生產(chǎn)過(guò)程清潔驗(yàn)證殘留物阿哌沙班的HPLC法測(cè)定

張璇+于慶華+王自遠(yuǎn)+金壘

摘 要 目的：建立清潔驗(yàn)證中殘留物阿哌沙班含量測(cè)定的高效液相色譜法。方法：色譜柱為Waters Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果：阿哌沙班在0.01～20 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r2=0.999 2；回收率為75.90%，RSD=2.33%（n=18）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于清潔驗(yàn)證殘留物阿哌沙班的定量分析。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 清潔驗(yàn)證 殘留物 阿哌沙班

中圖分類(lèi)號(hào)：R973.2； O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2016）09-0076-03

Determination of apixaban residues in cleaning validation by HPLC

ZHANG Xuan*， YU Qinghua， WANG Ziyuan， JIN Lei

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of apixaban residues in the cleaning validation by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Waters Nova-Pak C18 column（3.9 mm×150 mm， 5 μm）with acetonitrilewater （30∶70） as the mobile phase at the detection wavelength of 280 nm and the flow velocity of 1.0 ml/min and the column temperature of 30 ℃ with sample size of 10 μl. Results： The standard curve of apixaban showed a good linear relationship in the range of 0.01 to 20 μg/ml with the correlation coefficient （r2） of 0.999 2. The average recovery of samples was 75.90% with RSD of 2.33% （n=18）. Conclusion： This method is convenient and accurate and suitable for the quantitative determination of apixaban residues in the cleaning validation.

KEY WORDS HPLC； cleaning validation； residue； apixaban

作為Xa因子抑制劑的阿哌沙班是一種用于預(yù)防和治療血栓的新型口服抗凝藥物[1]，其制劑阿哌沙班片是我們公司研發(fā)中心研制的新藥，在上海浦東基地與其他產(chǎn)品共線(xiàn)生產(chǎn)。為確保該產(chǎn)品與其他產(chǎn)品在生產(chǎn)中不造成交叉污染、降低阿哌沙班片的生產(chǎn)對(duì)其他產(chǎn)品造成的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，本研究參考GMP驗(yàn)證要求確定了阿哌沙班片清潔驗(yàn)證設(shè)備殘留限度（86 μg/25 cm2）后[2-3]，參考藥典要求[4]、根據(jù)活性物阿哌沙班的結(jié)構(gòu)特征和HPLC測(cè)定特點(diǎn)建立了阿哌沙班的殘留物HPLC分析方法，通過(guò)對(duì)阿哌沙班片生產(chǎn)用設(shè)備清潔驗(yàn)證的檢驗(yàn)，確定該方法可以用于阿哌沙班片在生產(chǎn)過(guò)程清潔驗(yàn)證中的殘留物檢測(cè)，保證清潔驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，并對(duì)每個(gè)驗(yàn)證參數(shù)設(shè)立可接受標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明高效液相色譜法（HPLC）簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可在清潔驗(yàn)證中用于阿哌沙班殘留物的定量分析。

1 試驗(yàn)儀器與試驗(yàn)樣品

高效液相色譜儀LC20AD（日本島津公司），電子天平（瑞士Mettler XS205），阿哌沙班對(duì)照品（批號(hào)：1403008，含量：99.47%，上海現(xiàn)代制藥股份有限公司），乙醇（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（HPLC純，默克公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取阿哌沙班對(duì)照品約50 mg，置于50 ml量瓶中用乙醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1.0 ml置于100 ml量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為對(duì)照品溶液（10μg/ml）。用鑷子夾取醫(yī)用脫脂棉兩小團(tuán)，用乙醇潤(rùn)濕后放入10 ml具塞試管中，加入10 ml乙醇，超聲15 min，放置20 min，期間不時(shí)振搖，取上清液作為空白醫(yī)用脫脂棉浸出液。按色譜條件分別對(duì)阿哌沙班對(duì)照品溶液、空白乙醇和空白醫(yī)用脫脂棉浸出液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明乙醇空白和空白醫(yī)用脫脂棉浸出液的各雜質(zhì)出峰時(shí)間對(duì)檢驗(yàn)標(biāo)的物阿哌沙班的出峰不造成干擾（圖1）。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)

取阿哌沙班對(duì)照品和乙醇分別制備成對(duì)照品溶液線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)溶液（0.01、0.1、0.5、1、10和20 μg/ml），各濃度溶液分別進(jìn)樣2次，每次10 μl，得各色譜圖。統(tǒng)計(jì)出阿哌沙班峰面積線(xiàn)性關(guān)系，建立校正曲線(xiàn)。

以阿哌沙班測(cè)得的平均峰面積X為橫坐標(biāo)，以線(xiàn)性溶液溶度Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為：Y=5.0×10-6X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2；結(jié)果表明該方法在0.01～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4 檢測(cè)限和定量限

采用信噪比法，取線(xiàn)性研究中合適濃度的溶液逐步稀釋得已知低濃度溶液，以信噪比10∶1時(shí)的相應(yīng)濃度為進(jìn)樣量10 μl時(shí)的定量限；以信噪比3∶1時(shí)的相應(yīng)濃度為進(jìn)樣量10 μl時(shí)的檢出限。結(jié)果確定該法的檢出限為0.003 7 μg/ml，定量限為0.011 2 μg/ml。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)擦拭取樣限度“86 μg/25 cm2”計(jì)算可知供試品溶液的檢出限度應(yīng)為“8.6 μg/ml”，選擇與供試品溶液限度接近的“專(zhuān)屬性試驗(yàn)”中配制的對(duì)照品溶液（10 μg/ml）進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定，計(jì)算5次所得阿哌沙班峰面積的RSD值為0.16%（表1），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

在一塊面積為25 cm×25 cm的平整光潔的不銹鋼板上用鋼錐每隔5 cm劃線(xiàn)，形成25塊5 cm×5 cm的正方塊。精密量取“專(zhuān)屬性試驗(yàn)”中配制的對(duì)照品濃溶液（1 mg/ml）0.1 ml均勻地滴加在不銹鋼板中間的1個(gè)5 cm×5 cm的正方塊上，讓稀釋液自然揮發(fā)。用鑷子夾取一小團(tuán)脫脂棉花，先用乙醇潤(rùn)濕，并將其靠在溶劑瓶上以除去多余的水。將棉團(tuán)平穩(wěn)而緩慢地從水平方向擦拭整個(gè)取樣表面（面積為5 cm×5 cm）。然后，翻轉(zhuǎn)棉團(tuán)，讓其從垂直方向也進(jìn)行擦拭取樣（圖2）。擦拭好的棉團(tuán)立即放入10 ml的具塞試管中，另取一新的用乙醇潤(rùn)濕的棉團(tuán)，將方塊中殘留的溶液擦拭干凈，放入同一支10 ml具塞試管中，加入10 ml乙醇，超聲15 min，放置20 min，期間不時(shí)振搖。

一個(gè)取樣人員平行擦拭三組，每組擦拭六次。擦拭結(jié)果如表2。計(jì)算三組平均回收率為75.90%，RSD為1.04%。

3 討論

設(shè)備清潔驗(yàn)證是制藥企業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品過(guò)程中避免共線(xiàn)產(chǎn)品交叉污染、保證產(chǎn)品質(zhì)量、確?；颊哂盟幇踩闹匾侄沃?。清潔驗(yàn)證中，確保清潔效果、影響驗(yàn)證結(jié)果的因素眾多，如清潔驗(yàn)證范圍、產(chǎn)品評(píng)估、設(shè)備評(píng)估、標(biāo)記物的選擇和評(píng)估、清洗程序的選擇和評(píng)估、檢驗(yàn)方法的選擇和評(píng)估等等[5-6]，而其中，檢驗(yàn)方法是通過(guò)分析方法的驗(yàn)證來(lái)保證分析結(jié)果的真實(shí)可靠的[7]，進(jìn)而確保整個(gè)清潔驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確可靠的。

文中試驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定清潔驗(yàn)證中的殘留物阿哌沙班的含量方法專(zhuān)屬性試驗(yàn)、線(xiàn)性關(guān)系、重復(fù)性、回收率均符合相應(yīng)要求，定量限、檢出限足以滿(mǎn)足殘留限度檢驗(yàn)要求，該方法可用于阿哌沙班片相關(guān)設(shè)備清潔驗(yàn)證中活性成分阿哌沙班的定量分析。在清潔驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)采用乙醇作為溶劑、醫(yī)用脫脂棉蘸取乙醇后擦拭取樣；測(cè)定限值為“阿哌沙班殘留量限值×回收率”，按最嚴(yán)格要求取回收率為各組平均回收率的最小值，故測(cè)定限值為“65 μg/25 cm2”。

在清潔驗(yàn)證中，設(shè)備取樣回收率實(shí)驗(yàn)容易被忽略，使用擦拭法取樣時(shí)，由于設(shè)備材質(zhì)不同，設(shè)備表面的平滑程度不同以及擦拭力度的差異，對(duì)采用結(jié)果會(huì)有不同程度的影響[8]，故在設(shè)備材質(zhì)確定的情況下，應(yīng)由方法驗(yàn)證進(jìn)行回收率試驗(yàn)時(shí)的取樣人員、采用同等力度進(jìn)行擦拭取樣，如需更換取樣人員應(yīng)重新進(jìn)行相應(yīng)方法擦拭回收率試驗(yàn)。同時(shí)，在日常清潔中，對(duì)員工的培訓(xùn)與管理、確保清潔過(guò)程按照驗(yàn)證程序進(jìn)行，也是保證設(shè)備清潔維持在驗(yàn)證狀態(tài)、清潔驗(yàn)證結(jié)果對(duì)生產(chǎn)清潔過(guò)程有指導(dǎo)性意義的前提[9-10]。

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