賁門(mén)癌中CyclinD1蛋白的表達(dá)及意義

茹　藝，陳曉杰，張鵬飛，高社干，高　強(qiáng)，馮笑山

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賁門(mén)癌中CyclinD1蛋白的表達(dá)及意義

茹藝，陳曉杰，張鵬飛，高社干，高強(qiáng)，馮笑山

摘要：目的促進(jìn)賁門(mén)癌的診斷和治療，探討CyclinD1在賁門(mén)癌中的表達(dá)及意義。方法收集32例賁門(mén)癌和配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本，用免疫組化的方法檢測(cè)賁門(mén)癌組織及其配對(duì)的癌旁組織中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，分析該蛋白與賁門(mén)癌臨床病理的相關(guān)性，并評(píng)價(jià)CyclinD1蛋白的臨床意義。結(jié)果賁門(mén)癌組織中CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)為84.8%(27/32) 高于癌旁組織的40.6%(13/32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與賁門(mén)癌臨床分期相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤分化程度和轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)。CyclinD1在個(gè)臨床分期≥Ⅲb的陽(yáng)性表達(dá)為70.6%(12/17)，在臨床分期<Ⅲb的陽(yáng)性表達(dá)為26.7%(4/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CyclinD1賁門(mén)癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與臨床分期相關(guān)，CyclinD1在賁門(mén)癌的發(fā)展過(guò)程中可能具有一定促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：賁門(mén)癌；CyclinD1；臨床分期

賁門(mén)癌在我國(guó)北方許多地區(qū)較為常見(jiàn)，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明賁門(mén)癌是不同于食管癌和胃癌的一種惡性腫瘤，它與胃癌和食管癌的地區(qū)分布范圍存在明顯差異[1]，應(yīng)作為一種獨(dú)立的疾病來(lái)進(jìn)行研究[2]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)屬于細(xì)胞G1期的周期蛋白，具有抑制細(xì)胞增殖和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且改基因與基因組印記有關(guān)[3]。CyclinD1是細(xì)胞周期重要的正調(diào)控因子可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其過(guò)度表達(dá)在多種癌組織中均可被檢測(cè)到。本研究檢測(cè)CyclinD1在賁門(mén)癌及其癌旁組織中的表達(dá)，分析其與臨床分期之間的關(guān)系，探討CyclinD1在賁門(mén)癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇自2012年1月至2014年3月，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的32對(duì)賁門(mén)癌及癌旁組織手術(shù)標(biāo)本，全部病例均有病理診斷支持，其中男性病例30例，女性病例2例；年齡39～76歲，平均61.4歲。入選病例均屬新診斷病例。病理診斷及分級(jí)參照WHO消化道系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(2007年版)：32例病例中17例≥Ⅲb，15例<Ⅲb。標(biāo)本切除后，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人CyclinD1單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruze)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG抗體(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，免疫組化S-P超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽修復(fù)液、PBS緩沖液、蘇木素染液，中性樹(shù)膠、蓋玻片(福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，30%聚丙烯酰胺凝膠(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，組織脫水機(jī)、切片機(jī)(美國(guó)萊卡公司)，組織包埋機(jī)、攤片機(jī)、烘片、烤片機(jī)(襄樊萊克生物電子儀器公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司ECLIPSE 80i)。

1.3方法

1.3.1HE染色按照HE常規(guī)操作步驟進(jìn)行，二甲苯，無(wú)水乙醇，95%乙醇，80%乙醇順序浸泡，水洗，蘇木精染色，流水沖洗，1%鹽酸分化，0.5%伊紅液染色，水洗，80%乙醇，95%乙醇)，無(wú)水乙醇，95%乙醇，二甲苯依次浸泡，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色所有組織切片均進(jìn)行CyclinD1免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按試劑盒操作步驟進(jìn)行。主要步驟如下：脫蠟，水化，抗原修復(fù)，封閉，PBS漂洗，一抗(兔IgG)孵育并且4 ℃過(guò)夜，TBS漂洗10 min，二抗孵育10～30 min，PBS漂洗，DAB顯色，蒸餾水漂洗，1%鹽酸酒精分化，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3判定免疫組化的結(jié)果閱片采取用兩位病理科醫(yī)師雙盲閱片的方法。陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①0分：完全不著色，1分：輕度淡黃著色，2分：中度棕黃著色，3分：棕褐色著色。②陽(yáng)性范圍的判斷：0分：<5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。①②相加分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果：陰性(-) <2分，弱陽(yáng)性(+)2～3分，中度陽(yáng)性 (++)4～5分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)6～7分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，等級(jí)資料采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)比較，計(jì)數(shù)資料采用fishers確切概率法。

2結(jié)果

2.1CyclinD1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞染色定位于胞核和胞質(zhì)，胞質(zhì)或胞核呈棕黃色為表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。賁門(mén)癌組織中CyclinD1總陽(yáng)性表達(dá)率和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.8%(27/32) ，18.8%(6/32)；癌旁組織為40.6%(13/32)，0(0/32)。根據(jù)Wilcoxon秩檢驗(yàn)結(jié)果 腫瘤及癌旁組織中CyclinD1的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

A，B CyclinD1在癌旁組織陰性表達(dá)；C，D CyclinD1在癌組織陽(yáng)性表達(dá)。圖1　CyclinD1在賁門(mén)癌和癌旁組織的表達(dá)(SP,A,C×200;B,D×400)

例

2.2CyclinD1與臨床分期具有相關(guān)性腫瘤組織中CyclinD1的表達(dá)水平與臨床分期有相關(guān)性，采用卡方檢驗(yàn)，結(jié)果提示腫瘤組織中CyclinD1的表達(dá)水平與臨床分期有關(guān)(P=0.03)，即臨床分期越差CyclinD1表達(dá)水平越高，見(jiàn)表2。

表2　賁門(mén)癌病例臨床特征分布

3討論

細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)屬于細(xì)胞G1期的周期蛋白。人類(lèi)CyclinD1定位于染色體11q13，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。CyclinD1屬于核內(nèi)調(diào)控蛋白，分子量為34 kD。其N(xiāo)端含有一個(gè)Leu-X-Cys-X-E序列，該序列與病毒DNA原癌蛋白同源，是CyclinD1重要的功能區(qū)域。CyclinD1蛋白C端富含多種氨基酸殘基，稱(chēng)為PEST序列，與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化、降解有關(guān)[3]。CyclinD1蛋白第56-141位氨基酸序列稱(chēng)cyclin-box，也是CyclinD1蛋白重要的功能區(qū)域，相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin dependent kinases,CDK)可與其特異性結(jié)合。因此CyclinD1是細(xì)胞周期重要的正調(diào)控因子。

CyclinD1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其過(guò)度表達(dá)在各種人類(lèi)癌癥中均可被檢測(cè)到[4-8]。c-myc、ras等癌基因通路的激活與CyclinD1基因擴(kuò)增關(guān)系密切[9]。在套細(xì)胞瘤中，CyclinD1蛋白活性在腫瘤組織中顯著升高，且具有高度敏感性和相對(duì)特異性。所以CyclinD1被作為該腫瘤的特異性診斷指標(biāo)之一[10]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CyclinD1同樣具有重要作用[11-14]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)深度和轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。在卵巢癌有轉(zhuǎn)移組CyclinD1表達(dá)上調(diào)，而無(wú)轉(zhuǎn)移組的中CyclinD1過(guò)表達(dá)下降明顯[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)CyclinD1在有轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，比如膽囊癌[6]、子宮內(nèi)膜[7]以及喉鱗狀細(xì)胞癌[8]等，說(shuō)明CyclinD1在腫瘤的病情進(jìn)展中有促進(jìn)作用。提示檢測(cè)CyclinD1表達(dá)情況可以預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后[15]。

作者的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中CyclinD1的表達(dá)水平與臨床分期有相關(guān)性(P<0.05)，即臨床分期越差CyclinD1表達(dá)水平越高。說(shuō)明CyclinD1在賁門(mén)癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有一定促進(jìn)作用。因此進(jìn)一步深入研究CyclinD1在賁門(mén)癌中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和作用有著重要的意義。

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作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471003

Expression and Clinical Significance of CyclinD1 Protein in Cardia Cancer

Ru Yi, Chen Xiao-jie, Zhang Peng-fei, GAO She-gan, GAO Qiang, FENG Xiao-shan

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:Objective To investigate the expression and its clinical significance of CyclinD1 in gastric cardia adenocarcinoma(GCA).MethodsThe immunohistochemistry was used to determine the level of CyclinD1 in 32 cases of GCA tissues and its adjacent non-cancerous tissues. we also analyzed the correlation between the CyclinD1 and cardia cancer clinicopathologic characteristics, and evaluated the its clinical significance of CyclinD1 protein in cardia cancer.Results The immunohistochemistry results showed that the positive rate of CyclinD1 protein was 84.4%(27/32) in GCA and 40.6%(13/32) in its adjacent non-cancerous tissues respectively, which was significantly statistic difference(P<0.05). The CyclinD1 expression in GCA showed a significant correlation to TNM-staging (P<0.05), but no correlation was found in age, gender, tumor differentiation degree and lymph node metastasis. The positive rate were 70.6%(12/17) in the TNM stage ≥Ⅲb and 26.7%(4/15) in the TNM stage <Ⅲb (P>0.05).ConclusionThe expression of CyclinD1 was significantly higher in GCA and had correlation to clinic stage of GCA. The CyclinD1 protein may play an important role in the development of GCA.

Key words:cardia cancer；cyclinD1；clinical stage

文章編號(hào)：1672-688X(2016)02-0091-03

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.004

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：2011年河南省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目(編號(hào)：112101310100)

收稿日期：2016-03-15

作者簡(jiǎn)介：茹藝(1978-)，男，蒙古族，河南宜陽(yáng)人，主治醫(yī)師，從事腫瘤醫(yī)學(xué)臨床、教學(xué)、科研工作。

通信作者：馮笑山，男，博士，教授，E-mail：samfeng137@hotmail.com