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    屋塵螨變應(yīng)原對人肥大細胞脫顆粒的影響

    2016-06-03 22:58:57唐慧王朵勤沈燕蕓徐金華
    上海醫(yī)藥 2016年9期
    關(guān)鍵詞:肥大細胞

    唐慧+王朵勤+沈燕蕓+徐金華

    摘 要 目的:闡明屋塵螨變應(yīng)原Derp1對人肥大細胞HMC-1釋放類胰蛋白酶水平的影響。方法:流式細胞法測定HMC-1細胞表面蛋白酶激活受體2(PAR2)表達水平;將Derp1、SLIGRL-NH2(PAR2激活劑)、LRGILS-NH2(PAR2對照肽)及Derp1+ FSLLY( PAR2拮抗劑)分別處理HMC-1細胞,用ELISA檢測藥物刺激后類胰蛋白酶水平;采用鈣綠實驗檢測PAR2生物學功能。結(jié)果:肥大細胞表面表達PAR2受體;Derp1單獨作用于HMC-1可明顯引起HMC-1細胞內(nèi)鈣流釋放及類胰蛋白酶的釋放,類胰蛋白酶釋放水平明顯高于SLIGRL-NH2及正常對照;將Derp1與FSLLY共同作用于HMC-1時,可部分抑制HMC-1細胞內(nèi)的鈣流釋放及類胰蛋白酶的釋放。結(jié)論:屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過激活人肥大細胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶。

    關(guān)鍵詞 屋塵螨 肥大細胞 蛋白酶激活受體2 類胰蛋白酶

    中圖分類號:R758.2 文獻標識碼:A 文章編號:1006-1533(2016)09-0010-04

    Effect of house duct mite on the degranulation of the mast cells

    TANG Hui, WANG Duoqin, SHEN Yanyun, XU Jinhua*

    (Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

    ABSTRACT Objective: To study the effects of the house dust mite allergen Derp1 on the secretion of tryptase from the human mast cell line HMC-1. Methods: Flow cytometry assay was performed to determine the expression levels of protease activated receptor 2 (PAR2) on the surface of HMC-1 cells. HMC-1 cells were treated with Derp1, SLIGRL-NH2 (PAR2 agonist), LRGILS-NH2 (control peptide for PAR2) or Derp 1 + FSLLY (PAR2 antagonist), respectively, then the tryptase levels were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Biological functions of PAR2 were determined using the calcium green indicator. Results: PAR2 receptor was expressed on the surfaces of mast cells. Derp1 alone induced a significant release of intracellular calcium and tryptase in HMC-1 cells. The level of tryptase release was significantly higher compared with the SLIGRL-NH2 treatment group and the normal control group. The combination of Derp1 with FSLLY could partly inhibit intracellular calcium and tryptase release in HMC-1 cells. Conclusion: Derp1 can induce HMC-1 cells degranulation to release tryptase by activating the PAR2 receptor on the cell surface.

    KEY WORDS house dust mite; mast cell; protease activated receptor 2; tryptase

    肥大細胞是變態(tài)反應(yīng)性皮膚病及慢性瘙癢發(fā)生中的關(guān)鍵細胞之一,其活化脫顆粒后可產(chǎn)生多種介質(zhì),如組胺、類胰蛋白酶等,其中類胰蛋白酶是重要的致癢介質(zhì)[1-2]。屋塵螨是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病最常見的環(huán)境變應(yīng)原之一,同時也是PAR2的激活劑[3]。因此,本實驗旨在研究屋塵螨變應(yīng)原Derp1對人肥大細胞HMC-1脫顆粒的影響。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    人肥大細胞HMC-1細胞株由Dr. Butterfield 實驗室(Mayo Clinic, Rochester, USA)友情饋贈,類胰蛋白酶ELISA試劑盒購自美國RND公司,SLIGRL-NH2(PAR2活化肽)、LRGILS-NH(2PAR2對照肽)和FSLLRY(PAR2抑制肽)購自Tocris公司,屋塵螨Derp1購自Abnova公司,F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠PAR2單克隆抗體購自Santa Cruz公司,倒置顯微鏡(Nikon, japan),細胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron Co., USA),胎牛血清和青霉素(Gibco),PolyL-lysine (Sigma, USA)。

    1.2 人肥大細胞HMC-1 表面PAR2表達

    HMC-1細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),用細胞培養(yǎng)液[0%(v/v)胎牛血清(FBS),20 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸,0.01%(v/v)硫代甘油,2 mmol/L L-谷氨酰胺,鏈霉素和1%青霉素]于37 ℃、5%(v/v) CO2、濕度為95%的無菌環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞,經(jīng)20 g/L多聚甲醛固定30 min后用含10 g/L BSA的PBS洗滌FITC標記的羊抗鼠PAR2 mAb以及同型對照4 mg/L 37 ℃ 孵育1 h ??贵w標記后細胞用含10 g/L BSA的PBS洗滌2次,重懸細胞以流式細胞術(shù)檢測肥大細胞PAR2表達。

    1.3 人肥大細胞HMC-1培養(yǎng)與激發(fā)[4]

    收集對數(shù)生長期的細胞,用血球計數(shù)板計數(shù), 6孔板每孔5×105,設(shè)3個重復(fù),用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILS-NH2及100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1分別處理細胞,于30 min后終止反應(yīng),4 ℃條件下600×g離心10 min后收集上清置于一80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 ELISA方法檢測類胰蛋白酶水平

    用類胰蛋白酶ELISA試劑盒按照操作說明檢測上述實驗收集的上清液中類胰蛋白酶水平。

    1.5 屋塵螨及類胰蛋白酶刺激下人肥大細胞HMC-1鈣熒光強度的變化

    將HMC-1用Poly-L-lysine固定至載玻片上,用凡士林固定在顯微鏡槽中,在顯微鏡下觀察。用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILSNH2、100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1、100 ng/L類胰蛋白酶及100 ng/L 類胰蛋白酶+100 μmol/L FSLLY(PAR2拮抗劑)分別處理HMC-1細胞30 min,計算處理前后細胞內(nèi)鈣熒光強度的變化,將取得的數(shù)據(jù)歸一化處理。

    1.6 統(tǒng)計學方法

    全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0分析,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05時判定為統(tǒng)計學上有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 人肥大細胞HMC-1 表面PAR2表達

    流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,人肥大細胞HMC-1表面表達PAR2受體(圖1)。

    2.2 屋塵螨變應(yīng)原Derp1對人肥大細胞HMC-1釋放類胰蛋白酶水平的影響

    Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2細胞培養(yǎng)液組作用于HMC-1 30 min后類胰蛋白酶水平分別為(70.40±1.55)ng/ml、(64.45±1.36)ng/ml(24.29±2.60)ng/ml及(31.12±3.60)ng/ml。經(jīng)統(tǒng)計,HMC-1組釋放類胰蛋白酶的水平明顯高于SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2和細胞培養(yǎng)液組(P<0.05),差別有統(tǒng)計學意義。Derp1與FSLLY共同作用HMC-1 30 min后類胰蛋白酶水平為(56.72±2.66)ng/ml,較Derp1單獨作用時明顯降低(P<0.05),較LRGILS-NH2和細胞培養(yǎng)液組依然明顯增高(P<0.05),差別有統(tǒng)計學意義(表1)。

    2.3 屋塵螨及類胰蛋白酶刺激下人肥大細胞HMC-1表面PAR2活性測定

    首先測定在細胞培養(yǎng)液中HMC-1的胞內(nèi)熒光強度。將取得的數(shù)據(jù)歸一化處理后繪制成圖2所示??梢钥吹皆?0 min時胞內(nèi)熒光強度下降至初始狀態(tài)的72.71%±2.21%,反應(yīng)了熒光淬滅的過程。分別用Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2、類胰蛋白酶作用于HMC-1 30 min時胞內(nèi)熒光強度下降至初始狀態(tài)的100.30%±2.37%、82.38%±2.24%、72.77%±3.16%、89.95%±2.25%。用Derp1+FSLLY,類胰蛋白酶+FSLLY作用于HMC-1 30 min時胞內(nèi)熒光強度下降至初始狀態(tài)的78.63%±3.15%及82.60%±3.29%。

    3 討論

    皮膚瘙癢是皮炎、濕疹、蕁麻疹、 接觸性皮炎、 結(jié)節(jié)性癢疹和特應(yīng)性皮炎等過敏性皮膚疾病最常見的臨床表現(xiàn),嚴重影響患者的生活質(zhì)量, 需要及時有效的治療[5], 然而,皮膚瘙癢的發(fā)病機制至今仍不清,導(dǎo)致抗瘙癢治療效果有限。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)吸入性的變應(yīng)原(主要是屋塵螨和粉塵螨)是引起過敏性皮膚病的重要誘因[6] ,在具有慢性瘙癢的過敏性皮膚病中,持續(xù)性的接觸屋塵螨與疾病的加重有關(guān)[7]?,F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)屋塵螨的提取物通過活化PAR2,可導(dǎo)致呼吸道黏膜下腺體的分泌增加,并可引起肺的感覺神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加[8],由此可見屋塵螨可以通過與PAR2的作用參與疾病的發(fā)生。

    蛋白酶激活受體(PARs)屬于與G蛋白偶聯(lián)受體家族,這個家族有四個成員:PAR1, PAR2, PAR3和PAR4。PAR2分布于各種組織和細胞表面,主要包括人皮膚肥大細胞,上皮細胞,活化的內(nèi)皮細胞,肌細胞,神經(jīng)元和星形細胞等[5,9]。肥大細胞又是瘙癢發(fā)病中的關(guān)鍵細胞之一,其釋放的組胺和類胰蛋白酶都是重要的致瘙癢的介質(zhì),其中以類胰蛋白酶的含量為最大,約占肥大細胞分泌顆粒中蛋白質(zhì)總量的1/2。由此可見,肥大細胞表面存在PAR2受體,而屋塵螨可以通過與PAR2的作用參與疾病的發(fā)生,因此我們推測,屋塵螨可以通過活化肥大細胞表面的PAR2受體進一步引起類胰蛋白酶的釋放,從而導(dǎo)致瘙癢的發(fā)生。有效地阻斷這一環(huán)節(jié)可能是治療慢性瘙癢尤其是對抗組胺藥效果不佳的瘙癢的潛在靶點,因此我們針對屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號通路-肥大細胞-類胰蛋白酶途徑進行研究,以期闡明這一途徑的分子機制。

    本實驗研究通過流式細胞檢測法證實HMC-1細胞表面PAR2受體的存在。屋塵螨變應(yīng)原Derp1單獨作用于HMC-1細胞可明顯引起HMC-1細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶,其水平明顯高于PAR2活化劑、PAR2對照肽及正常對照,表明屋塵螨變應(yīng)原Derp1是人肥大細胞HMC-1活化的重要刺激物。而將屋塵螨變應(yīng)原Derp1與PAR2拮抗劑FSLLRY共同作用于HMC-1細胞時,可部分抑制HMC-1細胞脫顆粒引起的類胰蛋白酶的釋放。PAR2激活的一個重要特征在于誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣流釋放,本研究通過檢測HMC-1細胞內(nèi)鈣熒光強度的變化,發(fā)現(xiàn)Derp1及類胰蛋白酶可明顯引起HMC-1細胞內(nèi)鈣流釋放,這一作用可部分被PAR2拮抗劑FSLLRY所拮抗。因此,我們認為屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過激活人肥大細胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶,但這并不是唯一途徑。

    慢性瘙癢性皮膚病的治療一直是臨床的難題,由于其發(fā)生機制并未完全明確,因此蛋白酶抑制劑、PAR2拮抗劑等理論上可以抑制瘙癢的藥物均尚未應(yīng)用于臨床治療,對其的研究多僅停留在動物實驗階段。對于我們課題中這些問題的解答將有助于明確慢性瘙癢的新靶點,也有助于明確屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號通路-肥大細胞-類胰蛋白酶這一途徑在慢性瘙癢中所發(fā)揮的作用及其分子機制,從而為臨床新的治療提供切實的理論基礎(chǔ),為真正解決臨床實際問題提供幫助。

    參考文獻

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