入侵植物春飛蓬的生物檢定與化學成分初探

王輝，趙睿，黃陸軍，張世堯，王琦，徐凌川

（山東中醫(yī)藥大學，山東　濟南　250355）

入侵植物春飛蓬的生物檢定與化學成分初探

王輝，趙睿，黃陸軍，張世堯，王琦，徐凌川*

（山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355）

摘要：為了對入侵植物春飛蓬進行生物檢定和化學成分初步研究，采用基原鑒別、顯微鑒別、分子鑒別、紫外光譜及高效液相色譜等方法進行實驗研究，并與近似植物一年蓬進行花粉粒和DNA序列比較。結果表明，春飛蓬粉末中的主要顯微特征為具三孔溝的花粉粒、不定式氣孔、多細胞非腺毛、冠毛以及導管等；春飛蓬與一年蓬的花粉粒形態(tài)差異顯著；二者的DNA序列區(qū)別明顯；春飛蓬總黃酮的含量為0.59%，未測出燈盞花乙素。

關鍵詞：春飛蓬；顯微鑒別；總黃酮；資源利用

春飛蓬（ErigeronphiladelphicusL）為菊科（Compositae）飛蓬屬（Erigeron）植物，又名費城飛蓬，與一年蓬（Erigeronannuus（L）Pers）［1］的植物形態(tài)極其相似，該植物于2011年出現(xiàn)在我國浙江、福建、上海、江蘇和安徽等省市，是一種源自北美的外來入侵植物。2015年山東境內也發(fā)現(xiàn)有春飛蓬，我們對其進行了初步研究。

1　實驗材料、儀器與試藥

1.1實驗材料

所用實驗樣品于2015年5月采自山東濟南，經山東中醫(yī)藥大學生藥教研室徐凌川教授鑒定為菊科飛蓬屬植物春飛蓬（E.philadelphicus）L.地上部分；花粉粒的對照樣品采自一年蓬（E.annuus（L）Pers）的花序，一并通過鑒定；春飛蓬的干燥地上部分，粉粹后過40目篩備用。

1.2儀器

SUPRATM55熱場掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；PCR反應擴增儀（加拿大BBI公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（GeneGenius公司）；U-3010紫外-可見分光光度計（日立公司）；Blospin植物基因組DNA提取試劑盒；移液器范圍（100～1000mL，20～200mL，0.5～10mL）（賽默飛世爾科技公司）；UV-5800（上海元析有限公司）；Waterse2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）等。

1.3試藥

蘆丁對照品（批號：YM0313SA14）；燈盞花乙素（野黃芩苷）對照品（批號：ZM0520XA14）。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇，所用試劑均為分析純。

2　實驗方法與結果

2.1基原鑒別

春飛蓬為一年生或越年生草本植物。莖直立，高30～100cm，粗壯，上部有分枝，植物密被開展長硬毛及短硬毛（毛較多，明顯），葉互生，基生葉蓮座狀，卵形或卵狀倒披針形，兩面被倒伏的硬毛，葉緣具粗齒，花期不枯萎，莖生葉基部半抱莖；中上部葉披針形或條狀線形，頂端尖，基部漸狹無柄，邊緣有疏齒，被硬毛。頭狀花序數(shù)枚，直徑6～8mm，總苞片3層，草質，披針形，長3～5mm，淡綠色，邊緣半透明，中脈褐色，背面被毛；舌狀花2層，雌性，舌片線形，長約6mm，平展，蕾期下垂，花期仍斜舉，舌狀花白色略帶粉紅色，管狀花兩性，黃色，花期為3～5月［2］。

圖1　春飛蓬粉末圖Fig.1　Powder　figure　of　E.philadelphicus　L.

2.2顯微鑒別

2.2.1粉末的顯微觀察

黃綠色。水合氯醛加熱透化裝片，可見具三孔溝、近圓形的花粉粒，表面為齒狀凸起，直徑約為18～20μm。非腺毛基部為2～3個細胞并列，頂端細胞尾尖，形如刺刀。氣孔橢圓形，為不定式。纖維多成束存在，壁厚。導管多為螺紋導管。莖部薄壁細胞，其壁呈念珠狀增厚（見圖1）。

2.2.2花粉粒的觀察

取春飛蓬與一年蓬的花粉于標本托上，噴金后分別觀察兩者的花粉粒。

掃描電鏡圖顯示，春飛蓬花粉粒的齒狀紋飾稀疏，頂端刺漸尖，直徑約為18μm（圖2a）；而一年蓬的齒狀凸起相對較多且花粉粒直徑大，約為22μm，齒狀凸起基部膨大，頂端刺驟尖（圖2b）。

圖2　春飛蓬與一年蓬花粉粒的掃描電鏡圖Fig.2　SEM　figures　of　pollen　grains　of　E.philadelphicus　L.and　E.annuus（L）Pers.

2.3分子鑒別

2.3.1方法

通過Blospin植物基因組DNA提取試劑盒來分別提取兩種植物的總DNA，利用一對通用引物ITS1-ITS4進行PCR擴增，（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增反應體系：2×Taqmastermix25μL、DNA模板4μL、ITS1引物2μL、ITS4引物2μL、ddH2O17μL。將反應體系中的所有成分精密移取至PCR管中并充分混勻后放入PCR儀中。擴增程序：94℃預變性3min，再進行35個循環(huán)（94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min，產物于-4℃冰箱保存。PCR產物檢測：PCR產物5μL用3μLEB染色，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀照相。PCR產物測序：將PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

2.3.2實驗結果

實驗所得植物測得的ITS堿基序列分別如下：

1號（春飛蓬）序列：

GGCTGGTGGAGCTGCAGCAGACGACCCGCGAACATGTTAAAACAACCATGCCAGGATGTGTCGAGCATTCGTTCGATCGTTCTGGCATACCGTTGATGTGCCTGCCTAGTTGGCCCTCTGGGTCATCTTGGTGGTCGCATTGACGTAACAAAACCCAGGCACGGGATGTGCCAAGGAACTTAAAATTGAAGAATTGCCTGTCCCATAGTCCCGTTCGCGGTGTGCTCATGGGGTCTGGCATCTTTGTAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTCGGTTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCCCCAACATTTCCTTTGGGATGCTTGGTTGGGAGCGGATATTGGTCTCCCGTTTTCACCGAGCGGTTGGCCGAAATAAAAGCACCTCTTGACGGGCGCAAGACTATTGGTGACAAAACCATGAATTTTGTTGCGTGTCTCGTTAAAAGGATGCTTCTTATAGACCCAACGCGTTGTTTTCTTATGACGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAACCCGGAGGAAAAA（687bp）

2號（一年蓬）序列：

CGTCGGAGCTGCAAGCAGACGACCCGCGAACATGTTAAAACAATCATGCCAGGATGTATTGAGCATCCGTTTGATCGTCCTGGCATACCGTTGATGTGCCTGCCTCGTTGGCCCAGTGGGTCATCTTGGTGGTCGCTTTGACGTAACAAAACCCAGGCACGGGATGTGCCAAGGAACTTTAAACTGAAGAATTGCCCATCCCAATGAAGTCCCGTTCGCGGTGTGCTCATGGGGTGTGGCATCTTTGTAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTCGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCCCCACCATTTCCTTTTGGATTGTTGGCTGGGAGCGGATATTGGCCTCCCGTTTTAACCGAGTGGTTGGCCAAAATAAAAGCACCTCTTGACGGGCGCAAGACTATTGGTGACAAAACCATGAATTTCGTTGCGTGTCTCGTCAAAAGGTTGCTTGTTATCGACCCAACGCGTTGTCTTTTGATGACGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAA（673bp）

將本實驗所得的ITS序列輸入到NCBI上的GenBank上Blast后進行同源率分析，結果顯示1號與春飛蓬同源率為99%，我們可以認定為該植物即為春飛蓬；2號與一年蓬同源率為99%，可以判定該植物為一年蓬。故可從分子方面對兩者進行區(qū)分。

2.4總黃酮含量測定

2.4.1對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg，置100mL量瓶，加70%乙醇定容至刻度，即得對照品溶液。

2.4.2供試品溶液的制備

取春飛蓬粗粉約2.5g，精密稱定后加入14倍量70%乙醇加熱回流提取3次（1h，1h，1h），3次回流后合并濾液，使其在水浴上蒸干溶劑，最后用70%乙醇定容至500mL量瓶中，即得［3］。

2.4.3標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL量瓶，分別加入70%乙醇2mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，混勻，放置6min，精密加入氫氧化鈉試液2mL，搖勻，放置10min，用70%乙醇稀釋至刻度。以相應試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在510nm波長處測定吸光度。以蘆丁對照品濃度為縱坐標（Y），溶液吸光度值為橫坐標（X），作標準曲線，回歸方程為Y＝0.0684X＋0.0028，R＝0.9999，結果表明蘆丁對照品濃度在5～50μgmL范圍內與溶液的吸光度之間呈良好的線性關系［4］。

2.4.4計算總黃酮含量

根據(jù)紫外-可見分光光度法，在510nm波長處測定吸光度值，由標準曲線讀出濃度，計算其總黃酮含量。由實驗數(shù)據(jù)得出，春飛蓬中總黃酮含量約為0.59%。

2.5燈盞花乙素含量測定

對照品與供試品溶液均按2010版藥典方法制備［5］，按照2010版中國藥典燈盞花乙素含量測定方法測定［5］，結果未測出燈盞花乙素。

3　討論

春飛蓬原產北美，是一種外來入侵植物，最近幾年在中國南方城市發(fā)現(xiàn)，但在山東境內發(fā)現(xiàn)屬首次報道。因其植物形態(tài)與一年蓬極近似，常會被誤認為一年蓬?？上葟男螒B(tài)特征如葉先端的形態(tài)、花的開放特點和花期以及毛茸等幾個方面仔細加以區(qū)別。再者可以通過分子鑒定方法進一步區(qū)別。

通過對春飛蓬進行初步鑒定研究，表明其粉末中主要顯微特征有花粉粒、多細胞非腺毛、螺紋導管、表皮細胞及不定式氣孔、纖維、冠毛、花藥碎片和莖部薄壁細胞等；從花粉粒掃描電鏡圖可以看出，春飛蓬花粉粒比一年蓬花粉粒的直徑小，且外壁紋飾的齒狀突起更稀疏、更短鈍；得到了春飛蓬的ITS序列；紫外-可見分光光度法測得春飛蓬全植株中總黃酮含量為0.59%；燈盞花乙素未檢測出。

資料報道全世界飛蓬屬植物種類共計200余種，其中經過研究的有30多種［6］，我國對飛蓬屬植物研究較深入的只有短亭飛蓬（Erigeronbreviscapus（Vant）Hand.Mazz）［7］，對同屬其他植物的研究均較少且不深入，總體看來，該屬植物大多含有黃酮、甾醇、萜類、揮發(fā)油和咖啡酞類等化合物［8］。

本實驗說明春飛蓬含有黃酮類化合物，有理由推測其具有一定的資源利用價值，有必要對其開展較系統(tǒng)的化學成分、藥理等方面的研究。

參考文獻：

［1］黃麗娜.一年蓬的生藥學鑒別研究［J］.浙江中醫(yī)雜志，2011，46（10）：763－764.

［2］朱莉莉，郭水良.浙江境內的新外來入侵植物——春一年蓬［J］.雜草科學，2010，27（4）：62－63.

［3］邵帥，嚴銘銘，王海靜，等.飛蓬提取工藝的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（11）：2774－2775.

［4］岐林，牛曉峰.小飛蓬中總黃酮的含量測定［J］.醫(yī)藥導報，2013，32（8）：1088－1089.

［5］國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：379－380.

［6］朱繼忠，臧皓，張輝.飛蓬屬植物的化學成分及活性研究［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2008，24（4）：381－382.

［7］林春，劉鴻高，余選禮，等.藥用植物燈盞花的研究進展［J］.中國野生植物資源，2003，22（1）：9－11.

［8］張青春，張輝.菊科飛蓬屬藥用植物研究概況［J］.吉林中醫(yī)藥，2007，27（1）：68－69.

BiologicalidentificationandchemicalconstituentsanalysisofinvasiveplantErigeronphiladelphicusL.

WANGHui，ZHAORui，HUANGLu-jun，ZHANGShi-yao，WANGQi，XULing-chuan*

（ShandongUniversityofTraditionalChinesemedicine，Jinan250355，China）

Abstract：Weuseoriginidentification，microscopeidentification，moleculeidentification，UVandHPLCtopreliminarilyanalyzechemicalconstituentsofthealieninvasiveplantErigeronphiladelphicusL.WealsocomparepollengrainandDNAsequencebetweenErigeronphiladelphicusL.anditssimilarplantErigeronannuus（L）Pers.ResultsshowthatpredominantmicroscopiccharactersofE.PhiladelphicusL.powderarepollengrain，infinitivestomata，multi-cellnon-glandularhairs，pappus，vessel，etc.Formdistinctionoftheirpollengrainsissignificant.ThedifferenceoftheirDNAsequenceisobvious.TotalflavonoidscontentofErigeronphiladelphicusL.is0.59%andwedonotfinditsbreviscapine.Keywords：ErigeronphiladelphicusL.；microscopicidentification；totalflavones；resourceutilization

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026（2016）01-0021-04

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.004

收稿日期：2015-07-25

基金項目：國家公益性行業(yè)專項基金（201407002）

作者簡介：王輝（1990－），女，碩士研究生，研究方向為中藥、生藥資源及質量控制與資源開發(fā)利用。Email：m15216440087＿1＠163.com。

*通訊作者，徐凌川（1962－），男，教授，碩士生導師，研究方向為生藥中藥質量控制、資源開發(fā)利用及藥用真菌研究與應用。Email：xulingchuan518＠sina.com。