IL-29對(duì)胰蛋白酶誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用①

隋 麗 陳 冬 張慧云 何韶衡 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，錦州 121001)

IL-29對(duì)胰蛋白酶誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用①

隋 麗 陳 冬 張慧云②何韶衡③(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，錦州 121001)

目的:檢測(cè)白細(xì)胞介素29(Interleukin-29，IL-29)對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞蛋白酶激活受體(Protease activated receptor，PAR)-1，2，3，4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法:P815肥大細(xì)胞培養(yǎng)后，用不同濃度的IL-29、胰蛋白酶單獨(dú)或聯(lián)合激發(fā)肥大細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集激發(fā)細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)P815肥大細(xì)胞蛋白酶激活受體的表達(dá)。結(jié)果:IL-29單獨(dú)作用能夠下調(diào)肥大細(xì)胞PAR-1蛋白及mRNA水平的表達(dá)，上調(diào)PAR-3、PAR-4 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);以IL-29預(yù)處理肥大細(xì)胞后，IL-29對(duì)胰蛋白酶誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞PAR-2、PAR-3、PAR-4表達(dá)起促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:IL-29能夠調(diào)節(jié)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)，從而參與肥大細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

肥大細(xì)胞;白細(xì)胞介素29(IL-29);胰蛋白酶;蛋白酶激活受體(PARs);流式細(xì)胞術(shù)

隨著過(guò)敏性疾病呈明顯上升趨勢(shì)，近幾年有關(guān)過(guò)敏反應(yīng)領(lǐng)域的研究也進(jìn)展迅速，而肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)被認(rèn)為是過(guò)敏性炎癥過(guò)程中主要細(xì)胞反應(yīng)之一，其作為初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞參與過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制，肥大細(xì)胞一旦被過(guò)敏原激活后即釋放細(xì)胞內(nèi)預(yù)先形成的及新合成的介質(zhì)而發(fā)揮其生物學(xué)作用，但其確切機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

IL-29是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，又稱(chēng)為干擾素 λ1(Interferon λ1，IFNλ1)，主要在上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中表達(dá)，不同起源的造血和非造血細(xì)胞被各種病毒感染后，可誘導(dǎo)表達(dá)IL-29，新近的研究發(fā)現(xiàn)大部分人的肥大細(xì)胞表達(dá)IL-29，并且蛋白水解性變應(yīng)原能刺激肥大細(xì)胞釋放大量的IL-29，在過(guò)敏性哮喘患者外周血漿中存在高水平的IL-29[1-4]，因此，血漿中高水平的IL-29很可能來(lái)源于肥大細(xì)胞，而肥大細(xì)胞是參與過(guò)敏反應(yīng)的核心細(xì)胞，IL-29可能是過(guò)敏反應(yīng)中的重要促炎性細(xì)胞因子。蛋白酶激活受體(Protease activated receptors，PARs)是G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPCRs)家族中的新成員，目前在人和小鼠體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)4種PARs的存在，即 PAR-1、2、3、4，胰蛋白酶作為 PARs激活酶，通過(guò)PARs相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞組胺釋放[5]，在過(guò)敏性炎癥中發(fā)揮重要作用。因此我們擬通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及實(shí)時(shí)定量PCR研究IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)的調(diào)節(jié)，期待為與肥大細(xì)胞相關(guān)的過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 青鏈霉素、多聚甲醛、牛血清白蛋白均購(gòu)于Sigma公司，含25 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸的培養(yǎng)基、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，重組人 IL-29、小鼠抗人IL-29單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)R＆D公司，胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)于Promega公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠PAR-1單克隆抗體、羊抗鼠 PAR-2單克隆抗體、兔抗鼠PAR-3多克隆抗體、兔抗鼠PAR-4多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。PCR引物由Invitrogen公司合成，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑及試劑盒由TaKaRa公司提供。

1.1.2 主要儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于Expender公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于Heraeus公司，生物安全柜HFsafe1200購(gòu)于Heal Force公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于Becton Dickinson公司。紫外分光光度計(jì)及電泳儀購(gòu)于Bio-Rad公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于M J Research公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自SYNGENE公司，型熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于ABI-PE公司。

1.1.3 細(xì)胞株 小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、激發(fā) 肥大細(xì)胞的培養(yǎng)按參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。1.2×106個(gè)/ml的 P815肥大細(xì)胞采用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，分別用 IL-29(0.1、1、10、100 ng/ml)及 trypsin (0.001、0.01、0.1、1 μg/ml)單獨(dú)或聯(lián)合處理 P815肥大細(xì)胞，于2、6、16 h后終止反應(yīng)，于4℃條件下450 r/min離心10 min，收集并用PBS重懸細(xì)胞后，待流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及實(shí)時(shí)定量PCR分析。

1.2.2 肥大細(xì)胞 PAR-1、2、3、4表達(dá)的檢測(cè) 上述激發(fā)后的肥大細(xì)胞經(jīng)20 g/L的多聚甲醛固定30 min后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌、重懸細(xì)胞。PAR-1、PAR-3及PAR-4的標(biāo)記:加兔抗鼠PAR-1單克隆抗體或兔抗鼠PAR-3、PAR-4多克隆抗體及同型對(duì)照2 mg/L，37℃孵育1 h后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌2次后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體1 mg/L，37℃孵育 1 h。PAR-2的標(biāo)記:加FITC標(biāo)記的羊抗鼠PAR-2單克隆抗體以及同型對(duì)照4 mg/L，37℃孵育1 h后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌2次，PBS重懸細(xì)胞，與相應(yīng)的二抗孵育后，以FCM檢測(cè)肥大細(xì)胞PARs的表達(dá)情況。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-RTPCR) 激發(fā)后的P815肥大細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR按參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。PARs及β-actin內(nèi)參引物序列詳見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-29對(duì)肥大細(xì)胞PARs蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用濃度為0.1、1、10、100 ng/ml的 IL-29 單獨(dú)作用于肥大細(xì)胞2、6、16 h后，F(xiàn)CM結(jié)果顯示:肥大細(xì)胞PAR-1平均熒光強(qiáng)度下降幅度分別達(dá)39%、45%、31%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PAR-2、PAR-3、PAR-4平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;應(yīng)用1.0 μg/ml的IL-29單克隆抗體封閉 IL-29 后，PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖 1)。

2.2 IL-29對(duì)肥大細(xì)胞PARs mRNA的調(diào)節(jié)作用濃度為0.1、1、10、100 ng/ml的 IL-29 單獨(dú)作用于肥大細(xì)胞2、6、16 h后，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:IL-29呈濃度依賴(lài)性下調(diào)肥大細(xì)胞PAR-1 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在作用16 h時(shí)下調(diào)強(qiáng)度最大達(dá)79.4%;IL-29對(duì)肥大細(xì)胞PAR-2 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IL-29對(duì)肥大細(xì)胞 PAR-3、PAR-4 mRNA的表達(dá)起促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在6 h及16 h時(shí)作用最強(qiáng)，分別達(dá)9.5 倍，11.2 倍(圖2)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列Tab.1 Primer sequences for mouse PARs used in real time PCR

2.3 IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PARs蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) 用0.1 ng/ml的IL-29預(yù)處理肥大60 min 后，用 0.001、0.01、0.1 和 1 μg/ml的胰蛋白酶激發(fā)細(xì)胞16 h，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果顯示:IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PAR-1平均熒光強(qiáng)度表達(dá)與基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)照組、單純IL-29作用組、單純trypsin作用組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，PAR-2、PAR-3、PAR-4 平均熒光強(qiáng)度分別增強(qiáng) 2.1、1.6、1.8倍，與基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)照組、單純IL-29作用組、單純trypsin作用組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IL-29對(duì)胰蛋白酶作用的肥大細(xì)胞表面PARs表達(dá)的促進(jìn)作用與胰蛋白酶的濃度無(wú)關(guān)(圖3)。

圖1 IL-29 對(duì) P815 肥大細(xì)胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.1 Effect of IL-29 on expression of protease activated receptor(PAR)-1，PAR-2，PAR-3，PAR-4 protein on P815 cells

圖2 IL-29 對(duì) P815 肥大細(xì)胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.2 Effect of IL-29 on expression of protease activated receptor(PAR)-1，PAR-2，PAR-3，PAR-4 mRNAs on P815 cells

圖3 IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Effect of IL-29 on trypsin-induced expression of protease activated receptor PAR-1，PAR-2，PAR-3 and PAR-4 on P815 cells

3 討論

PARs為絲氨酸蛋白酶受體，目前共發(fā)現(xiàn)4種PARs的存在，即 PAR-1、2、3、4。其中 PAR-1 是胰蛋白酶和凝血酶受體[8]，本研究發(fā)現(xiàn)IL-29單獨(dú)作用時(shí)能夠下調(diào)肥大細(xì)胞PAR-1蛋白及mRNA的表達(dá)，而胰蛋白酶和凝血酶已經(jīng)被證實(shí)積極參與炎癥過(guò)程[9-10]，由此可以推測(cè)IL-29也可能通過(guò)下調(diào)肥大細(xì)胞PAR-1表達(dá)來(lái)參與和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過(guò)程，相關(guān)的其他細(xì)胞因子對(duì)PAR-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的研究發(fā)現(xiàn)[11]支持本研究結(jié)果;PAR-2是胰蛋白酶、類(lèi)胰蛋白酶和彈性蛋白酶受體，PAR-3和PAR-4是凝血酶受體[8，12]，PAR-2 已經(jīng)證實(shí)在過(guò)敏性疾病中具有正性調(diào)節(jié)作用，例如PAR-2在哮喘及過(guò)敏性鼻炎患者氣道的表達(dá)增強(qiáng)[13，14]，PAR-2 能夠促進(jìn)德國(guó)小鐮過(guò)敏患者的呼吸道中Th2及Th17類(lèi)細(xì)胞因子的釋放等[15]，在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) IL-29對(duì)肥大細(xì)胞 PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白的表達(dá)幾乎均沒(méi)有作用，但在mRNA水平，能夠增強(qiáng)肥大細(xì)胞PAR-3、PAR-4的表達(dá)，IL-29 對(duì)肥大細(xì)胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4表達(dá)調(diào)節(jié)作用的不同可能與細(xì)胞內(nèi)池募集不同類(lèi)型PARs的動(dòng)員及釋放情況不同有關(guān)[16]，此外，也可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的改變有關(guān)[17]。

本研究中發(fā)現(xiàn)IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PAR-1表達(dá)幾乎沒(méi)有作用，對(duì) PAR-2、PAR-3、PAR-4表達(dá)起促進(jìn)作用，說(shuō)明胰蛋白酶對(duì)IL-29引起的PAR-1下調(diào)有抑制作用，同時(shí)與IL-29協(xié)同誘導(dǎo)PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白的表達(dá)，這可能提示肥大細(xì)胞活化過(guò)程中存在一種放大機(jī)制:IL-29存在于未激活的肥大細(xì)胞中[3]，過(guò)敏原能夠誘導(dǎo)肥大細(xì)胞聚集和激活，激活后的肥大細(xì)胞能夠分泌胰蛋白酶和IL-29，分泌的IL-29不但募集肥大細(xì)胞向炎癥部位聚集，還能夠使鄰近的肥大細(xì)胞在胰蛋白酶的作用下表達(dá)更多的PARs，而肥大細(xì)胞PARs的過(guò)量表達(dá)使之更容易與蛋白酶作用，從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化。IL-29通過(guò)激活肥大細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt和JAK/ STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放Th2類(lèi)細(xì)胞因子如IL-4、IL-13等，這些Th2細(xì)胞因子進(jìn)一步作用于其他炎癥細(xì)胞而使過(guò)敏性炎癥反應(yīng)放大[18]。CD18及細(xì)胞間黏附分子-1可能參與IL-29誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞募集[3]，但因肥大細(xì)胞黏附及遷移機(jī)制并不清楚，IL-29對(duì)肥大細(xì)胞募集作用的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。之前的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的趨化因子CCL5能夠增強(qiáng)胰蛋白酶誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞PAR-1、PAR-2和PAR-4表達(dá)，類(lèi)胰蛋白酶誘導(dǎo)的PAR-2的表達(dá)和凝血酶誘導(dǎo)的PAR-1和PAR-4也支持上述觀點(diǎn)[19]。肥大細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子具有增敏作用，如IL-29對(duì)肥大細(xì)胞PARs表達(dá)的調(diào)節(jié)并且促進(jìn)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，這些都有助于過(guò)敏性炎癥的發(fā)展。而IL-29對(duì)胰蛋白酶作用的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)的促進(jìn)作用與胰蛋白酶濃度無(wú)關(guān)，這可能與胰蛋白酶的含量達(dá)到閾值有關(guān)。

綜上，IL-29能夠選擇性地下調(diào)肥大細(xì)胞PAR-1蛋白及mRNA水平的表達(dá)，增強(qiáng)PAR-3、PAR-4 mRNA水平的表達(dá)，也能夠通過(guò)促進(jìn)胰蛋白酶引起肥大細(xì)胞PAR-2、PAR-3、PAR-4表達(dá)參與過(guò)敏性炎癥反應(yīng)，但多種理化刺激、病理過(guò)程能調(diào)節(jié)PARs的表達(dá)情況[20]，且轉(zhuǎn)錄翻譯、膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)和溶酶體降解都與PARs表達(dá)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，所以仍期待深入探究各種因素包括IL-29對(duì)胰蛋白酶引起的肥大細(xì)胞PARs表達(dá)調(diào)節(jié)的確切機(jī)制。

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[收稿2013-12-07 修回2014-01-13]
(編輯 張曉舟)

Effect of IL-29 on trypsin-induced protease-activated receptor expression on P815 mast cells

SUI Li，CHEN Dong，ZHANG Hui-Yun，HE Shao-Heng.Department of ENT，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China

Objective:To investigate the modulatory effect of IL-29 on trypsin-induced protease activated receptors(PARs)expression on P815 mast cell.MethodsAfter P815 mast cells were challenged with different concentrations of IL-29 alone or combined with trypsin for 2 h，6 h and 16 h，the challenged cells were collected and analysed by flow cytometry to detect the protein expression of PARs on P815 cells，and analysed by real time RT-PCR to detect the mRNA expression of PARs on P815 cells.ResultsCompared with the corresponding control，IL-29 induced significantly decreased expression of PAR-1 at protein and mRNA level on P815 cells，and upregulated PAR-3，PAR-4 mRNA level on P815 cells，whereas IL-29 did little effect on the expressions of PAR-2，3，4 at protein level on P815 cells accordingly.Preincubation of mast cell with IL-29 did not alter trypsin-induced PAR-1 expression on P815 cells，whereas up-regulated expression of PAR-2，3，4 were detected when P815 cell were pre-treated with IL-29 before being challenged with trypsin compared with the corresponding control.ConclusionIL-29 can upregulate trypsin-induced PARs expression on mast cells through which participated in mast cell related inflammation.

Mast cell;Interleukin-29(IL-29);Trypsin;Protease activated receptors(PARs);Flow cytometry

R329.8

A

1000-484X(2014)05-0609-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.008

①本文為 國(guó) 家 自 然 科 學(xué)基 金 (81241135，81060250，81172836，

81030054)和遼寧省博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(20101063)。②海南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，?？?71101。

③遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，錦州121001。

隋 麗(1981年-)，女，主要從事過(guò)敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制的研究，E-mail:suili1018@163.com。

及指導(dǎo)教師:陳 冬(1972年-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事過(guò)敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制的研究，E-mail:entdoctorchen@163.com。