大劑量高壓氧對(duì)腦梗死大鼠細(xì)胞色素C及caspase-3的影響

于秋紅，郁軍超，吉康祥，劉亞玲，薛連璧

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大劑量高壓氧對(duì)腦梗死大鼠細(xì)胞色素C及caspase-3的影響

于秋紅，郁軍超，吉康祥，劉亞玲，薛連璧

［摘要］目的觀察單次高壓氧（HBO）治療9 h對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）大鼠細(xì)胞色素C和caspase-3水平的影響。方法48只Sprague-Dawley大鼠制作永久性MCAO模型，分為對(duì)照組（n=24）和高壓氧組（n=24），高壓氧組大鼠于造模成功后3 h予單次高壓氧治療9 h，壓力0.2 MPa。于造模成功后3 h、13 h、24 h行大鼠Garcia神經(jīng)功能評(píng)分，于造模成功后13 h、24 h TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)，ELISA法檢測(cè)缺血半暗帶腦組織細(xì)胞色素C及活性caspase-3水平。結(jié)果兩組大鼠造模成功后13 h、24 h神經(jīng)功能均有明顯改善，兩組間無(wú)顯著性差異（t＜2.07，P＞0.05）。兩組造模成功后13 h、24 h均見(jiàn)凋亡細(xì)胞，高壓氧組明顯少于對(duì)照組（t＞6.57，P＜0.01）。高壓氧組細(xì)胞色素C和caspase-3的水平在造模成功后24 h低于對(duì)照組（t＞2.41，P＜0.05）。結(jié)論大劑量高壓氧超早期治療可降低腦缺血后細(xì)胞色素C和caspase-3水平，減少細(xì)胞凋亡，可能是高壓氧治療腦梗死的機(jī)制之一。

［關(guān)鍵詞］腦梗死；高壓氧；細(xì)胞色素C；caspase-3；凋亡；大鼠

［本文著錄格式］于秋紅，郁軍超，吉康祥，等.大劑量高壓氧對(duì)腦梗死大鼠細(xì)胞色素C及caspase-3的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（5）:540-543.

作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院高壓氧科，北京市100050。

腦梗死的治療策略主要是盡快恢復(fù)缺血區(qū)域的血流和給予神經(jīng)保護(hù)治療［1］。有研究提示，高壓氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治療能促進(jìn)腦新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的建立［2-3］，且有直接神經(jīng)保護(hù)作用［4］，能保護(hù)缺血半暗帶可存活腦細(xì)胞［5］。我們前期實(shí)驗(yàn)提示，大劑量高壓氧超早期治療永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能通過(guò)提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endo-thelial growth factor，VEGF），促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，減小腦梗死體積，從而抑制、阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)腦缺血后病理變化［6］。高壓氧治療可通過(guò)抑制腦梗死大鼠線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低，減少細(xì)胞凋亡［7］。我們采用高壓氧單次9 h方案，超早期治療局部腦梗死大鼠，觀察高壓氧對(duì)大鼠凋亡相關(guān)分子細(xì)胞色素C和caspase-3水平的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量（280±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。術(shù)前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2試劑

水合氯醛、蔗糖：北京化學(xué)試劑公司。多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，Cat#KGT549）、檸檬酸鈉（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、TUNEL試劑盒（Cat#KGA7044，含緩沖液、熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶、抗熒光素抗體、辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺顯色劑）、線粒體/細(xì)胞核提取試劑盒（Cat#KGA828）：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。大鼠細(xì)胞色素C ELISA試劑盒、大鼠caspase-3 ELISA試劑盒：美國(guó)RB公司。

1.3模型制作及分組

采用改良Longa線栓法［8］永久性阻塞大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈。術(shù)后3 h采用姿勢(shì)反射試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分（3分制）［9］，評(píng)分≥1分的動(dòng)物視為造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、無(wú)自主行動(dòng)大鼠和無(wú)神經(jīng)功能缺損大鼠。造模成功的大鼠分為對(duì)照組（n=24）和高壓氧組（n=24）。

1.4方法

高壓氧組動(dòng)物于MCAO后3 h開(kāi)始高壓氧治療。采用透明純氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙（上海減壓器廠），壓力0.2 MPa，升壓20 min，穩(wěn)壓9 h，減壓40 min。為避免氧中毒，大鼠于第1、3、5、7、9小時(shí)呼吸純氧，第2、4、6、8小時(shí)呼吸高壓空氣。對(duì)照組MCAO后呼吸常壓空氣。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1神經(jīng)功能評(píng)分

采用Garcia評(píng)分［10］于MCAO后3 h、13 h、24 h對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。

1.5.2TUNEL染色

于MCAO后13 h、24 h，每組取6只大鼠10A水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水、4A甲醛灌殺，取前囟后3～6 mm處腦組織冰凍切片，厚20 μm，TUNEL染色。冰凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，濕盒中37℃反應(yīng)60 min，PBS沖洗3次。熒光顯微鏡觀察，每只大鼠選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.5.3ELISA染色

于MCAO后13 h、24 h，每組取6只大鼠，斷頭取腦，將缺血半暗帶腦組織［11］剪成糊糜，使用線粒體/細(xì)胞核提取試劑盒，全程低溫操作，漂洗、研磨、多次離心制成胞漿提取液，采用細(xì)胞色素C和caspase-3 ELISA試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟操作，檢測(cè)細(xì)胞色素C 和caspase-3含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評(píng)分

與MCAO后3 h相比，各組大鼠13 h時(shí)評(píng)分明顯增加（P＜0.01），但24 h時(shí)沒(méi)有進(jìn)一步的改善。高壓氧組評(píng)分較對(duì)照組雖有提高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2凋亡細(xì)胞數(shù)

兩組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，高壓氧組較對(duì)照組明顯減少（P＜0.01），高壓氧組24 h較13 h時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.3細(xì)胞色素C

細(xì)胞色素C在MCAO后13 h可見(jiàn)，兩組水平相近。24 h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞色素C水平繼續(xù)增高，而高壓氧組有下降趨勢(shì)，較對(duì)照組明顯降低。見(jiàn)表3。

2.4caspase-3

對(duì)照組caspase-3水平在13 h增高（正常時(shí)胞漿內(nèi)水平為0），在24 h仍處于高位水平，而高壓氧組caspase-3水平在24 h下降，較13 h及對(duì)照組皆降低。見(jiàn)表4。

表1　各組大鼠Garcia評(píng)分比較

表2　各組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

表3　各組細(xì)胞色素C水平比較（pg/ml）

表4　各組caspase-3水平比較（μmol/ml）

3　討論

高壓氧治療MCAO模型的療效存在爭(zhēng)議［12-14］，高壓氧治療開(kāi)始的時(shí)間和劑量是關(guān)鍵［15］。本研究和前期結(jié)果［6-7，16］類(lèi)似，顯示單次9 h高壓氧能改善局部腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，減少細(xì)胞凋亡。原因可能是缺血周?chē)鷧^(qū)存在部分休眠細(xì)胞，高壓氧提供充足的氧氣，挽救部分休眠細(xì)胞，并使不可挽救的細(xì)胞發(fā)生凋亡而非壞死，避免梗死進(jìn)一步擴(kuò)大，從而改善神經(jīng)功能。

細(xì)胞色素C是第一種被發(fā)現(xiàn)的與線粒體有關(guān)的促凋亡因子。本研究顯示，腦缺血后凋亡細(xì)胞、細(xì)胞色素C和caspase-3出現(xiàn)；大劑量高壓氧治療后，缺血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞減少，作用可持續(xù)到缺血后24 h；這一過(guò)程伴有細(xì)胞色素C和caspase-3水平降低。其機(jī)制可能是高壓氧穩(wěn)定了線粒體膜電位［7］，不僅提供充足ATP［17-19］，而且抑制缺血后細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)物質(zhì)釋放［20］，從而減少內(nèi)源性凋亡途徑激活［21］。

大鼠在體研究證實(shí)，高壓氧通過(guò)線粒體途徑引起外周血淋巴細(xì)胞凋亡，抑制早期急性胰腺炎的炎性反應(yīng)［22］。機(jī)制包括凋亡誘導(dǎo)因子［23］轉(zhuǎn)位、神經(jīng)蛋白［24］等。我們此前的研究也證實(shí)，高壓氧可通過(guò)線粒體途徑影響細(xì)胞凋亡［7］。體外研究發(fā)現(xiàn)，30 min高壓氧暴露可通過(guò)線粒體機(jī)制導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞凋亡［25］。當(dāng)然，高壓氧也可通過(guò)非線粒體途徑影響細(xì)胞凋亡。

本研究尚存以下局限。首先是觀察時(shí)點(diǎn)較少，觀察時(shí)間較短，可能不足以反映腦梗死過(guò)程中各指標(biāo)演變的完整過(guò)程；其次，由于缺血半暗帶是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域，取材定位的缺血半暗帶與實(shí)際的缺血半暗帶可能存在差距。

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·綜述·

CITED AS:Yu QH，Yu JC，Ji KX，et al.Effect of intensive hyperbaric oxygenation on cytochrome C and caspase-3 in rats after focal cerebral infarction［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（5）:540-543.

Effect of Intensive Hyperbaric Oxygenation on Cytochrome C and Caspase-3 in Rats after Focal Cerebral Infarction

YU Qiu-hong，YU Jun-chao，JI Kang-xiang，LIU Ya-ling，XUE Lian-bi
Department of Hyperbaric Oxygen，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Correspondence to XUE Lian-bi.E-mail:xue40@vip.sina.com

Abstract：Objective To observe the effect of single intensive hyperbaric oxygenation（HBO）on cytochrome C and caspase-3 in rats after permanent middle cerebral artery occlusion（MCAO）very early.Methods Forty-eight male Sprague-Dawley rats were subjected to permanent MCAO model using the intraluminal suture method，and were divided into control group（n=24）and HBO group（n=24）.The HBO group stayed in the hyperbaric cabin with a pressure of 0.2 MPa for 9 hours 3 hours after MCAO.They were measured with Garcia scores 3 hours，13 hours and 24 hours after MCAO.Apoptosis cells of ischemic penumbra tissue were investigated with TUNEL 13 hours and 24 hours after MCAO，while the level of cytochrome C and caspase-3 were measured with ELISA.Results The Garcia scores increased 13 hours and 24 hours after MCAO in both groups，but there was no significant difference between groups（t＜2.07，P＞0.05）.The apoptosis cells were found in both groups 13 hours and 24 hours after MCAO，and less in the HBO group than in the control group（t＞6.57，P＜0.01）. The levels of cytochrome C and caspase-3 were less in the HBO group than in the control group 24 hours after MCAO（t＞2.41，P＜0.05）. Conclusion A single intensive HBO in very early stage may improve neurological function after cerebral ischemia in rats，which may associate with the inhibition of cytochrome C and caspase-3 to reduce cell apoptosis.

Key words:cerebral infarction；hyperbaric oxygen；cytochrome C；caspase-3；apoptosis；rats

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.05.011

［中圖分類(lèi)號(hào)］R743.32

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1006-9771（2016）05-0540-04

作者簡(jiǎn)介：于秋紅（1977-），女，漢族，河北遷西縣人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：高壓氧神經(jīng)病學(xué)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期治療和康復(fù)。通訊作者：薛連璧，男，博士，主任醫(yī)師。E-mail:xue40@vip.sina. com。

收稿日期：（2015-10-12修回日期：2016-03-03）