紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?；?表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究①

李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 （廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，南寧 530021）

紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?；?表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究①

李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 （廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，南寧 530021）

目的:探討紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?；?（HDAC3）表達(dá)的影響。方法:體外培養(yǎng)人類(lèi)單核細(xì)胞系U937細(xì)胞，用佛波脂（PMA）將其誘導(dǎo)分化為人巨噬細(xì)胞。按傳統(tǒng)方法制備好香煙煙霧提取物（CSE）用于實(shí)驗(yàn)。將傳代后的細(xì)胞分組:對(duì)照組、CSE組、紅霉素+CSE組、HDAC特異性抑制劑曲古霉素（TSA）組。采用比色法檢測(cè)細(xì)胞HDAC總活性;Western blot檢測(cè)HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá);通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度。結(jié)果:1%CSE刺激人巨噬細(xì)胞引起細(xì)胞HDAC總活性減弱和HDAC3蛋白表達(dá)下降，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增高，釋放TNF-α;紅霉素（1μg/m l）預(yù)孵育24 h可以增強(qiáng)CSE抑制的巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)，抑制TNF-α的合成和釋放。結(jié)論:紅霉素通過(guò)上調(diào)HDAC3蛋白表達(dá)水平而抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性，進(jìn)而影響炎癥介質(zhì)TNF-α的合成調(diào)控。

紅霉素;組蛋白去乙酰化酶3;香煙煙霧

現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)支持大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素）作為免疫調(diào)節(jié)劑治療方案在慢性肺部疾病，包括彌漫性泛細(xì)支氣管炎、肺囊性纖維化、支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等的應(yīng)用［1-3］。近期一些研究表明［4，5］，長(zhǎng)期小劑量應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)治療 COPD 取得了較好的效果。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紅霉素可以抑制支氣管上皮細(xì)胞IL-8、細(xì)胞間黏附因子（ICAM-1）的合成和釋放，與抑制轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB、激活蛋白-1（AP-1）活性有關(guān)［6］，但有關(guān)紅霉素抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑目前尚不清楚，因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中探討紅霉素抵抗香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 佛波脂（PMA）:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;甲天下牌香煙（焦油:15 mg，煙堿:1.1 mg）:廣西南寧卷煙廠;紅霉素:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;IL-8酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒:美國(guó)RD公司產(chǎn)品;DIG凝膠遷移率試劑盒:瑞士Roche公司產(chǎn)品;核蛋白提取試劑盒:美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒:美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;HDAC活性測(cè)定試劑盒:美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品;HDAC3多克隆抗體:美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品。人類(lèi)單核細(xì)胞系細(xì)胞株（U937細(xì)胞）從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 分組 將傳代后的人巨噬細(xì)胞分組:①對(duì)照組;②CSE組（加入1%CSE孵育24 h）;③紅霉素+CSE組（1μg/ml紅霉素預(yù)孵育24 h后，加入1%CSE繼續(xù)孵育24 h）;④HDAC特異性抑制劑曲古霉素（TSA）組（加入TSA 100 ng/ml孵育24 h）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在5%CO2，37℃，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每周傳代約2次。

1.3.2 應(yīng)用佛波脂將U937單核細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞［7］①將 U937單核細(xì)胞重懸，離心（800～1 000 r/min，30～60 s），棄上清液。②加入新的培養(yǎng)基，重懸，計(jì)數(shù)。③將細(xì)胞均勻地接種到6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為0.5×107～1×107個(gè)細(xì)胞。④加入佛波脂（10 ng/ml）誘導(dǎo)24 h。⑤24 h后，細(xì)胞貼壁，并可見(jiàn)細(xì)胞伸出偽足，提示單核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，丟棄上清液，加入新的培養(yǎng)基。

1.3.3 香煙煙霧提取物（CSE）的制作 ①參照以往CSE的制作方法及Se-Ran的香煙煙霧提取物的改良制作方法［8-10］，將2支去過(guò)濾嘴香煙（甲天下牌香煙，長(zhǎng)度84 mm，焦油含量:15 mg，煙堿含量:1.1 mg）燃燒完全后所產(chǎn)生的香煙煙霧由注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸，將煙霧緩慢通入20 m l無(wú)血清的培養(yǎng)基中，制成懸液，密封瓶?jī)?nèi)，搖動(dòng)使其充分溶解，得到10%濃度的CSE溶液，其濃度計(jì)算為煤焦油含量1 500 mg/L和煙堿含量110 mg/L。②將溶液的pH值調(diào)至7.4。③用0.22μm濾膜過(guò)濾溶液。④溶液于1 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，稀釋到需要的濃度后加入細(xì)胞。

1.3.4 TNF-α檢測(cè) 按照ELISA試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 HDAC總活性測(cè)定 ①核蛋白提取，收集:按照核蛋白提取試劑盒（Pierce公司）說(shuō)明進(jìn)行。②核蛋白濃度檢測(cè):按照Pierce公司BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。③HDAC活性測(cè)定:按照試劑盒（Santa Crus公司）實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)水平測(cè)定 應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)。4℃ 0.01 mol/L PBS單洗細(xì)胞3次，加300μl蛋白裂解液，裂解產(chǎn)物在冰上繼續(xù)裂解30 min后4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清測(cè)蛋白濃度及調(diào)整蛋白濃度，至3μg/μl，SDS-PAGE蛋白緩沖液按照比例混合，煮沸5min，立即放入冰箱，4℃、12 000 r/min離心 10 min，取上清，分裝，放 -20℃?zhèn)溆?。制?0%SDS-PAGE膠，4℃保存過(guò)夜，恢復(fù)至室溫使用，上樣進(jìn)行垂直電泳，用10%SDSPAGE膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，用TBST溶液平衡5 min，再與相應(yīng)一抗（1∶1 000）在4℃共搖床孵育過(guò)夜，PVDF膜用TBST洗4次，每次5 min，加相應(yīng)二抗（1∶5 000）在室溫共搖床孵育1 h，再用TBST洗4次，每次5 min。在暗房?jī)?nèi)用發(fā)光劑發(fā)光，顯影，定影，分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用x-±s表示，兩組間比較采用成組計(jì)量資料t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析（ANOVA分析），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSE刺激對(duì)人巨噬細(xì)胞HDAC總活性的影響與對(duì)照組比較，CSE可以明顯抑制HDAC總活性（P＜0.05），紅霉素預(yù)孵育24 h稍減輕 CSE對(duì)HDAC總活性的抑制作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。作為陰性對(duì)照組，HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC總活性被抑制（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，CSE可以明顯抑制HDAC3蛋白表達(dá)，紅霉素預(yù)孵育24 h能明顯減輕CSE對(duì)HDAC1蛋白表達(dá)的抑制作用。作為陰性對(duì)照組，HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC3表達(dá)明顯被抑制（P＜0.05），見(jiàn)圖2A、B。

2.3 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響及HDAC特異性抑制劑TSA對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，CSE可以明顯增強(qiáng)NF-κB的蛋白表達(dá)，紅霉素預(yù)孵育24 h可抑制CSE對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的上調(diào)作用;同時(shí)，HDAC特異性抑制劑TSA可以增強(qiáng) NF-κB的蛋白表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、B。

圖2 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effect of EM on CSE-induced HDAC3 protein expression in human macrophages

圖3 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞NF-КB蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effects of EM on CSE-induced NF-κB protein expression in human macrophages

圖1 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC總活性的影響Fig.1 Effect of EM on CSE-induced change in histone deacetylase（HDAC）activity in human macrophages

圖4 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的影響Fig.4 Effect of EM on CSE-induced TNF-α protein release in human macrophages

2.4 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的影響 與對(duì)照組比較，CSE組細(xì)胞上清中的TNF-α含量明顯增高（P＜0.05），紅霉素預(yù)孵育24 h能明顯抑制 CSE對(duì)細(xì)胞 TNF-α的上調(diào)作用（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

3 討論

組蛋白乙?；福℉AT）和組蛋白去乙?；福℉DAC）是調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶，因此影響炎癥基因的表達(dá)［11，12］。具有內(nèi)源性組蛋白乙?；富钚缘暮诵慕M蛋白的乙?；瘜?dǎo)致染色質(zhì)解旋致轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II結(jié)合到DNA上，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)的組蛋白的乙酰化可以加強(qiáng)炎癥基因的表達(dá)。核心組蛋白的去乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)［11，13］。HDACs可以抑制組蛋白的乙酰化，HDAC從組蛋白賴(lài)氨酸殘基上轉(zhuǎn)移乙?；?，致DNA纏繞、阻礙了基本轉(zhuǎn)錄單位蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。HDACs在抑制基因表達(dá)以及抑制核心組蛋白的過(guò)度乙?；矫嫫鹬匾饔茫?4］。HDACs家族包含四個(gè)組 18 亞型［15］。I型（HDAC1，2，3，8，11）已被證明在調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中起重要作用，HDAC3是HDACs中的一個(gè)重要亞型，可通過(guò)組蛋白去乙?；饔茫{(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)和炎癥基因的表達(dá)［15］。

最近有研究報(bào)道，香煙煙霧引起HDAC表達(dá)下降［10，16］，香煙煙霧降低 HDAC1，2，3 蛋白表達(dá)水平［10］，因此影響炎癥基因的表達(dá)［17］。在這項(xiàng)研究中，我們觀察到香煙煙霧引起人巨噬細(xì)胞HDAC總活性下降的同時(shí)，HDAC3蛋白表達(dá)明顯下降，提示HDAC3在香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制中起重要作用。本研究同時(shí)顯示，紅霉素明顯減輕香煙煙霧引起人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)下降，提示紅霉素能夠活化HDAC3，顯著增加HDAC3蛋白的表達(dá)含量，這提示為紅霉素具有對(duì)抗香煙煙霧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥的分子學(xué)作用機(jī)制之一;此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紅霉素可提高HDAC總活性，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)。

研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，香煙煙霧引起巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)下降的同時(shí)，誘導(dǎo)增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)，釋放TNF-α增多;HDAC特異性抑制劑TSA抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達(dá)的同時(shí)，促使 NF-κB蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示HDAC3調(diào)控NF-κB表達(dá)，香煙煙霧通過(guò)抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)增強(qiáng)NF-κB蛋白表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α，從而誘導(dǎo)炎癥。既往一些研究支持我們的結(jié)果，HDAC1，2，3通過(guò)直接或間接改變核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活性從而在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示紅霉素不僅可增加HDAC3蛋白表達(dá)，并且抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的 NF-кB活性，抑制TNF-α釋放，提示紅霉素通過(guò)增加HDAC3蛋白的表達(dá)含量，進(jìn)而抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的NF-κB活性和 TNF-α釋放，從而對(duì)抗香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥。

綜上所述，香煙煙霧引起炎癥介質(zhì)的釋放，與HDAC3的調(diào)控有關(guān)。紅霉素可抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的炎癥，主要與紅霉素活化HDAC3，進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)合成和釋放相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紅霉素治療與吸煙密切相關(guān)的氣道慢性炎癥性疾病如慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、吸煙的支氣管哮喘患者等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Rubin BK，Henke MO.Immunomodulatory activity and effectiveness ofmacrolides in chronic airway disease ［J］.Chest，2004，125（2）:70S-78S.

［2］ Parnham MJ.Immunomodulatory effects of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections［J］.Curr Opin Infect Dis，2005，18（2）:125-131.

［3］ Giamarellos-Bourboulis EJ.Macrolides beyond the conventional antimicrobials:a class of potent immunomodulators［J］.Int JAntimicrob Agents，2008，31（1）:12-20.

［4］ Seemungal TA，Wilkinson TM，Hurst JR，et al.Long-term erythromycin therapy is associated with decreased chronic obstructive pulmonary disease exacerbations［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178（11）:1139-1147.

［5］ Wilkinson TM，Donaldson GC，Hurst JR，etal.Early therapy improves outcomes of exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2004，169（12）:1298-1303.

［6］ 李梅華，鐘小寧，柳廣南，等.紅霉素抑制腫瘤壞死因子α對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞核因子-κB的激活［J］.中華內(nèi)科雜志，2005，44（7）:530-531.

［7］ Verhoeckx KC，Bijlsma S，de Groene EM，etal.A combination of proteomics，principal component analysis and transcriptomics is a powerful tool for the identification of biomarkers for macrophage maturation in the U937 cell line［J］.Proteomics，2004，4（4）:1014-1028.

［8］ Martey CA，Pollock SJ，Turner CK，etal.Cigarette smoke induces cyclooxygenase-2 and microsomal prostaglandin E2 synthase in human lung fibroblasts:implications for lung inflammation and cancer［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287（5）:L981-L991.

［9］ Moodie FM，Marwick JA，Anderson CS，et al.Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells［J］.FASEB J，2004，18（15）:1897-1899.

［10］ Yang SR，Chida AS，Bauter MR，et al.Cigarette smoke induces proinflammatory cytokine release by activation of NF-kappaB and posttranslationalmodifications of histone deacetylase inmacrophages［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2006，291（1）:L46-L57.

［11］ Urnov FD，Wolffe AP.Chromatin remodeling and transcriptional activation:the cast（in order of appearance）［J］.Oncogene，2001，20（24）:2991-3006.

［12］ Gilmour PS，Rahman I，Donaldson K，et al.Histone acetylation regulates epithelial IL-8 releasemediated by oxidative stress from environmental particles［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2003，284（3）:L533-L540.

［13］ Ito K，Ito M，Elliott WM，et al.Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2005，352（19）:1967-1976.

［14］ Barnes PJ.Reduced histone deacetylase in COPD:clinical implications［J］.Chest，2006，129（1）:151-155

［15］ de Ruijter AJ，van Gennip AH，Caron HN，et al.Histone deacetylases（HDACs）:characterization of the classical HDAC family［J］.Biochem J，2003，370（3）:737-749.

［16］ Rajendrasozhan S，Yao H，Rahman I.Current perspectives on role of chromatin modifications and deacetylases in lung inflammation in COPD［J］.COPD，2009，6（4）:291-297.

［17］ Barnes PJ，Ito K，Adcock IM.Corticosteroid resistance in chronic obstructive pulmonary disease:inactivation of histone deacetylase［J］.Lancet，2004，363（9410）:731-733.

［收稿2013-09-25 修回2014-01-08］

（編輯 許四平）

Effect of erythrom ycin on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3 protein expression in human macrophages

LIMei-Hua，ZHONGXiao-Ning，WENMing-Zhi，HEZhi-Yi，PENGXin-Yan.DepartmentofRespiratoryMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

Objective:To study the effect of erythromycin（EM）on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3（HDAC3）protein expression in human macrophages in vitro.Methods:The Aqueous cigarette smoke extract（CSE）was always prepared fresh on the day of the experiment.The U937 monocytic cellswere differentiated intomacrophages by using phorbol12-myristate 13-acetate（PMA）according to standard procedures.The U937 differentiated cells were treated with either CSE（1%）or EM（1 μg/ml）pretreatment，and HDAC inhibitor trichostatin A（TSA;100 ng/ml）for 24 h.HDAC activity wasmeasured with a colorimetric assay kit and Western blotwas used for HDAC3 and factor nuclear-kappaB（NF-κB）protein assays.The levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）release in the supernatantwere determined by enzyme linked immunosorbentassay（ELISA）.Results:CSE（1%）significantly decreased HDAC activity and HDAC 3 protein levels at24 h.Preincubation with EM（1μg/ml）for 24 h significantly inhibit CSE（1%）induced decrease of HDAC3 protein expression.Furthermore，Preincubation with EM（1 μg/ml）for 24 h significantly inhibit NF-κB activity and TNF-α release in humanmacrophages.Conclusion:EM is able to restore HDAC3 levels decreased by cigarette smoke and inhibit NF-κB activity resulting in decreasing CSE-mediated TNF-α release，which has shown an importantexplanation that EM possess the anti-inflammatory effect induced by cigarette smoke.

Erythromycin;histone deacetylase 3;Cigarette smoke

R965

A

1000-484X（2014）05-0600-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.006

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30760085）、國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81360012）及廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（No.Z2012076）。

李梅華（1975年-），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制及防治研究。

及指導(dǎo)教師:鐘小寧（1959年-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制及防治研究。