測(cè)定端粒長(zhǎng)度推斷法醫(yī)學(xué)年齡的研究進(jìn)展

楊吉慶，黃兆樣，梁　杰，夏志遠(yuǎn)，翟仙敦，莫耀南

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測(cè)定端粒長(zhǎng)度推斷法醫(yī)學(xué)年齡的研究進(jìn)展

楊吉慶1，黃兆樣2，梁杰3，夏志遠(yuǎn)4，翟仙敦4，莫耀南4

摘要：目的對(duì)不同組織細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與法醫(yī)學(xué)年齡關(guān)系的研究進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究提供參考。方法參考近年來(lái)有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)端粒的結(jié)構(gòu)及功能、端粒長(zhǎng)度的測(cè)定方法、不同組織細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與法醫(yī)學(xué)年齡的關(guān)系，以及端粒長(zhǎng)度的影響因素等方面進(jìn)行系統(tǒng)回顧。結(jié)果不同組織細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與法醫(yī)學(xué)年齡關(guān)系顯著。結(jié)論測(cè)定端粒長(zhǎng)度對(duì)于法醫(yī)學(xué)年齡推斷具有重要意義。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)學(xué)；年齡推斷；端粒

2.海南省保亭縣公安局, 海南保亭572300

3.海南省五指山市公安局，海南五指山 572200

4.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003

法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別中，準(zhǔn)確的年齡資料可以為刑事案件的偵破提供重要的信息。目前通過(guò)骨齡檢測(cè)尚可對(duì)個(gè)體法醫(yī)學(xué)年齡進(jìn)行大致推斷，然而利用現(xiàn)場(chǎng)遺留下的軟組織碎塊、各種斑痕等生物性檢材進(jìn)行法醫(yī)學(xué)年齡推斷，目前仍然沒(méi)有一套成熟可靠的方法。端粒是存在于各種組織細(xì)胞內(nèi)，由染色體末端重復(fù)序列和結(jié)合蛋白組成的帽狀結(jié)構(gòu)，隨著個(gè)體年齡的增加，端粒長(zhǎng)度也會(huì)隨之縮短，因此利用現(xiàn)場(chǎng)生物檢材端粒長(zhǎng)度推斷法醫(yī)學(xué)年齡是一種方法。本文對(duì)有關(guān)文獻(xiàn)加以綜述，重點(diǎn)回顧端粒結(jié)構(gòu)、端粒長(zhǎng)度的測(cè)量方法、端粒長(zhǎng)度與年齡的關(guān)系、端粒長(zhǎng)度改變的影響因素等內(nèi)容，為利用端粒長(zhǎng)度推斷法醫(yī)學(xué)年齡的相關(guān)研究提供思路。

1端粒研究概述

1.1端粒的結(jié)構(gòu)和功能

端粒是由位于染色體末端的重復(fù)序列和結(jié)合蛋白組成。目前發(fā)現(xiàn)，序列的重復(fù)單位在不同物種之間并不完全相同，例如最早發(fā)現(xiàn)的重復(fù)單位是位于四膜蟲端粒上的CCCCAA六堿基序列，而后來(lái)發(fā)現(xiàn)人和其他哺乳動(dòng)物的端粒重復(fù)單位則是TTAGGG[1]。而有些生物體，如草履蟲，其端粒是以由TTGGGG和TTTGGG共同組成，而酵母菌端粒則是由TG、TGG和TGGG組成。但由于大多數(shù)端粒的重復(fù)單位都含有3個(gè)或3個(gè)以上的G，所以含有3個(gè)或3個(gè)以上G的這條單鏈也稱作多G鏈(stand G enriched，G-rich strand)，并由其構(gòu)成端粒3’末端。人類端粒為雙鏈結(jié)構(gòu)，并且在3’末端，多G鏈比互補(bǔ)鏈長(zhǎng)，而突出這段多G鏈通過(guò)氫鍵作用將鏈中每4個(gè)G固定在同一平面內(nèi)，形成G-四連體結(jié)構(gòu)(G-quadruplexes)。這一結(jié)構(gòu)對(duì)DNA的復(fù)制和端粒的延長(zhǎng)有阻礙作用[2]。而端粒整體經(jīng)過(guò)卷曲、回環(huán)形成端粒環(huán)(telomere loops,T-loops)，從而將染色體尾端隔離；而端粒環(huán)最尾端單鏈DNA結(jié)構(gòu)嵌入端粒雙鏈DNA中形成一段三鏈結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)命名為置換環(huán)(displacement loop,D-loop)[3]。因此，端粒的這種結(jié)構(gòu)對(duì)維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、防止染色體端與端的融合起著重要作用。

端粒的作用還依賴于端粒結(jié)合蛋白的參與。端粒結(jié)合蛋白(shelterin telomeric binding protein)即6個(gè)蛋白的復(fù)合體，由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1組成。端粒結(jié)合蛋白的主要功能為抑制染色體末端DNA損壞應(yīng)答機(jī)制的激活和控制端粒酶對(duì)染色體末端的作用。具體來(lái)說(shuō)，TRF1對(duì)端粒DNA片段具有特異識(shí)別功能，限制端粒酶對(duì)端粒的延長(zhǎng)作用[4]；TRF2對(duì)于穩(wěn)定多G鏈結(jié)構(gòu)，防止端粒融化具有重要作用；RAP1可以調(diào)節(jié)NF-κβ介導(dǎo)通路[5]；TIN2具有抑制TRF1多聚ADP核糖基化作用[6]；TPP1具有吸引端粒酶的作用[7]；而PTO1在端粒酶活性的抑制劑或激活劑，阻止端粒融合，抑制DNA修復(fù)系統(tǒng)功能等方面具有重要作用[8]。

端粒功能異常時(shí)，染色體末端之間會(huì)發(fā)生融合，從而激活“斷裂-融合-橋接”循環(huán)(B/F/B circle)，直至染色體得到新的端粒。目前發(fā)現(xiàn)在著絲粒和染色體末端靠近末端也發(fā)現(xiàn)有重復(fù)序列[9]，這種序列被稱為間質(zhì)端粒序列(interstitial telomeric sequences，ITSs) ，可能與端粒融合和染色體易位有關(guān)。

1.2端粒長(zhǎng)度的影響因素

端粒長(zhǎng)度受很多因素影響，大致可以分為社會(huì)心理因素、行為習(xí)慣因素、環(huán)境因素、腫瘤和疾病因素以及其他因素。有研究表明，短時(shí)間暴露于污染的環(huán)境中，可以使白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度增加，而長(zhǎng)期暴露于污染的環(huán)境中，則使白細(xì)胞端粒縮短。前者認(rèn)為端粒長(zhǎng)度增加與短時(shí)間的炎癥反應(yīng)有關(guān)，而后者端粒長(zhǎng)度縮短與長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激有關(guān)[10]。也有實(shí)驗(yàn)將酵母菌暴露于不同的生長(zhǎng)環(huán)境中，其中高溫和咖啡因等刺激能使酵母菌端粒變短，乙醇等刺激能使其端粒變長(zhǎng)[11]。也有研究表明激光(gamma=632.8 nm,P=2 mW)可以減慢端粒變短速度[12]。而堅(jiān)持高有氧運(yùn)動(dòng)可以延緩端粒長(zhǎng)度的縮短速度[13]。腫瘤細(xì)胞由于端粒酶的活性被激活，所以其端?？删S持在一定的長(zhǎng)度而不發(fā)生變化[14]。越來(lái)越多的疾病被報(bào)道與端粒長(zhǎng)度有關(guān)，如先天性角化不良、特發(fā)性肺纖維化、再生障礙性貧血、冠狀動(dòng)脈疾病、心衰等[15-16]。

1.3端粒長(zhǎng)度的測(cè)量方法

國(guó)內(nèi)外測(cè)量端粒的長(zhǎng)度的方法主要有Southern Blot、PCR、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridisation,FISH)以及在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的方法如單端粒長(zhǎng)度分析(single telomere length analysis, STELA)、實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)、單染色體多通路實(shí)時(shí)定量PCR(monochrome multiplex Q-PCR，MMQPCR)、定量熒光原位雜交(quantitative fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)以及流式細(xì)胞熒光原位雜交(Flow-FISH)等。其中，Southern Blot為第一代端粒測(cè)量技術(shù)，適合于130左右的樣本量，常常被作為評(píng)定新方法優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。而Q-PCR是唯一可以實(shí)現(xiàn)高通量的技術(shù)，適合于大樣本量的研究，如對(duì)流行病學(xué)的研究、新藥物的篩選等。Flow-FISH可同時(shí)分析多種血細(xì)胞，適合于20～50樣本量。Q-FISH可以進(jìn)行單細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的測(cè)量，適合5～10的樣本量。MMQPCR可以進(jìn)行單染色體端粒長(zhǎng)度的測(cè)量。STELA可以進(jìn)行單個(gè)端粒長(zhǎng)度的測(cè)量，適合1～5的樣本量。

不同方法優(yōu)缺點(diǎn)比較具體如下：Q-PCR是目前唯一可實(shí)現(xiàn)高通量的技術(shù)，適合大樣本的研究；缺點(diǎn)為結(jié)果準(zhǔn)確性相對(duì)較低，不適合精密測(cè)量。MMQPCR是基于Q-PCR的一個(gè)新版本，可在不同拷貝數(shù)下對(duì)多組DNA模板進(jìn)行研究，如對(duì)細(xì)胞mtDNA、rDNA、Alu DNA拷貝數(shù)目的研究[17]；Southern Blot為端粒長(zhǎng)度測(cè)量的第一代技術(shù)，常作為評(píng)判新測(cè)量技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)是DNA需要總量大，需要來(lái)自105個(gè)以上細(xì)胞的基因組，對(duì)于非常短的端粒相對(duì)不敏感，所得結(jié)果為所有染色體端粒的平均長(zhǎng)度，并非某個(gè)染色體端粒的長(zhǎng)度[18]。Flow-FISH可準(zhǔn)確測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的平均端粒長(zhǎng)度，并可用于多種細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的測(cè)量，目前為端粒長(zhǎng)度提供了最廣泛的數(shù)據(jù)參考資料，并且是第一個(gè)利用端粒長(zhǎng)度參與臨床診斷的技術(shù)；缺點(diǎn)為難以確定未知細(xì)胞清洗條件；為了保護(hù)細(xì)胞表面抗原，只能選擇同種固定液的新鮮血液樣品[19]。STELA最大的優(yōu)點(diǎn)為可以在pg數(shù)量級(jí)或50個(gè)細(xì)胞左右提供可靠的端粒長(zhǎng)度結(jié)果，所以適用于稀罕類型細(xì)胞端粒長(zhǎng)度測(cè)量；缺點(diǎn)為單個(gè)染色體端粒長(zhǎng)度不能代表整個(gè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度水平，而且僅限于于XpYp, 2p, 11q, 12q 和17p的檢測(cè)；而且對(duì)于較長(zhǎng)端粒檢測(cè)能力有限，一般上限為20 kb[20-22]。

2端粒長(zhǎng)度與法醫(yī)學(xué)年齡的關(guān)系

2.1端粒長(zhǎng)度推斷法學(xué)年齡的理論基礎(chǔ)除大腦皮質(zhì)、灰質(zhì)、心肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞外，人體幾乎所有體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而縮短。假設(shè)某種體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度隨時(shí)間均勻縮短，那么可以通過(guò)測(cè)量該細(xì)胞端粒初始長(zhǎng)度和端粒年縮短速率來(lái)推算法醫(yī)學(xué)年齡。有研究表明新生兒時(shí)的白細(xì)胞、臍動(dòng)脈和包皮三者端粒長(zhǎng)度是同步的，而正常大腦皮、髓質(zhì)和心肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度在個(gè)體一生變化不明顯[23]。所以端粒初始長(zhǎng)度可以用新生兒體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度或者腦皮、髓質(zhì)或者心肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度來(lái)代替。假設(shè)某種體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度隨時(shí)間變化不均勻，呈現(xiàn)一定的時(shí)間階段性，那么除了需要測(cè)量該種體細(xì)胞端粒初始長(zhǎng)度，還需要測(cè)量該體細(xì)胞端粒的終止長(zhǎng)度，而終止長(zhǎng)度可以用百歲老人相應(yīng)體細(xì)胞長(zhǎng)度來(lái)代替。在此基礎(chǔ)上還需要測(cè)量不同時(shí)間階段該細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的平均值。目前對(duì)端粒長(zhǎng)度研究最多的國(guó)家是日本，其所得的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，不同種類的體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度隨時(shí)間呈階段性變化趨勢(shì)。在進(jìn)行端粒長(zhǎng)度的法醫(yī)學(xué)年齡推斷時(shí)，還需要考慮種族性別是否能帶來(lái)的端粒長(zhǎng)度的變異，有研究表明中國(guó)漢族和藏族外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度變化并無(wú)差異，但性別之間存在階段性差異，認(rèn)為在0.1～14歲和65歲以上存在性別差異，其他年齡不存在明顯差異[24]。

2.2法醫(yī)常見(jiàn)檢材的端粒長(zhǎng)度變化規(guī)律法醫(yī)學(xué)最常見(jiàn)尸體檢材有心、肺、肝、脾、腎、胰、腦、胃腸、喉頭氣管、甲狀腺、及腎上腺等。其中正常腦皮、灰質(zhì)、心肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度終身變化不明顯，但對(duì)于有心肌肥大的心肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度年縮短率為20 bp[25]。其他組織器官端粒長(zhǎng)度隨時(shí)間程序階段性變化趨勢(shì)，且所有端粒長(zhǎng)度年縮短率在100 bp以下，以甲狀腺和甲狀旁腺年縮短率最大。部分組織器官端粒長(zhǎng)度變化數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1　不同組織細(xì)胞端粒長(zhǎng)度

3端粒長(zhǎng)度在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用展望

犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的血跡、精斑、唾液、毛發(fā)、軟組織等常見(jiàn)的法醫(yī)物證，對(duì)于個(gè)體識(shí)別起著重要的作用，準(zhǔn)確測(cè)量這類檢材端粒的長(zhǎng)度，對(duì)于犯罪嫌疑人的甄別、偵查范圍的劃分均具有重要意義。Tsuji[32]等人研究表明，只有現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境下DNA能夠很好保存，可以進(jìn)行粗略年齡推斷，年齡=-0.0095y+148.9±7.037(y：平均TRF長(zhǎng)度)。也有研究表明[33]，冰凍融化和4 ℃保存4 d的血液，測(cè)得結(jié)果與直接靜脈抽血后所測(cè)結(jié)果一致。但該方法測(cè)量干燥的血跡中的全血和單核細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果明顯高于指尖取血或直接靜脈抽血所得結(jié)果。對(duì)于精子端粒長(zhǎng)度的研究，目前認(rèn)為年齡大的男性，其精子端粒長(zhǎng)度反而長(zhǎng)于年齡小的個(gè)體[34]。目前對(duì)于唾液斑中的口腔上皮細(xì)胞及頭發(fā)毛囊端粒長(zhǎng)度的研究數(shù)據(jù)很少?？傮w而言，血跡、精斑、唾液及毛發(fā)等常見(jiàn)法醫(yī)物證的端粒長(zhǎng)度測(cè)量方法及相關(guān)數(shù)據(jù)都不夠完善，有待于進(jìn)一步研究。

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作者單位：1.北京市紅十字會(huì)急診搶救中心司法鑒定中心，北京 100192

Review of Telomere Length for Forensic Age Estimation

YANG Ji-qing1, HUANG Zhao-yang2, LIANG Jie3, XIA Zhi-yuan4, ZHAI Xian-dun4, MO Yao-nan4

(1.Forensic Expertise Center of Beijing Red Cross Emergency,Beijing 100192,China; 2.The Public Security Bureau of Baoting County,Baoting 572300,China; 3.The Public Security Bureau of Wuzhishan City,Wuzhishan 572200,China; 4.College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo review the researches on the telomere length in different tissues or cell and its correlation to forensic age estimation. MethodsA systematic review was made by referring the latest literatures on the structure of telomere, the methods for measuring telomere length, its correlations to forensic age estimation as well as the influencing factors etc. ResultsTelomere length in different tissues or cells was significant correlation to forensic age estimation. ConclusionDetermination of telomere length is very helpful in forensic age estimation.

Key words:forensic medicine；age estimation；telomere

文章編號(hào)：1672-688X(2016)02-0156-05

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.027

中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：河南省基礎(chǔ)與前沿課題(112300410082)
河南科技大學(xué)基金資助項(xiàng)目(09001309，13000914，13000696)

收稿日期：2016-03-06

作者簡(jiǎn)介：楊吉慶(1983-)，男，河南項(xiàng)城人，法醫(yī)師，從事法醫(yī)臨床和法醫(yī)病理學(xué)鑒定工作。

通信作者：莫耀南，男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：forensic@haust.edu.cn