: a cadmium- and zinc-containing protein from equine renal cortex [J]., 1960, 235(12): 3460—3465

[2] Liu J, Klaassen C D. Absorption and distribution of cadmium in metallothionein-I transgenic mice [J]., 1996, 29(2): 294—300

[3] Cousins R J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc: special reference to metallothionein and ceruloplasmin [J]., 1985, 65(2): 238—309

[4] Viarengo A, Burlando B, Ceratto N,Antioxidant role of metallothioneins: a comparative overview [J]., 2000, 46(2): 407—417

[5] Romero-Isart N, Vasak M. Advances in the structure and chemistry of metallothioneins [J]., 2002, 88(3—4): 388—396

[6] Kojima Y, Hunziker P E. Amino acid analysis of metallothionein [J]., 1991, 205: 419—421

[7] Miles A T, Hawksworth G M, Beattie J H,Induction, regulation, degradation, and biological significance of mammalian metallothioneins [J]., 2000, 35(1): 35—70

[8] Eisen J A, Coyne R S, Wu M,Macronuclear genome sequence of the ciliate, a model eukaryote [J]., 2006, 4(9): e286

[9] Miao W, Xiong J, Bowen J,Microarray analyses of gene expression during thelife cycle [J]., 2009, 4(2): e4429

[10] Gutiérrez J C, Martín-González A, Díaz S,Ciliates as a potential source of cellular and molecular biomarkers/ biosensors for heavy metal pollution [J]., 2003, 39(4): 461—467

[11] Diaz S, Amaro F, Rico D,metallothioneins fall into two discrete subfamilies [J]., 2007, 2(3): e291

[12] Gorovsky M A, Yao M C, Keevert J B,Isolation of micro- and macronuclei of[J]., 1975, 9(0): 311—327

[13] Cassidy-Hanley D, Bowen J, Lee J H,Germline and somatic transformation of matingby particle bombardment [J]., 1997, 146(1): 135—147

[14] Gaertig J, Thatcher T H, Gu L,Electroporation- mediated replacement of a positively and negatively selectable beta-tubulin gene in[J]., 1994, 91(10): 4549—4553

[15] Zheng L M, Zhou F L, Yang Q B,Molecular cloning and expression analysis of metallothionein from[J]., 2011, 35(6): 913—919 [鄭麗明, 周發(fā)林, 楊其彬, 等斑節(jié)對蝦金屬硫蛋白基因 cDNA 克隆與表達(dá)分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(6): 913—919]

[16] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method [J]., 2001, 25(4): 402—408

[17] Mochizuki K. High efficiency transformation of Tetrahymena using a codon-optimized neomycin resistance gene [J]., 2008, 425: 79—83

[18] Amaro F, del Pilar de Lucas M, Martin-Gonzalez A,Two new members of themulti-stress-inducible metallothionein family: characterization and expression analysis ofCd/Cu metallothionein genes [J]., 2008, 423(1): 85—91

[19] Gutierrez J C, Amaro F, Martin-Gonzalez A. From heavy metal-binders to biosensors: ciliate metallothioneins discussed [J]., 2009, 31(7): 805—816

[20] Wang Q, Xu J, Chai B,Functional comparison of metallothioneins MTT1 and MTT2 from[J]., 2011, 509(2): 170—176

[21] Chang Y, Feng L F, Xiong J,Function comparison and evolution analysis of metallothionein gene MTT2 and MTT4 in[J]., 2011, 32(5): 476—484 [暢悅, 馮立芳, 熊杰, 等. 嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因 MTT2 和 MTT4 的表達(dá)規(guī)律比較與進(jìn)化模式分析. 動(dòng)物學(xué)研究, 2011, 32(5): 476—484]

[22] Wang Q, Xu J, Zhu Y,Lanthanum(III) impacts on metallothionein MTT1 and MTT2 from[J]., 2011, 143(3): 1808—1818

[23] Blindauer C A. Metallothioneins with unusual residues: histidines as modulators of zinc affinity and reactivity [J]., 2008, 102(3): 507—521

ANALYSIS OF FUNCTIONAL COMPENSATION OF TWO DIFFERENT METALLOTHIONEIN SUBFAMILIES FROM

LU Jian-Gong, XU Jing, ZHANG Peng-Xing and WANG Wei

(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Metallothioneins inwere divided into two subfamilies: 7a including MTT1, MTT3 and MTT5 and 7b including MTT2 and MTT4. To explore whether these two subfamilies have functional compensation, the13 and24 gene knockout vectors were constructed.13 and24 somatic knockout strains were obtained by homologous recombination. We discovered that △13 mutant strains were more sensitive to Cd2+compared with the wild-type strain, and △24 mutant strains were more sensitive to Cu2+and H2O2compared with the wild-type strain. The diminished expression of5was observed in △strains, and 500 μmol/L Cu2+treatment upregulated the expression of1,3 and5 in △24 strains. The expression level of2,4 anddecreased in △13 mutant strains, and the treatment of 5 μmol/L Cd2+further diminished the expression level ofand4 by 4.9 and 2.5 times, respectively, but the treatment of 5 μmol/L Cd2+induced the expression of5. These results demonstrated thatMTT1, MTT3 and MTT5 were mainly involved in detoxification, MTT2 and MTT4 were mainly participated in normalcellular metabolism. These two different MTT subfamily proteins are interactional and have functional compensation in

; Metallothioneins; Gene knockout; RT-PCR

2013-01-25;

2013-12-20

國家自然科學(xué)基金(30770295, 31072000); 教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 201026)資助

盧劍功(1986—), 男, 山西太原人; 碩士; 主要研究方向?yàn)樵鷦?dòng)物分子生物學(xué)。E-mail: ludamson@gmail.com

王偉(1970—), 男, 博士, 教授; 主要研究方向?yàn)樵鷦?dòng)物分子生物學(xué)。E-mail: gene@sxu.edu.cn

Q344+.1

A

1000-3207(2014)02-0249-08

10.7541/2014.37